單克隆抗體制備實驗過程

1、單克隆抗體制備實驗過程一、 免疫動物免疫動物是用目的抗原免疫小鼠，使小鼠產(chǎn)生致敏B 淋巴細胞的過程。一般選用6-8 周齡雌性Balb/c 小鼠，按照預先制定的免疫方案進行免疫注射。抗原通過血液循環(huán)或淋巴循環(huán)進入外周免疫器官，刺激相應B淋巴細胞克隆，使其活化、增殖，并分化成為致敏B淋巴細胞。說明：FCA弗氏完全佐齊I；FIA,弗氏不完全佐劑； Quickantibody ,北京康碧泉公司研制的佐劑。上表中第四種免疫方法產(chǎn)生的抗體大部份都為IgM,存在親和力弱等缺點，慎用。PS： 1、一般皮下注射每個注射點注射30-50ul 左右混有佐劑的抗原，每只小鼠注射6-8 個點為宜。2 、腹腔注射時，如果

2、抗原混有弗氏佐劑，建議注射在左側(cè)腹腔，如果采用右側(cè)腹腔注射，則在免疫過程中，很容易導致小鼠脾臟與腹膜粘連的情況，造成后期取出脾臟麻煩。3 、沖擊免疫完成后，應在96 小時內(nèi)完成細胞融合，否則相應的B 細胞數(shù)量會下降到未沖擊前的水平。二、細胞融合（ Cell fusion ）【材料和試劑】（ 1 ）骨髓瘤細胞懸液選好骨髓瘤細胞株，取體外培養(yǎng)對數(shù)生長期細胞或體內(nèi)生長的腫瘤分離骨髓瘤細胞，制備細胞懸液。（ 2）免疫小鼠脾細胞懸液取 3 天前加強免疫的小鼠，眼眶放血，?分離血清凍存?zhèn)溆谩＠i處死小鼠，浸泡于 75%酒精中35min。無菌操作取出脾臟，置入盛有5ml 不完全培養(yǎng)液的平皿中洗滌，剪去周圍的

3、結(jié)締組織，將脾臟移入另一盛有5ml 不完全培養(yǎng)液的平皿中的鋼網(wǎng)上，先用剪刀剪成35個小塊，然后用注射器內(nèi)芯研磨。將脾臟細胞懸液移至50ml離心管中，加不完全培養(yǎng)液50ml， 1000r/min 離心5min， 棄上清， 再以同法洗滌離心一次。然后將沉淀細胞重新懸浮于10ml 不完全培養(yǎng)液中，計活細胞數(shù)，一般一只小鼠可得0.52X108個脾細胞。（ 3）飼養(yǎng)細胞將小鼠致死、體表消毒和固定后，用消毒剪鑷從后腹掀起腹部皮膚，暴露腹膜。用酒精棉球擦拭腹膜消毒。用注射器注射10ml不完全培養(yǎng)基至腹腔，注意避免穿入腸管。右手固定注射器，使針頭留置在腹腔內(nèi)，左手持酒精棉球輕輕按摩腹部1分鐘，隨后吸出注入的培

4、養(yǎng)液。1000r/min離心5-10分鐘，棄上清。先用5ml HAT培養(yǎng)基將沉淀細胞懸浮， 根據(jù)細胞計數(shù)結(jié)果，補加 HA信養(yǎng)基，使細胞濃度為2Xl05/ml,備用。(4)主要試劑的配制細胞培養(yǎng)基雜交瘤技術(shù)中使用的細胞培養(yǎng)基主要有RPMI-1640或DMEMDulbercoModified Eagles Medium )兩種基礎(chǔ)培養(yǎng)基，配好后過濾除菌(0.22um),分裝，4c保不完全RPMI-1640培養(yǎng)基：RPMI-1640培養(yǎng)基原液96ml100XL.G.溶液1ml雙抗溶液1ml7.5%NaHCO3 液1-2mlHEPESg液1ml不完全DME夠養(yǎng)基:DMEM13.37g超純水或四蒸水98

