動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)常用方法

1、?動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)常用方法一. 細(xì)胞增殖周期（cell Proliferatinal cycle）概念細(xì)胞周期是描述細(xì)胞增殖和分化交替發(fā)生變化的概念。而細(xì)胞增殖周期主要 是從細(xì)胞增殖角度賦予細(xì)胞活動(dòng)的概念，兩者不應(yīng)混為一談。細(xì)胞增殖周期是指 細(xì)胞從一次分裂結(jié)束開(kāi)始生長(zhǎng)，到下一次分裂結(jié)束所經(jīng)歷的過(guò)程。根據(jù)細(xì)胞增殖 周期不同時(shí)期的生化特點(diǎn)，劃分為四個(gè)連續(xù)的時(shí)期，即G期（DNA合成前期），S期（DNA合成期），G期（DNA合成后期），M期（有絲分裂期）。如以G期為起點(diǎn)， 那么細(xì)胞增殖周期的各時(shí)期應(yīng)循著 G-S-GkM的順序進(jìn)行，G、S、G三期合稱為 細(xì)胞間期，此期完成細(xì)胞生長(zhǎng)過(guò)程。M期完成遺傳物質(zhì)的分配

2、。因此，細(xì)胞增殖周期=間期（G期+S期+G期）+分裂期（M期）。二. 培養(yǎng)細(xì)胞生命期（life span of culture cells）很多細(xì)胞特別是正常細(xì)胞，在體外的生存不是無(wú)限的，而是具有一個(gè)生命期。 索維培養(yǎng)細(xì)胞生命期，是指細(xì)胞在培養(yǎng)中持續(xù)增殖和生長(zhǎng)的時(shí)間。培養(yǎng)細(xì)胞的生命期與細(xì)胞的種類、性狀和原供體的年齡、健康等情況有關(guān)。人胚二倍體成纖維 細(xì)胞，在不凍存和反復(fù)傳代條件下，科傳3050代，相當(dāng)于150300個(gè)細(xì)胞增殖 周期，能維持1年左右的生存時(shí)間，最后衰老凋亡。如供體為成體或衰老個(gè)體， 則生存時(shí)間較短；其他細(xì)胞如肝細(xì)胞或腎細(xì)胞，生存時(shí)間更短，僅能傳幾代或十 幾代。只有當(dāng)細(xì)胞發(fā)生遺傳性

3、改變，如獲永生性或惡性轉(zhuǎn)化時(shí)，細(xì)胞的生存期才 可能發(fā)生改變。正常細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)，不論細(xì)胞的種類和供體的年齡如何， 在細(xì)胞生 命的全過(guò)程中，大致都經(jīng)歷以下三個(gè)階段：原代培養(yǎng)期、傳代期、衰退期。三. 培養(yǎng)細(xì)胞一代生存期初代細(xì)胞系.$I20-IIH轉(zhuǎn)代數(shù)16細(xì)14接-XX f1 r種次恃代間隔5k塩傳.Jftw養(yǎng)代0.U60.050,14L4：KHjRb0 20- + 0.(160.2l0.()612.21(0J511IM1 Ito1酚紅I1 :(11)2II 門O.I20.02卵,OU0 42KCI0 2niLOOKW SOO KWIrI1n 20 C) 40 IK40o jfl0 4/1十.消化液進(jìn)

4、行原代培養(yǎng)時(shí)常常需要用消化液將組織塊消化解離形成單細(xì)胞懸液，傳代培養(yǎng)時(shí)也需要用消化液將貼壁細(xì)胞從瓶壁上消化下來(lái)，常用的消化液有胰蛋白酶（Trypsin）溶液和二乙烯四乙酸二鈉（EDTA）溶液，有時(shí)也用膠原酶（collagenase） 溶液。（一） 胰蛋白酶溶液胰蛋由酶是從動(dòng)物胰臟分離的一種水解酶，其主要功能為使細(xì)胞間的蛋白質(zhì)水解和細(xì)胞分散。胰蛋白酶的活性可用消化酪蛋白的能力表示，常用的有1: 125 和1: 250,即一份胰酶可消化125或250份酪蛋白。胰蛋白酶分散細(xì)胞的能力 與細(xì)胞種類及細(xì)胞特性有關(guān)，適用于消化細(xì)胞間質(zhì)較少的軟組織，如胚胎、上皮、 肝、腎等組織。 對(duì)傳代培養(yǎng)細(xì)胞效果也很好。

