transwell實(shí)驗(yàn)原理與步驟

1、1. 無基質(zhì)膠Tran swell 小室制備 包被基底膜：用50 mg/LMatrigel 1:8稀釋液包被Tran swell小室底部膜的上室面，4 C風(fēng)干。如果需要在下室面鋪FN的話，可將200 ul槍頭的尖端剪掉，吸取FN均勻涂抹在小室的下面。用膠原（collagen ）的話，一般配成 mg/ml，直接用槍吸了涂在膜上。 水化基底膜：37 C, 30min。另有Matrigel ug/ul)吸出培養(yǎng)板中殘余液體，每孔加入50ul含10g/LBSA的無血清培養(yǎng)液，tianjin_glioma戰(zhàn)友提供的方法：在上室的聚碳酸酯膜上加入稀釋后的60-80卩l(xiāng) （注意體積不可太大，以剛把聚碳酸酯膜

2、浸濕為最好），置37 C 30 min使Matrigel聚合成凝膠。2. 有基質(zhì)膠的Tran swell小室制備Chemicon公司的ECM550系列說明書要求，將小室放入培養(yǎng)板中，在上室加入300卩1預(yù)溫的無血清培養(yǎng)基，室溫下靜置15-30 min，使基質(zhì)膠再水化。再吸去剩余培養(yǎng)液。二、制備細(xì)胞懸液 制備細(xì)胞懸液前可先讓細(xì)胞撤血清饑餓12-24 h,進(jìn)一步去除血清的影響。但這一步并不是必須的。 消化細(xì)胞，終止消化后離心棄去培養(yǎng)液，用PBS洗1 - 2遍，用含BSA的無血清培養(yǎng)基重懸。調(diào)整細(xì)胞密度至 1-10 X 105，個(gè)人認(rèn)為不要超過 5 X 105。具體實(shí)驗(yàn)時(shí)采用密度要自己摸 索，因?yàn)椴?/p>

3、同細(xì)胞，其侵襲能力是不同的。個(gè)人經(jīng)驗(yàn)，細(xì)胞量過多，穿過膜的細(xì)胞會(huì)過多過快，如果最后用計(jì)數(shù)法統(tǒng)計(jì)結(jié)果的話將難以計(jì)數(shù)；而過少的話，可能還沒到檢測(cè)的時(shí)間點(diǎn)， 所有的細(xì)胞都已穿過，因此最少也要保證在收樣的時(shí)候，上室內(nèi)還要有一定量的細(xì)胞存在。個(gè)人認(rèn)為，對(duì)照組和處理盡量不要分開計(jì)數(shù)， 因?yàn)榧?xì)胞數(shù)目的差異會(huì)嚴(yán)重影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。如果需要對(duì)細(xì)胞預(yù)處理而不得不分開計(jì)數(shù)，那么計(jì)數(shù)一定要多重復(fù)幾次， 力求準(zhǔn)確，盡量保證對(duì)照組和處理組細(xì)胞密度一致。三、接種細(xì)胞 取細(xì)胞懸液100 - 200卩1加入Tran swell小室，不同公司的、不同大小的Tran swell小室對(duì)細(xì)胞懸液量有不同要求，請(qǐng)參考說明書。24孔板小室一般

4、200卩l(xiāng)。 24孔板下室一般加入 500卩1含F(xiàn)BS或趨化因子的培養(yǎng)基，不同的培養(yǎng)板加的量有不同要求，具體請(qǐng)參考說明書。這里要特別注意的是，下層培養(yǎng)液和小室間常會(huì)有氣泡產(chǎn)生，一旦產(chǎn)生氣泡，下層培養(yǎng)液的趨化作用就減弱甚至消失了，在種板的時(shí)候要特別留心，一旦出現(xiàn)氣泡，要將小室提起，去除氣泡，再將小室放進(jìn)培養(yǎng)板。 培養(yǎng)細(xì)胞：常規(guī)培養(yǎng) 12-48 h （主要依癌細(xì)胞侵襲能力而定）。時(shí)間點(diǎn)的選擇除了要考 慮到細(xì)胞細(xì)胞侵襲力外，處理因素對(duì)細(xì)胞數(shù)目的影響也不可忽視。以我的課題為例，我使用的藥物不僅會(huì)抑制腫瘤細(xì)胞侵襲力，還對(duì)細(xì)胞增殖有明顯抑制。我選擇的藥物濃度是用 MTT篩選出的72 h的IC50。用這個(gè)濃