5、0mlNaHCO33.7g雙抗溶液10ml100XL.G.溶液10ml用1N HCl調(diào)試PH至7.2-7.4 ,過濾除菌，分裝4c保存。完全RPMI-1640或DMEMg養(yǎng)基:不完全RPMI-1640或DME麟養(yǎng)基80ml小牛血清15-20mlHT或HATW養(yǎng)基:1TM關(guān)宜HI A口加HAT土口加基完全RPMI-1640或DMEM?養(yǎng)基99ml98mlHT貯存液1ml1mlA貯存液1ml氨基喋吟(A)貯存液(100X, 4X 105mol/L)稱取 1.76mg 氨基喋吟(Aminopterin MW 440.4 ), 力口 1mol/L NaOH0.5ml中和，再補加超純水或四蒸水至溶于90

6、ml超純水或叫蒸水中，滴 100ml。過濾除菌，分裝小瓶(2ml/瓶)，-20C保存。次黃喋吟和胸腺喀呢核甘 (HTD貯存液(100X, H: 10-2mol/L, T: 1.6 x 10-3mol/L )稱取136.1mg次黃喋吟(Hypoxanthine , MW 136.1)和 38.8mg胸腺喀呢核音 (Thymidine, MW 242.2,加超純水或四蒸水至100ml,置45-50 C水浴中使完全溶解，過濾除菌，分裝小瓶(2ml/瓶)，-20 C凍存。用前可置37c加溫助溶。L-谷氨酰胺(L.G.)溶液(100X, 0.2mol/L )稱取2.92g L-谷氨酰胺（L-glutam

7、ine , MW146.15）,用100ml不完全培養(yǎng)液或超純水（或四蒸水）溶解，過濾除菌，分裝小瓶（4-5ml/ 瓶） ， -20凍存。青、鏈霉素（雙抗）溶液（100X）取青霉素G （鈉鹽）100萬單位和鏈霉素（硫酸鹽）1g,溶于100ml滅菌超純水或四蒸水中，分裝小瓶（4-5ml/ 瓶） ， -20凍存。 7.5% NaHCO§液稱取分析純NaHC3O7.5g， 溶于 100ml 超純水或四蒸水中，過濾除菌，分裝小瓶 （ 4-5ml/瓶） ，蓋緊瓶塞，4保存。HEPESg液（1mol/L）稱取 23.83g HEPES（ N-2-Hydroxyethylpiperazine-N

8、， -2-ethanesulfonic acid ， N-2-羥乙基哌嗪-N , -2-乙基磺酸，MW 238.3溶于100ml超純水或四蒸水中，過濾除 菌，分裝小瓶（4-5ml/ 瓶） ， 4保存。8-氮鳥喋吟貯存液（100X）稱取 200mg 8-氮鳥喋吟（8-azaguanine , MW 152.1,加入 4mol/L NaOH 1ml,待其 溶解后，加入超純水或四蒸水 99ml,過濾除菌；分裝小瓶，-20 C凍存。使用時按1%農(nóng) 度加入到培養(yǎng)液中（即終濃度為20ug/ml ） 。 50% PEG稱取 PEG 1000 或 4000 20-50g 于三角瓶中，蓋緊，60-80水浴融化，

9、0.6ml 分裝于青霉素小瓶中，蓋緊，8 磅高壓蒸汽15 分鐘，-20存放備用。臨用前加熱融化，加等量不完全培養(yǎng)基，用少許 7.5% NaHCOM PH至8.0 ,或購買Sigma或Gibco公司現(xiàn)成產(chǎn) 品。（ 5） 24 孔及 96 孔培養(yǎng)板等細胞培養(yǎng)所用材料和試劑?！静僮鞑襟E】（1）將準備好的骨髓瘤細胞與小鼠脾細胞按1: 51: 10比例混合，？加入 2050ml RPMI-1640 液。（2） 1000r/min x 6 10min離心棄上清，將上清盡量吸凈。（ 3）用手指輕輕擊打離心管底部，使沉淀細胞分散，將離心管置37水浴中。（4）吸取1ml 37c預溫的50% PEG緩慢滴入離心管

10、內(nèi)，45秒左右加完， 邊加邊輕車5攪拌，37c靜置15min。（5）在5min內(nèi)滴加不完全完全培養(yǎng)液（37C預溫）20ml,第一分鐘內(nèi)滴 加1ml,第2分鐘2ml,第3分鐘5ml,第4和第5分鐘各6ml,同時應邊加 邊輕輕地轉(zhuǎn)動離心管，應沿管壁滴加，不應直接滴加在沉淀細胞上，以防將剛?cè)诤系募毎麤_開。然后加1640液至50ml使PEG乍用終止。（6） 800r/min X510min 離心，棄上清。（7） ?將沉淀細胞輕輕懸浮于所需容積的HAT培養(yǎng)液中，接種24孔板（每孔 1.0-1.5ml ）或 96孔培養(yǎng)板（每孔0.10-0.15ml ） 。（ 8）接種完畢后，將培養(yǎng)板放入375 CO2 溫