5、 但對(duì)于纖維性組織和較硬的癌組織 效果差。不同種類的細(xì)胞以及不同數(shù)量的細(xì)胞采用胰蛋白酶消化的時(shí)間也不相 同。另外，胰蛋白酶濃度大、作用溫度高、時(shí)間長(zhǎng)時(shí)，對(duì)細(xì)胞分離能力也大，但 超過(guò)一定的限度會(huì)損傷細(xì)胞。 新配置的胰蛋白酶可使細(xì)胞分散速度增快。 細(xì)胞培 養(yǎng)用胰蛋白酶溶液一般配制成 0.25%0.125%的濃度，配制時(shí)要用不含 Ca2+、 Mg2+ 及血清的平衡鹽溶液（如前面的D-Hank S）,因?yàn)镃eT、Mg+是細(xì)胞膜的重要組成 成分，它們能促使細(xì)胞凝集， 有阻礙消化的作用； 血清會(huì)對(duì)胰蛋白酶產(chǎn)生抑制作 用。因此，也常用含血清的培養(yǎng)液終止胰蛋白酶的消化作用。 胰酶作用及溶解的 最佳PH是89,

6、配制胰酶溶液應(yīng)將液體調(diào)至 pH 8左右，充分溶解，過(guò)濾除菌。 過(guò)濾后可以再調(diào)至 PH 75，也可不調(diào)。（二） EDTA溶 液EDTA是一種化學(xué)螯合劑，能整合 CeT和Mg+，溶液毒性小，使用方便，也常 用來(lái)解離細(xì)胞。它的作用機(jī)制是，一些細(xì)胞尤其是上皮細(xì)胞在生長(zhǎng)過(guò)程中需 Ca2+ 和Mg，參與細(xì)胞的連接，維持組織的完整性，而 EDTA從細(xì)胞生存環(huán)境中奪取 Cf和Mg+，并與這些離子形成螯合物，從而使細(xì)胞分離。因此，對(duì)于一些貼壁 特別牢固的細(xì)胞，可以用EDTA和胰酶的混合液（1:1）進(jìn)行消化，提高消化率。注意：使用EDTA處理細(xì)胞后，一定要用Hank s液沖洗干凈，一是由于殘 留的EDTA可損傷線

7、粒體，它與核蛋白中的CeT和Mg*結(jié)合，破壞核蛋白結(jié)構(gòu)，且 細(xì)胞長(zhǎng)期處于無(wú)CeT的環(huán)境中，K濃度降低，細(xì)胞呼吸減弱，從而影響細(xì)胞生長(zhǎng)。 二是由于EDTA乍用不受血清抑制。另外，膠原酶的消化作用依賴于Cf，因此，EDTA不可與膠原酶聯(lián)用。十一 . 抗菌素溶液常用的是青鏈霉素， 俗稱“雙抗溶液”。青霉素主要是對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌有效， 鏈霉素豐主要對(duì)革蘭氏陰性菌有效。加入這兩種抗生素可預(yù)防絕大多數(shù)細(xì)菌污 染。配制時(shí)用10mL三蒸水溶解1.0 X 106卩g/瓶的硫酸鏈霉素，取8mL硫酸鏈霉 素液溶解8.0 X I05IU/瓶的青霉素粉，即成青、鏈霉素各 1.0 XlO5IU/mL的母 液。使用時(shí)，100

8、mL培養(yǎng)基內(nèi)加母液0.1mL，這樣培養(yǎng)基內(nèi)青、鏈霉素的最終濃 度為各 100IU/mL。有時(shí)為防止支原體和霉菌污染， 要用到卡那霉素液、 制霉菌素或兩性霉素 B。 卡那霉素的配法：將一瓶卡那霉素（5.0 X 104卩g/瓶）溶于5mLHank s液中，即 成1.0 X104卩g/mL母液。使用時(shí)每100mL培養(yǎng)基內(nèi)加0.5mL母液，最終使用濃 度為50卩g/mL。制霉菌素不能溶于水，故只能配成 5000IU/mL懸液。使用時(shí)每 100mL培養(yǎng)基內(nèi)加0.5mL母液，最終使用濃度為 25IU/mL。在實(shí)際工作中，選擇哪一種抗生素、劑量多少、何時(shí)加入等，與污染源、抗 菌素的抗菌范圍、 抗菌素的穩(wěn)定性