5、度處理細(xì)胞，24 h內(nèi)對(duì)細(xì)胞增殖并無明顯抑制，但 24 h后，抑制作用就開始出現(xiàn)了。所以，用這個(gè)濃度來做Tran swell ,處理時(shí)間也必須限定在24h內(nèi)，否則一旦藥物抑制了細(xì)胞增殖或者誘導(dǎo)出凋亡，使處理組究竟是由于侵襲被抑制引細(xì)胞數(shù)目少于對(duì)照組，那么就難以肯定穿過膜的細(xì)胞比對(duì)照組少，MMP儲(chǔ)存，短時(shí)間內(nèi)可能影響MMP表達(dá)，到最也可選擇多個(gè)時(shí)間點(diǎn)研究另外，我看到細(xì)胞在小起，還是處理后細(xì)胞數(shù)目本身就比對(duì)照組少而引起的了。時(shí)間過長(zhǎng)不可以，同樣，過短也不行，因?yàn)榧?xì)胞內(nèi)會(huì)有一定量的 侵襲能力不會(huì)有太大改變。同時(shí)從藥物被吸收進(jìn)去，進(jìn)而發(fā)揮作用， 后釋放到培養(yǎng)基中， 還需要一個(gè)過程。 時(shí)間點(diǎn)的選擇可盡量

6、長(zhǎng)點(diǎn)， 時(shí)間依賴效應(yīng)，但前提是這個(gè)時(shí)間范圍內(nèi)細(xì)胞數(shù)目不能有明顯變化。室內(nèi)的形態(tài)不是正常培養(yǎng)貼壁的形態(tài)，而是圓形的，仍是懸浮時(shí)的形態(tài)，不過會(huì)聚集成團(tuán)，膜下會(huì)逐漸有少量小氣泡產(chǎn)生，這是正?，F(xiàn)象，可不予處理，但我遇到過培 膜下出現(xiàn)了大氣泡，幸虧及時(shí)發(fā)現(xiàn)，否則后果將非常嚴(yán)重。 因此，個(gè)人建議,1-2 h把培養(yǎng)板從培養(yǎng)箱里拿出來看看，確信沒有大氣泡產(chǎn)生。所以看到細(xì)胞不正常貼壁也不要緊張，是正?，F(xiàn)象在培養(yǎng)過程中， 養(yǎng)一段時(shí)間后， 最好接種細(xì)胞后四、結(jié)果統(tǒng)計(jì)檢測(cè)穿過的細(xì)胞數(shù)有兩種方法：1. 直接計(jì)數(shù)法(1) “貼壁”細(xì)胞計(jì)數(shù) 這里所謂的“貼壁”是指細(xì)胞穿過膜后，可以附著在膜的下室側(cè)而不會(huì)掉到下室里面去。 通

7、過給細(xì)胞染色，可在鏡下計(jì)數(shù)細(xì)胞 用棉簽擦去基質(zhì)膠和上室內(nèi)的細(xì)胞 染色：常用的染色方法有結(jié)晶紫染色、臺(tái)？藍(lán)染色、Giemsa染色、蘇木精染色、伊紅染色等。個(gè)人推薦采用吉晶紫染色，這種方法有如下優(yōu)勢(shì)：(1).不需要固定細(xì)胞，直接染色以致細(xì)胞成堆，這種情況下就難以計(jì)數(shù)了， 使用結(jié)晶紫染色要注意，染色前要將膜風(fēng)干,這種情況下就可 否則可能會(huì)染即可。(2).配制簡(jiǎn)單方便。(3).染色后可以用33%酸脫色，將結(jié)晶紫完全洗脫下來，洗 脫液可在酶標(biāo)儀上 570 nm測(cè)其OD值，間接反映細(xì)胞數(shù)。個(gè)人認(rèn)為這是結(jié)晶紫染色最大的 優(yōu)勢(shì)所在。因?yàn)?，雖然經(jīng)過準(zhǔn)確的細(xì)胞計(jì)數(shù)，往往穿過膜的細(xì)胞數(shù)仍難以準(zhǔn)確控制，可能某一批實(shí)驗(yàn)