11、箱中培養(yǎng)。PS:1、 凍存的骨髓瘤細胞在復蘇后要2 周時間才能處于適合于融合的狀態(tài)，培養(yǎng)目標是使處于對數(shù)生長的時間盡可能長。2 、 飼養(yǎng)層細胞應在使的前一天制備好，這樣才能分泌足夠的細胞因子。三、選擇性培養(yǎng)原理：在HATW養(yǎng)基中，未融合的骨髓瘤細胞因缺乏次黃喋吟-鳥喋吟- 磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶，不能利用補救途徑合成DNA而死亡。未融合的淋巴細胞雖具有次黃嘌呤- 鳥嘌呤 -磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶，但其本身不能在體外長期存活也逐漸死亡。只有融合的雜交瘤細胞由于從脾細胞獲得了次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶，并具有骨髓瘤細胞能無限增殖的特性，因此能在HA謂養(yǎng)基中存活和增殖。（1）接種24孔板或96孔板5天后，用HAT

12、培養(yǎng)基換出1/2培養(yǎng)基。（2） 7-10天后用HT培養(yǎng)基換出HATW養(yǎng)基；（第14天后可用普通完全培養(yǎng)基） 。PS:1、 經(jīng)常觀察雜交瘤細胞生長情況，待其長至孔底面積1/10 以上時吸出上清供抗體檢測。四、雜交瘤陽性克隆的篩選與克隆化雜交瘤細胞在融合后2 周左右即可篩選，選用抗體檢測方法的原則是快速、敏感、特異、可靠、花費小和節(jié)省人力，通常根據(jù)所研究的抗原和實驗室的條件而定，一般制備單抗的目的決定了篩選克隆所用的方法。由于融合后，細胞上清份數(shù)多，但每份體積有限，因此 ELISA是最適合用于初步篩選 的方法。經(jīng)過ELISA篩選出的陽性克隆即可進行克隆化，因為如果不進行克 隆化，當陽性孔有非抗體分

13、泌型的雜交瘤時，非抗體分泌型的雜交瘤由于生長速度更快，將會占主導生長，最終很難分離出目標雜交瘤以至丟失。另外雜交瘤細胞培養(yǎng)的初期是不穩(wěn)定的，有的細胞丟失部分染色體，可能喪失產(chǎn)生抗體的能力。通常在得到針對預定抗原的雜交瘤以后需連續(xù)進行2-3 次克隆化，有時還需進行多次?？寺』姆椒ê芏啵缬邢尴♂尫?、軟瓊脂法、單細胞顯微操作法、單克隆細胞集團顯微操作法和熒光激活細胞分類儀（FACS分離法。（1）包被 將抗原以pH9.6的NaCO3-NaHC便被，每塊酶標板以5-20 ug 抗原為宜（如果抗原為多肽或小分子物質(zhì)，則需要加大包被量）。每孔的包被體積為50-100 ul 。 37 包被 2 h 或 4

14、 包被過夜。（2）封閉 倒掉抗原，拍干酶標板孔內(nèi)液體，以 0.5-1% BSA（用PBST 溶解）或5%脫脂牛奶（PBST容解）或1%明膠（PBST容解）于37 C封閉 2 h 或 4 封閉過夜，也可以使用10%小牛血清或其它無關(guān)物種血清封閉。封閉完后可立即使用，也可以洗滌一次置于4 密封保存以備后面使用。（ 3）一抗封閉完后，棄去孔內(nèi)液體，拍干，加入待檢測細胞上清，每孔 100 ul 為宜。在每塊板子上做好記號。37 孵育 1 h 。（4）二抗 孵育完一抗后，棄去孔內(nèi)液體，拍干，以 PBSTU滌3次， 每次5min。根據(jù)二抗說明稀釋好二抗，每孔加入 100 ul.37 C孵育1 h。（ 5）

