幾種中藥有效成分對(duì)脂肪細(xì)胞胰島素增敏作用的研究

1、幾種中藥有效成分對(duì)脂肪細(xì)胞胰島素增敏作用的研究    【摘要】 1.研究益氣散聚方中藥有效成分黃芪多糖、小檗堿、蒲黃總黃酮等對(duì)胰島素抵抗的脂肪細(xì)胞模型糖脂代謝的影響,以了解這些有效成分有無(wú)改善胰島素抵抗的作用。2.研究黃芪多糖、小檗堿、蒲黃總黃酮等中藥有效成分對(duì)前脂肪分化的作用以及對(duì)分化過(guò)程中的相關(guān)基因過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體（PeroxisomeProliferator Activated Receptor,PPAR）和CAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白（CAAT/Enhancer Binding Protein,C/EBP）mRNA表達(dá)的影響。并與TZD藥物

2、的作用機(jī)制進(jìn)行比較。3.在研究中藥有效成分對(duì)胰島素增敏作用的基礎(chǔ)上,進(jìn)一步觀察其對(duì)胰島素抵抗模型細(xì)胞胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的作用及相關(guān)細(xì)胞因子分泌的影響,探討它們影響胰島素敏感性的可能作用機(jī)制。4.以藥測(cè)證,探討胰島素抵抗的中醫(yī)病機(jī)特點(diǎn)及治療原則。方法1.幾種中藥有效成分對(duì)胰島素抵抗脂肪細(xì)胞糖脂代謝的影響胰島素抵抗脂肪細(xì)胞模型的建立與鑒定:將24孔培養(yǎng)板中分化成熟的脂肪細(xì)胞以含1%BSA的低糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)12h后分為正常葡萄糖正常胰島素組及高糖高胰島素組,每組7個(gè)樣本。干預(yù)培養(yǎng)24 h后,通過(guò)3H-脫氧葡萄糖的攝取試驗(yàn)測(cè)定兩組脂肪細(xì)胞對(duì)葡萄糖的攝取情況。葡萄糖消耗試驗(yàn)檢測(cè)中藥有效成分對(duì)正常3

3、T3-L1脂肪細(xì)胞葡萄糖的消耗及細(xì)胞活性的影響:實(shí)驗(yàn)設(shè)對(duì)照組、各中藥有效成分組（黃芪多糖、小檗堿、蒲黃總黃酮）及羅格列酮組。每種中藥有效成分和羅格列酮分別采用五個(gè)濃度。干預(yù)培養(yǎng)24 h,以葡萄糖氧化酶法檢測(cè)每孔培養(yǎng)液中葡萄糖的含量,與未接種細(xì)胞的空白孔的糖含量均值相減,計(jì)算葡萄糖的消耗。葡萄糖消耗實(shí)驗(yàn)結(jié)束后移出培養(yǎng)液,二甲氧唑黃比色法（XTT）檢測(cè)細(xì)胞活力。并結(jié)合葡萄糖消耗及XTT檢測(cè)結(jié)果確定藥物的最適濃度。3H-脫氧葡萄糖攝取試驗(yàn)檢測(cè)中藥有效成分對(duì)胰島素抵抗模型脂肪細(xì)胞對(duì)葡萄糖攝取能力的影響:實(shí)驗(yàn)設(shè)對(duì)照組、模型組、中藥有效成分組（黃芪多糖、小檗堿、蒲黃總黃酮）及羅格列酮組,干預(yù)培養(yǎng)24 h后

4、,在基礎(chǔ)狀態(tài)及胰島素刺激狀態(tài)下通過(guò)3H-脫氧葡萄糖的攝取試驗(yàn)測(cè)定各中藥有效成分對(duì)脂肪細(xì)胞葡萄糖攝取的影響。比色法檢測(cè)中藥有效成分對(duì)胰島素抵抗模型脂肪細(xì)胞游離脂肪酸（FreeFatty Acid,FFA）溢出的影響:實(shí)驗(yàn)設(shè)對(duì)照組、模型組、中藥有效成分組（黃芪多糖、小檗堿、蒲黃總黃酮）及羅格列酮組,干預(yù)培養(yǎng)24 h后,收集細(xì)胞上清液,通過(guò)比色法檢測(cè)各組FFA溢出情況。2.幾種中藥有效成分對(duì)3T3-L1前脂肪細(xì)胞分化的影響中藥有效成分對(duì)3T3-L1前脂肪細(xì)胞分化的影響:實(shí)驗(yàn)設(shè)對(duì)照組、中藥有效成分組（黃芪多糖、小檗堿、蒲黃總黃酮）及羅格列酮組,在誘導(dǎo)分化的同時(shí)加藥,藥物與分化液同步更換。分化第8天進(jìn)行