8、穿過的細(xì)胞會(huì)特別多， 以用醋酸脫色后用酶標(biāo)儀檢測(cè)。 不上。Leica DC 300F正置顯微鏡進(jìn)行觀察和拍照，把Tran swell 小 細(xì)胞計(jì)數(shù)：我們使用的是室反過來底朝上就可清楚看到小室底膜上下室側(cè)附著的細(xì)胞。也有不少人用手術(shù)刀將膜切下后染色，再貼在玻片上，滴二甲苯，再蓋上蓋玻片，就可以長(zhǎng)期保存，但是這樣做小室就成 了一次性的了，未免有點(diǎn)浪費(fèi)。取若干個(gè)視野計(jì)數(shù)細(xì)胞個(gè)數(shù)。論壇里一般采用3 - 5個(gè)視野，也有人用10個(gè)，都是隨機(jī)選取，個(gè)人認(rèn)為這樣選擇的視野帶有很大的偶然性，也會(huì)摻進(jìn)人為影響，特別是計(jì)數(shù)視野較少的時(shí)候。我選取16個(gè)視野，不是隨機(jī)選擇，而是有固定的位置。我們使用的顯微鏡所看到的視

9、野的直徑剛好是 Chemicon公司的ECM550系列小室底面膜的直徑的 1/4。不同廠家不同型號(hào) 的小室，膜的面積不盡相同，但個(gè)人認(rèn)為，拍照時(shí)還是應(yīng)當(dāng)選取固定的位置，并選擇盡可能 多的視野。(2) “非貼壁”細(xì)胞計(jì)數(shù)由于某些細(xì)胞自身的原因或某些膜的關(guān)系，有時(shí)細(xì)胞在穿過膜后不能附著在膜上，而是掉進(jìn)下室。這種情況我沒有遇到過，根據(jù)論壇里提供的經(jīng)驗(yàn)，可以收集下層培養(yǎng)液，用流式細(xì)胞儀計(jì)數(shù)細(xì)胞量，也可用細(xì)胞計(jì)數(shù)的方法直接在鏡下計(jì)數(shù)，個(gè)人認(rèn)為MTT應(yīng)該也是可以用的，有興趣的可以試試看。2. 間接計(jì)數(shù)法與常間接計(jì)數(shù)法主要用于穿過細(xì)胞過多，而無法通過計(jì)數(shù)獲得準(zhǔn)確的細(xì)胞數(shù)所采用的方法，用的MTT實(shí)驗(yàn)是同樣的原

10、理。(1) MTT法 用棉簽擦去基質(zhì)膠和上室內(nèi)的細(xì)胞 24孔板中加入500卩1含mg/ml MTT的完全培養(yǎng)基，將小室置于其中，使膜浸沒在培養(yǎng) 基中，37 C 4 h后取出。 24孔板中加入500卩l(xiāng) DMSQ將小室置于其中，使膜浸沒在 DMS矽，振蕩10 min，使 甲？充分溶解。取出小室，24孔板于酶標(biāo)儀上測(cè) OD值。(2) 熒光試劑檢測(cè)這類方法一般是與 Tran swell小室一起出售的，其原理與MTT法類似，是用一種熒光染料染 細(xì)胞，再將細(xì)胞裂解，檢測(cè)熒光值。Chemicon的ECM554I卩屬于這類。(3) 結(jié)晶紫檢測(cè)上文已說過，這里不再贅述，原理與MTT法也是類似的。但結(jié)晶紫染色還

11、有個(gè)優(yōu)點(diǎn)，就是染色和脫色的過程并不影響膜上細(xì)胞，在脫色后還可重新染色。1. 1Matrigel : Becton Dicki nson Comp ary, -20 C保存；Tanswell plate : Costar ,USA , # 3422 ,聚碳酯膜微孔直徑為8 i m蘇木素染液，梯度乙醇，二甲苯溶液。NIH3T3細(xì)胞,無血清培養(yǎng)基輕柔漂4 C ,121.2趨化因子的制備取傳代第二天長(zhǎng)勢(shì)良好的 洗兩次;加入無血清培養(yǎng)基,37 C ,5 %CO2培養(yǎng) 24 h48h，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清；000rpm離心,10 min ,取上清；i m濾膜過濾除菌；分裝，在-20 C保存。1. 3在冰上保3