15、顯色孵育完二抗后，棄去孔內(nèi)液體，拍干，加入顯色劑。待顏色最深時用終止液終止反應。用酶標儀讀出各孔OD直，選擇出陽性孔。（ 1 ） 有限稀釋法從有限稀釋的原理以及影響因素可以知道，其克隆化結(jié)果應該是一個修正的泊松分布：式中入在有限稀釋里的意義是稀釋時設計的每孔細胞的平均數(shù)，k則代表可能出現(xiàn)的細胞個數(shù)。材料：a、96孔細胞培養(yǎng)板等；b、HT培養(yǎng)基；c、活力強的雜交瘤細胞； d、小鼠腹腔細胞。方法：a、制備飼養(yǎng)細胞（小鼠腹腔細胞）。b 、制備待克隆的雜交瘤細胞懸液，用含 20湎清的HT培養(yǎng)基稀釋至每毫升含2.5、 15和 50個細胞3 中不同的稀釋度。c 、按每毫升加入5X 104-1 X 105細

16、胞的比例，在上述雜交瘤細胞 懸液中分別加入腹腔巨噬細胞。d 、每種雜交瘤細胞分裝96 孔板一塊，每個稀釋度32 孔，每孔量為 0.2ml ，每孔的雜交瘤細胞數(shù)分別為0.5、 3和 10。e 、37C、7.5% CO2®潤培養(yǎng)7-10天，出現(xiàn)肉眼可見的克隆即可檢測抗體；在倒置顯微鏡下觀察，標出只有單個克隆生長的孔，取上清作抗 體檢測。f 、取抗體檢測陽性孔的細胞擴大培養(yǎng)，并凍存。g 、本法中（b）、（c）、（d）也可簡化為將計數(shù)后的雜交瘤細胞準確地進行系列稀釋，直至每毫升含10 個細胞，按每孔接種0.1ml 細胞懸液，即每孔含1 個細胞。（ 2）軟瓊脂法材料：a、HT培養(yǎng)基（雙倍濃度）

17、。b、用0.15mol/L NaCl配制的2.0% 瓊脂糖： 稱取 2.0g 細胞培養(yǎng)用瓊脂糖，懸浮于 100ml 0.15mol/L NaCl， 121高壓滅菌15 分鐘，分裝10ml 小瓶，冷卻后4保存。c、小鼠腹腔細胞。d、滅菌平皿。e、45c水浴。f、活力很好的雜交瘤細胞。 方法：a、在培養(yǎng)皿中制備飼養(yǎng)細胞（小鼠腹腔細胞）單層。b、臨用前將2.0%瓊脂糖生理鹽水溶液與等量雙倍濃度的HT培養(yǎng)液混勻，配成1%瓊脂糖培養(yǎng)液，45水浴中溫育。c、吸去平皿上層培養(yǎng)液，加入1兩脂糖培養(yǎng)液3ml,室溫10分鐘。d、取雜交瘤細胞懸液1ml,加入1%瓊脂糖培養(yǎng)液1ml混勻，鋪于上層。e、37C、7.5%

18、S潤培養(yǎng)7-14天；克隆生長至2mm寸，用毛細吸管吸出克隆，直接轉(zhuǎn)種于含有飼養(yǎng)細胞的24 孔板，擴大培養(yǎng)。f 、吸取上清，檢測抗體，陽性孔可繼續(xù)克隆化，或擴大培養(yǎng)、凍存。PS： 1、 細胞融合后，一旦鑒定可以產(chǎn)生目標抗體，就應立即進行克隆化，確保能分離出單個細胞重新形成克隆。2 、經(jīng)多次嘗試，確定修正公式中的a 值，為以后的實驗提供一個比較穩(wěn)定的經(jīng)驗入值。3 、應在克隆前1 天制備好飼養(yǎng)細胞層。五、單克隆抗體的大量制備單克隆抗體的大量制備重要采用動物體內(nèi)誘生腹水法和體外培養(yǎng)法。1. 用20G或22G的注射針，小鼠腹膜內(nèi)注射降植烷，每只鼠0.5 1 ml,1 周后接種細胞。2. 在175 cm2