9、等有密切關(guān)系， 應(yīng)靈活運(yùn)用。 需要特別注意的 是，抗菌素液配制對(duì)要無(wú)菌操作、小量分裝、-20 C凍存。十二.細(xì)胞計(jì)數(shù)10000 倍。原代細(xì)胞制備時(shí).培養(yǎng)的細(xì)胞要求有一定的密度才能生長(zhǎng)良好，所以要進(jìn)行 細(xì)胞計(jì)數(shù)。計(jì)數(shù)結(jié)果以每毫升細(xì)胞數(shù)表示。細(xì)胞計(jì)數(shù)是細(xì)胞培養(yǎng)中一項(xiàng)基本技術(shù)， 是了解培養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)以及測(cè)定培養(yǎng)基、血清、藥物等物質(zhì)生物學(xué)作用的重要 手段。細(xì)胞計(jì)數(shù)主要利用血球計(jì)數(shù)板來(lái)完成。 血球計(jì)數(shù)板的每一大方格長(zhǎng)為1mm 寬為1mm高為0.1mm體積為0.1mm,可容納的溶液是0.1卩L,每ImL溶液中 所含細(xì)胞數(shù)即是視野中每一大方格數(shù)出的細(xì)胞數(shù)的nn牛U；iP *勺片OA,r,|E衛(wèi)na -*

10、-母血球計(jì)離板41式S（一）準(zhǔn)備計(jì)數(shù)板：用酒精清潔計(jì)數(shù)板和蓋玻片，然后用吸水紙輕輕擦干；（二）準(zhǔn)備細(xì)胞懸液：用0.25%夷蛋白酶消化單層細(xì)胞或收集懸浮培養(yǎng)細(xì)胞， 制成單個(gè)細(xì)胞懸液。要求細(xì)胞密度不低于 104個(gè)/mL，若細(xì)胞數(shù)很少，應(yīng)將懸液 離心（1000r/min ， 5min），重懸浮于DME培養(yǎng)基中；（三）加樣：將蓋玻片蓋在計(jì)數(shù)板兩槽中間。用微量移液器輕輕吹打細(xì)胞懸液，吸取少量細(xì)胞懸液，在計(jì)數(shù)板上蓋玻片一側(cè)邊沿加細(xì)胞懸液，加樣量不要溢出蓋玻片，也不要過(guò)少或帶氣泡。否則要將計(jì)數(shù)扳和蓋玻片擦干凈重新加樣。（四）計(jì)數(shù)：在顯微鏡下，用10X物鏡觀察計(jì)數(shù)板四角大方格中的細(xì)胞數(shù)。細(xì) 胞壓中線時(shí)，只計(jì)左

11、側(cè)和上方者，不計(jì)右側(cè)和下方者。十三.細(xì)胞傳代培養(yǎng)（一）細(xì)胞在培養(yǎng)過(guò)程中隨著數(shù)量的增長(zhǎng)，尤其細(xì)胞生長(zhǎng)十分旺盛時(shí)，代謝產(chǎn) 物堆積，CQ增多，培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)成分枯竭，一方面長(zhǎng)滿培養(yǎng)空間，另一方面細(xì)胞之間相互接觸而發(fā)生接觸性抑制，生長(zhǎng)速度逐漸減慢甚至停止，更換培養(yǎng)基也 不能使細(xì)胞繼續(xù)生長(zhǎng)，這種情況下，為使細(xì)胞能繼續(xù)生長(zhǎng)，都需要將其分成小的 部分，重新接種到另外的培養(yǎng)器皿內(nèi)，再進(jìn)行培養(yǎng)，這個(gè)過(guò)程被稱為傳代培養(yǎng)。 傳代培養(yǎng)也是一種將細(xì)胞種保存下去的方法，同時(shí)也是利用培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行各種實(shí) 驗(yàn)的必經(jīng)過(guò)程。細(xì)胞長(zhǎng)滿80%90或剛剛?cè)繀R合是細(xì)胞傳代的理想時(shí)期，過(guò)早 細(xì)胞產(chǎn)量不足，過(guò)晚細(xì)胞健康狀態(tài)不佳。（二）將分裝好