12、001無血transwell培養(yǎng)板準(zhǔn)備所有操作均需無菌操作。-20C保存的Matrigel2C8C過夜融化。在冰上用預(yù)冷的槍頭吸取10011 Matrigel加入冰預(yù)冷的清培養(yǎng)基中，充分混均。取上述稀釋的Matrigel 2511加入transwell 板上室，覆蓋整個(gè)聚碳酯膜,37 C ,30 min ,使Matrigel聚合成膠。已鋪好 Matrigel的transwell培養(yǎng)板置于37C可保存2周。刺激后的各組細(xì)胞用 PBS漂洗3次。 個(gè)細(xì)胞/ ml ,每組細(xì)胞各分為兩部分。1.4Matrigel 侵襲實(shí)驗(yàn)（Matrigel Invasion Assay）以常規(guī)方法用無血清培養(yǎng)基制備單細(xì)

13、胞懸液,5 X 105胎盤蘭拒染實(shí)驗(yàn),細(xì)胞活力需大于 95 %。Tran swell培養(yǎng)板上室加入10011細(xì)胞懸液（5 X 104個(gè)）并加入無血清培養(yǎng)基200 ul 。Tran swell培養(yǎng)板下室加入 50011趨化因子,37 C ,5 %CO2培養(yǎng)24 h。用濕棉簽輕輕擦去 Matrigel 凝膠和聚碳酯膜上表面的細(xì)胞。 小心取出上室，用線拴住，并做好標(biāo)記，用冰預(yù)冷的甲醇固定 30 min。蘇木素染色1 min。梯 度乙醇脫水（80 % ,95 % ,100 %）,二甲苯透明。小心將聚碳酯膜自上室基底切取下來，置載玻片上中性樹脂封片。附著于聚碳酯膜下表面的細(xì)胞在高倍鏡下（ X 400）隨

14、機(jī)取6個(gè)視野1 計(jì)數(shù)，取平均數(shù)。重復(fù)實(shí)驗(yàn)兩次。2. 1 INIH3T3細(xì)胞制備的趨化因子與胎牛血清趨化因子是能使細(xì)胞產(chǎn)生趨化運(yùn)動(dòng)的一類細(xì) 胞因子2 。目前利用NIH3T3細(xì)胞制備趨化因子做細(xì)胞體外侵襲實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)室比較多，時(shí)間較長(zhǎng)且實(shí)驗(yàn)步驟繁瑣。眾所周知，胎牛血清中有趨化因子，我們?cè)诓煌瑵舛萒NFa刺激下的 HCCC29810膽囊癌細(xì)胞體外侵襲能力的強(qiáng)弱實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)用胎牛血清和用NIH3T3細(xì)胞制備的趨化因子做細(xì)胞體外侵襲實(shí)驗(yàn)效果是一樣的，兩組遷移的細(xì)胞數(shù)很接近。在實(shí)驗(yàn)時(shí)間上，用NIH3 T3細(xì)胞制備趨化因子做細(xì)胞體外侵襲實(shí)驗(yàn)周期為1周，而用胎牛血清作趨化因子做細(xì)胞體外侵襲實(shí)驗(yàn)周期為2 d ,實(shí)驗(yàn)

15、時(shí)間節(jié)省了很多。因此認(rèn)為可以用胎牛血清來代替NIH3T3細(xì)胞制備的趨化因子。2. 2 細(xì)胞的準(zhǔn)備所需細(xì)胞應(yīng)處在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，細(xì)胞活力需大于95 %。如果細(xì)胞活力小,就會(huì)造成細(xì)胞穿透能力下降，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。 . 3 擦去Matrigel凝膠和聚碳酯膜上表面的細(xì)胞先用干棉簽將上室內(nèi)液體吸去， 再用蒸餾水浸濕的棉簽輕輕擦去Mat rigel凝膠和聚碳酯膜上表面的細(xì)胞，如果沒有擦凈聚碳酯膜上表面的細(xì)胞，在細(xì)胞計(jì)數(shù)時(shí)就會(huì)將沒擦掉的細(xì)胞也計(jì)進(jìn)來。尤其是細(xì)胞為圓形的時(shí) 候，就會(huì)分辨不出是穿過去的細(xì)胞還是沒穿過去的細(xì)胞，對(duì)于長(zhǎng)梭形細(xì)胞來說，穿過去的細(xì)胞為長(zhǎng)梭形,沒穿過去的細(xì)胞多為圓形。2. 4 蘇木素染色上室浸