5、油紅O染色,拍攝照片。異丙醇處理染色細(xì)胞,570 nm波長(zhǎng)檢測(cè)OD570值。不同中藥有效成分對(duì)3T3-L1前脂肪細(xì)胞分化相關(guān)基因表達(dá)的影響:實(shí)驗(yàn)設(shè)對(duì)照組、中藥有效成分組（黃芪多糖、小檗堿、蒲黃總黃酮）及羅格列酮組,在誘導(dǎo)分化的同時(shí)加藥,藥物與培養(yǎng)液同步更換。分化第8天抽提細(xì)胞總RNA,通過(guò)實(shí)時(shí)定量逆轉(zhuǎn)錄多聚酶聯(lián)反應(yīng)（Realtime- Polymerase Chain Reaction,RT-PCR）分析脂肪細(xì)胞分化相關(guān)基因過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體（PPAR）和CAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白（C/EBP）的mRNA表達(dá)。3.幾種中藥有效成分對(duì)胰島素抵抗脂肪細(xì)胞胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路及脂肪細(xì)胞因子溢出的

6、影響3H-脫氧葡萄糖的攝取試驗(yàn)檢測(cè)PI-3K信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路阻滯劑Wortmannnin干預(yù)下中藥有效成分對(duì)胰島素抵抗模型脂肪細(xì)胞葡萄糖攝取的影響:實(shí)驗(yàn)設(shè)對(duì)照組、模型組、中藥有效成分組（黃芪多糖、小檗堿、蒲黃總黃酮）及羅格列酮組,Wortmannin干預(yù)30min后,各藥物干預(yù)培養(yǎng)24 h,通過(guò)3H-脫氧葡萄糖的攝取試驗(yàn)測(cè)定各組脂肪細(xì)胞對(duì)葡萄糖的攝取情況。Western blot方法檢測(cè)中藥有效成分對(duì)胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的關(guān)鍵蛋白磷酸化表達(dá)的影響:實(shí)驗(yàn)設(shè)對(duì)照組、模型組、中藥有效成分組（黃芪多糖、小檗堿、蒲黃總黃酮）及羅格列酮組,干預(yù)培養(yǎng)24 h后,收集細(xì)胞,提取全細(xì)胞蛋白,SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳

7、后,通過(guò)Western blot方法檢測(cè)各組酪氨酸磷酸化胰島素受體、絲氨酸磷酸化Akt及酪氨酸磷酸化c-Cbl的蛋白表達(dá)量。4.ELISA法檢測(cè)中藥有效成分對(duì)Resistin,TNF等脂肪因子分泌的影響實(shí)驗(yàn)設(shè)對(duì)照組、模型組、中藥有效成分組（黃芪多糖、小檗堿、蒲黃總黃酮）及羅格列酮組,干預(yù)培養(yǎng)24 h后,收集細(xì)胞上清液。ELISA法測(cè)定各組脂肪細(xì)胞Resistin及TNF蛋白分泌的情況。結(jié)果1.幾種中藥有效成分對(duì)胰島素抵抗脂肪細(xì)胞糖代謝的影響胰島素抵抗脂肪細(xì)胞模型的建立與鑒定:以正常葡萄糖正常胰島素組作為葡萄糖攝取的正常基值,高糖高胰島素組可以使葡萄糖的攝取率下降59.5%。葡萄糖消耗試驗(yàn)及XT

8、T試驗(yàn)檢測(cè)中藥有效成分對(duì)正常3T3-L1脂肪細(xì)胞葡萄糖的消耗及細(xì)胞活力的影響:各中藥有效成分在適當(dāng)?shù)臐舛染娠@著增加正常3T3-L1脂肪細(xì)胞葡萄糖的消耗,黃芪多糖濃度為0.4 g/L時(shí)細(xì)胞葡萄糖消耗量最大,比對(duì)照組增加11%（P0.01）;小檗堿濃度為40mol/L時(shí)細(xì)胞葡萄糖消耗量達(dá)到最大,比對(duì)照組增加20%（P0.01）;蒲黃總黃酮濃度為0.2g/L時(shí)葡萄糖消耗量最大,比對(duì)照組增加27%（P0.01）。XTT檢測(cè)結(jié)果顯示,黃芪多糖濃度從0.05 g/L到0.4g/L對(duì)細(xì)胞活力無(wú)明顯影響:小檗堿濃度超過(guò)10mol/L時(shí),XTT值顯著降低,濃度在5mol/L以下時(shí)對(duì)細(xì)胞活力影響不大。蒲黃總黃酮