12、的細(xì)胞培養(yǎng)物置37C、5%C0培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，必要時(shí)可于 23d 后換1次生長(zhǎng)液，類上皮細(xì)胞在57d后可長(zhǎng)成單層細(xì)胞，成纖維細(xì)胞則以 34d 或 57d 為宜。單層細(xì)胞已鋪滿瓶皿底面時(shí)，如繼續(xù)培養(yǎng)，則易老化，甚至脫落； 感染病毒等可影響特異性細(xì)胞病變效應(yīng)的判斷， 因此成片細(xì)胞不能當(dāng)天使用對(duì)應(yīng) 換成維持液（不含或僅含2%以下血清的培養(yǎng)液），以后每隔57d換維持液1次， 一般可維持 13周。（三）這種長(zhǎng)成單層的細(xì)胞可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。細(xì)胞傳代時(shí)，首先棄去培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)舊培養(yǎng)液，加入5mL左右生理鹽水，清洗細(xì)胞表面，然后向瓶?jī)?nèi)加入 0.25%胰蛋 白酶（或EDTA胰酶-EDTA等），以能覆滿瓶底為限，放置片刻，

13、當(dāng)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞質(zhì)回 縮，細(xì)胞間隙增大，細(xì)胞還未漂起時(shí)，立即終止消化，棄去消化液，用玻璃注射 器吸取營(yíng)養(yǎng)液輕輕反復(fù)吹打瓶壁細(xì)胞， 使之從瓶壁脫離形成細(xì)胞懸液， 計(jì)數(shù)板計(jì) 數(shù)后，將細(xì)胞調(diào)整到5X 105個(gè)/ml左右，并分成等份分裝入若干培養(yǎng)瓶中（一般 來(lái)說(shuō)一瓶生長(zhǎng)致密的細(xì)胞可以傳 34瓶），將細(xì)胞瓶置于CO培養(yǎng)箱（37 C, 5%C0 中繼續(xù)培養(yǎng)。觀察消化程度也可以用肉眼， 當(dāng)見(jiàn)到瓶底發(fā)白并出現(xiàn)細(xì)針孔空隙時(shí) 終止消化。對(duì)難于從培養(yǎng)瓶基層分離的細(xì)胞系， 可以輕輕敲打， 以加速分離過(guò)程。 也可在37 r孵育培養(yǎng)瓶，輕輕搖動(dòng)培養(yǎng)瓶。（四）對(duì)于懸浮生長(zhǎng)的細(xì)胞可采用離心法傳代，即 1000r/min 離心，去上清， 沉淀物加入新培養(yǎng)液后再混勻傳代。 也可用直接傳代法， 即讓細(xì)胞自然沉降， 上 清棄去 1/22/3 ，吹打成懸液再傳代。十四 . 細(xì)胞凍存與復(fù)蘇（一） 凍存：采用液氮超低溫保存 （-196 r ） ，凍存前 24h 更換新鮮培養(yǎng)液，使 細(xì)胞處于充足的營(yíng)養(yǎng)環(huán)境中。 常規(guī)法消化細(xì)胞， 制備成細(xì)胞懸液后通過(guò)計(jì)數(shù)計(jì)算 細(xì)胞總量。以1000r/min離心10min棄上清再重復(fù)離心一次，盡量除去胰蛋白酶。 加入4C預(yù)冷的凍存保護(hù)液（90% FBS+10BDMS0）調(diào)整細(xì)胞密度約3.0 X 10 6個(gè)/mL。 每支陳存管中裝約1mL后封口，標(biāo)明日期、品種、細(xì)胞名稱和培養(yǎng)代數(shù)。凍存管 置4C8C使D