16、泡在新蘇木素中的時(shí)間為1 min ,用過多次的蘇木素為 2 min。在研究粉防己堿對(duì) HUVEC人類臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞遷移能力的抑制作用沒有將多余蘇木素 洗去,直接脫水、透明，造成細(xì)胞圖片背景模糊，細(xì)胞不清楚。在作不同濃度TNFa刺激下的HCCC29810膽囊癌細(xì)胞體外侵襲能力的強(qiáng)弱實(shí)驗(yàn)時(shí)我們將其置于盛有自來水的燒杯中，反復(fù)漂洗幾次，將多余蘇木素洗去再行脫水、透明；這樣做出的細(xì)胞圖片背景干凈，細(xì)胞清楚。四唑鹽試驗(yàn)（MTT比色試驗(yàn)四唑鹽是一種能接受氫原子的染料，簡(jiǎn)稱MTT活細(xì)胞的線粒體中的琥珀脫氫酶能使外源性的MTT還原為難溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶物并沉積在細(xì)胞中，而死細(xì)胞無此功能。 二甲基亞砜能溶解細(xì)胞中

17、的紫色結(jié)晶物，用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在 490nm波長(zhǎng)處測(cè)定其光吸收值，可間接反 映細(xì)胞數(shù)量。在一定細(xì)胞數(shù)范圍內(nèi)，MTT結(jié)晶物形成的量與細(xì)胞數(shù)成正比。MTT溶液：稱取250mgMTT放入小燒杯中，加50ml培養(yǎng)液或平衡鹽溶液在電磁力攪拌 機(jī)上攪拌30min , 5mg/ml。用的微孔濾器除菌，分裝，4C保存?zhèn)溆?，兩周?nèi)有效。操作步驟1. 接種細(xì)胞：用 夷蛋白酶消化單層培養(yǎng)細(xì)胞，用含10嗚臺(tái)牛血清的DMEM培養(yǎng)液配成單個(gè)細(xì)胞懸液，以每孔 103104個(gè)細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔體積200ul。2. 培養(yǎng)細(xì)胞：將培養(yǎng)板移入 CO2孵箱中，在37C、5%CO2及飽和濕度條件下培養(yǎng)。（培養(yǎng)時(shí)間取決于實(shí)驗(yàn)

18、目的和要求）I3. 呈色：每孔加入 MTT溶液（5mg/ml） 20ul , 37C孵箱中繼續(xù)孵育 4h,終止培養(yǎng)，小 心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液 （對(duì)于懸浮生長(zhǎng)的細(xì)胞， 需離心1000rpm ,5min）。每孔加入150ul DMsO 振蕩10min，使結(jié)晶物充分溶解。4. 比色：選擇490nm波長(zhǎng)，在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上測(cè)定各孔光吸收值，記錄結(jié)果。以時(shí) 間為橫軸，光吸收值為終軸繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。（五）、注意事項(xiàng)1. 選擇適當(dāng)?shù)募?xì)胞接種濃度。 在進(jìn)行 增時(shí)間以及不同接種細(xì)胞數(shù)條件下的生長(zhǎng)曲線， 間。2.3.白孔調(diào)零MTT試驗(yàn)前，對(duì)每一種細(xì)胞都應(yīng)測(cè)其貼壁率、倍 然后確定試驗(yàn)中每孔的接種細(xì)胞數(shù)和培養(yǎng)時(shí)避免血清干擾，一般選小于 10呱臺(tái)牛血清的培養(yǎng)液進(jìn)行試驗(yàn)。 設(shè)空白對(duì)照，與試驗(yàn)平行設(shè)不加細(xì)胞只加培養(yǎng)液的空白對(duì)照孔。最后比色時(shí),以空【原理】活細(xì)胞的線粒體中存在 NAD pH!關(guān)的脫氫酶類，可將黃色的MTT還原為水不溶 性的藍(lán)紫色甲臜，死亡的細(xì)胞該酶活性喪失，MT"被還原，用 DMSO溶解甲臜