9、濃度從0.05g/L到0.4g/L時(shí),對(duì)脂肪細(xì)胞活力無(wú)明顯影響。結(jié)合葡萄糖消耗實(shí)驗(yàn)及XTT檢測(cè)結(jié)果,每種藥物選取一種最適濃度,分別為:黃芪多糖0.4 g/L、小檗堿5mol/L、蒲黃總黃酮0.2g/L、羅格列酮5mol/L,在最適濃度下各中藥有效成分均可促進(jìn)正常3T3-L1脂肪細(xì)胞葡萄糖消耗（與對(duì)照組比較P0.01）;且對(duì)細(xì)胞活力無(wú)明顯影響。3H-脫氧葡萄糖攝取試驗(yàn)檢測(cè)中藥有效成分對(duì)基礎(chǔ)狀態(tài)下胰島素抵抗脂肪細(xì)胞葡萄糖攝取的影響:3T3-L1脂肪細(xì)胞經(jīng)高糖和高胰島素聯(lián)合誘導(dǎo)培養(yǎng)可建立胰島素抵抗的細(xì)胞模型。以模型組（MOD）細(xì)胞葡萄糖攝取量作為基值（100%）,各組葡萄糖攝取量分別與之相比作為各自

10、葡萄糖攝取率。在基礎(chǔ)狀態(tài)下,MOD組攝取率比對(duì)照組（CON）減少了46.8%。不同中藥有效成分干預(yù)培養(yǎng)24h后,黃芪多糖、小檗堿、蒲黃總黃酮在無(wú)胰島素刺激的基礎(chǔ)狀態(tài)下均可促進(jìn)模型細(xì)胞的葡萄糖攝取。其中,APS組的葡萄糖攝取率最高,為MOD的309.8%（P0.01）,BER組和PTF組分別為MOD組的207.6%（P0.05）和298.3%（P0.01）。ROS組為MOD組的385.0%（P0.01）3H-脫氧葡萄糖攝取試驗(yàn)檢測(cè)幾種中藥有效成分在胰島素刺激狀態(tài)下對(duì)胰島素抵抗脂肪細(xì)胞葡萄糖的攝取影響:以MOD組葡萄糖攝取量作為基值（100%）,各組葡萄糖攝取量分別與之相比作為各自葡萄糖攝取率。在

11、胰島素刺激下,MOD組葡萄糖攝取比CON減少了59.5%。不同中藥有效成分干預(yù)培養(yǎng)24h后,黃芪多糖、小檗堿、蒲黃總黃酮在胰島素刺激狀態(tài)下均可促進(jìn)模型細(xì)胞的葡萄糖攝取。其中,小檗堿組的葡萄糖攝取率最大,為MOD的144.8%（P0.01）,黃芪多糖和蒲黃總黃酮組分別為MOD組的126.8%（P0.01）和121.7%（P0.01）。羅格列酮組為MOD的194.9%（P0.01）中藥有效成分對(duì)3T3-L1脂肪細(xì)胞FFA溢出的影響經(jīng)高糖高胰島素培養(yǎng),MOD組FFA溢出與CON組相比有明顯上升,增加了17.5%。經(jīng)不同中藥有效成分干預(yù)后,細(xì)胞上清液的FFA濃度均有不同程度的下降,黃芪多糖、小檗堿、蒲

12、黃總黃酮及羅格列酮組FFA溢出分別比MOD組減少了8.7%、7.1%、16.4%及9.7%（P0.01或P0.05）。2.幾種中藥有效成分對(duì)3T3-L1前脂肪細(xì)胞分化及相關(guān)基因表達(dá)的影響中藥有效成分對(duì)3T3-L1前脂肪細(xì)胞分化的影響:黃芪多糖、蒲黃總黃酮及羅格列酮均明顯促進(jìn)細(xì)胞的分化（與對(duì)照組比較,P0.01）;小檗堿明顯抑制脂肪細(xì)胞的分化（與對(duì)照組比較,P0.01）。各中藥有效成分組分化程度均低于羅格列酮組（與羅格列同組比較,P0.01）。中藥有效成分對(duì)3T3-L1前脂肪細(xì)胞分化相關(guān)基因表達(dá)的影響:黃芪多糖及蒲黃總黃酮明顯促進(jìn)脂肪細(xì)胞PPARmRNA的表達(dá)（P0.01）;而小檗堿組PPARm