19、培養(yǎng)瓶中加完全DMEM-10/HEPES/酮酸鈉培養(yǎng)液，進行雜交瘤細胞的培養(yǎng)，使細胞生長至對數(shù)期。3. 將培養(yǎng)液轉(zhuǎn)入50 ml 錐形離心管中，室溫下500 g 離心 5 min。4. 細胞重懸于50 ml無菌的PBS或HBSS（不含F(xiàn)BS中洗滌。然后室溫下 500 g 離心 5 min ，棄上清。重復2 次，然后細胞重懸于5 ml 的 PBS或 HBSSK5. 計數(shù)細胞，通過臺盼藍染色法確定細胞活力。6. 用不含F(xiàn)BS的HBSSg PB潮整細胞濃度至2.5 X 102細胞/ml。7. 用一個10 ml的無菌的帶22G針頭的注射器，對裸鼠進行腹膜內(nèi)注射 2 ml 細胞，等待腹水形成（12周） 。

20、8. 收獲腹水。（ 1）一只手抓住并固定小鼠，使其腹部皮膚繃緊。（2）另一只手將一只18G的計頭插入小鼠腹腔12 cm深。（ 3）進針部位為左下腹或右下腹，以避免刺入鼠上腹部的重要器官，以及腹中線處的主要大血管。（ 4）令腹水滴入一只無菌的15 ml 聚丙烯錐形離心管中。9. 于室溫下，1 500 g 離心腹水10 min ，收集上清，棄沉淀，將腹水存放于 4，直到收集腹水的工作完成（在1 周內(nèi)） 。10. 再次收獲腹水前，讓小鼠再次積累腹水（23 天） ，具體操作同步驟8， 腹水的加工處理操作同步驟9。 重復這個過程直到再沒有腹水產(chǎn)生可供收集，或者小鼠健康狀況不佳。11. 把在幾天內(nèi)收集到的

21、腹水匯集到一起，于56水浴45 min 進行熱處理，如果凝塊形成，可用牙簽挑出除之，然后再離心。12. 采用適當?shù)姆椒z測腹水中的 MA曲效價。13. 按大于1:10的比例稀釋MAb并進行濾過除菌，濾膜孔徑為0.45 p m,分裝并凍存于-70 C,避免反復凍融，可凍存數(shù)年之久。PS: 1、腹水含有大量的油脂、巨噬細胞、雜交瘤細胞、腹腔內(nèi)的上皮細胞、血液中的細胞成份等雜質(zhì)，應先離心除去這些成份。2、油脂的密度比較小，一般都漂浮在腹水表面，用槍吸出丟掉即可。六、辛酸-硫酸鏤兩步沉淀法純化單抗1、原理在酸性條件下(pH4.5),非IgG的蛋白成份(包括白蛋白，部分Ig),能被辛 酸等短鏈脂肪酸沉淀

22、，上清中剩余的蛋白主要為IgG,再用硫酸鏤沉淀上清， 即可獲得純度較高的IgG。辛酸/硫酸鏤法比硫酸鏤法能夠獲得更高純度的 IgG。2、方法(1)將腹水用0.06 M醋酸鈉(pH4.0)按1: 3稀釋，用1mol/L NaOH5 至血清稀釋液為pH4.5。(2)室溫下邊攪拌(磁力攪拌器 或電功攪拌器)，邊緩慢滴加辛酸(一般 按每毫升稀釋前的腹水加入40 ul正辛酸)，滴加完后繼續(xù)攪拌30min。(3) 4 C 靜置 2 h。(4) 4 C 10000 g離心20min,可見辛酸因溫度低而從系統(tǒng)中結(jié)晶析出漂 浮在腹水上層，用多層紗布過濾，棄去此結(jié)晶以及底部沉淀，收集上清夜。(5)向上清中加入1/

23、10體積的10X PBS(0.1M, pH 7.4)。(6) 4 C條件下，向其中加入飽和硫酸鏤溶液，使終濃度為45%飽和度， 靜置1h以上。3 3) 10000 g離心10-20min;棄上清，將沉淀溶于適量 1XPBS中，再將 其裝入透析袋用10mMs勺tris或PBS透析(透析液應為抗體體積的100倍以 上，最好攪拌)，4 C過夜。(4)收集透析好的抗體，直接現(xiàn)用或加入保護劑和防腐劑長期保存(-20 C 保存或凍干保存)。用這種方法純化出來的抗體純度可達 80-90%左右，損失較少，對抗體的 活性損失也較少，試劑成本低，但是操作比較費時。3、蛋白含量測定紫外分光光度法測樣品在波長 260nm 280nm處的I及收光度(A 26°, A 28°), 蛋白含量按以下