13、RNA的表達(dá)量顯著低于對(duì)照組（P0.01）。黃芪多糖組及蒲黃總黃酮組C/BPmRNA表達(dá)量比對(duì)照組明顯上調(diào)（P0.01）;而小檗堿顯著抑制C/EBPmRNA的表達(dá)（與對(duì)照組比較,均P0.01）。各中藥有效成分組PPAR及C/EBP的mRNA表達(dá)量均低于羅格列酮組（P0.01）。3.幾種中藥有效成分對(duì)胰島素抵抗脂肪細(xì)胞胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路及脂肪細(xì)胞因子溢出的影響3H-脫氧葡萄糖的攝取試驗(yàn)檢測(cè)PI-3K信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路阻滯劑Wortmannnin干預(yù)下中藥有效成分對(duì)胰島素抵抗模型脂肪細(xì)胞葡萄糖攝取的影響:加入Wortmannin干預(yù)后,MOD組葡萄糖攝取率比同樣接受Wortmannin作用的CON組下降

14、了47.8%,黃芪多糖、小檗堿、蒲黃總黃酮及羅格列酮干預(yù)模型細(xì)胞后,葡萄糖攝取比MOD組分別增加了86.8%、190.8%、187.4%和201.1%。在各實(shí)驗(yàn)組加與不加Wortmannin的自身比較中,CON、MOD、黃芪多糖和羅格列酮組加Wortmannin后的葡萄糖攝取率比不加Wortmannin時(shí)均有降低,分別為不加Wortmannin時(shí)的60.3%、45.6%、78.3%和76.9%。而小檗堿及蒲黃總黃酮組Wortmannin干預(yù)前后的葡萄糖攝取率并未有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。Westernblot方法檢測(cè)中藥有效成分對(duì)胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路關(guān)鍵蛋白的磷酸化表達(dá)的影響:以MOD組InsR B蛋白酪氨

15、酸磷酸化表達(dá)量作為基值,各組與之相比計(jì)算InsR磷酸化表達(dá)的相對(duì)定量。胰島素抵抗模型細(xì)胞比較與正常細(xì)胞相比InsR B磷酸化表達(dá)有顯著下調(diào)（P0.01）;與MOD組比較,各中藥有效成分及羅格列酮組均使胰島素抵抗脂肪細(xì)胞模型InsR酪氨酸磷酸化表達(dá)顯著上調(diào)（P0.01）。以MOD組絲氨酸磷酸化Akt蛋白表達(dá)量作為基值,各組與之相比計(jì)算磷酸化Akt蛋白表達(dá)的相對(duì)定量。MOD組絲氨酸磷酸化Akt蛋白表達(dá)明顯下調(diào)（P0.01）;各中藥有效成分及ROS組均可不同程度的上調(diào)模型細(xì)胞Akt蛋白絲氨酸磷酸化水平,各組與MOD組比較均有顯著性差異（P0.01）。以MOD組酪氨酸磷酸化c-Cbl蛋白表達(dá)量作為基值

16、,各組與之相比計(jì)算磷酸化c-Cbl蛋白表達(dá)的相對(duì)定量。MOD組酪氨酸磷酸化c-Cbl蛋白表達(dá)顯著下調(diào)（P0.01）。各中藥有效成分及ROS組均可不同程度的上調(diào)模型細(xì)胞c-Cbl蛋白酪氨酸磷酸化水平,與MOD組比較均有顯著性差異（P0.01）。ELISA法檢測(cè)中藥有效成分對(duì)TNF、Resistin等脂肪細(xì)胞因子分泌的影響:與CON組相比,MOD組TNF的分泌有明顯上升,增加了57.6%。黃芪多糖及羅格列酮干預(yù)后,細(xì)胞培養(yǎng)液中的TNF濃度有不同程度的下降,分別比MOD組減少19.9%（P0.05）和17.4%（P0.01）。而小檗堿及蒲黃總黃酮組與MOD組相比TNF的水平未見(jiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。MOD組脂

17、肪細(xì)胞分泌Resistin的濃度與CON組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。黃芪多糖、蒲黃總黃酮及羅格列酮干預(yù)后,細(xì)胞培養(yǎng)液中的Resistin濃度有不同程度的下降,分別比MOD組減少了27.9%（P0.01）、13.7%（P0.05）和30.9（P0.01）。而小檗堿組與MOD組相比Resistin的水平未見(jiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。結(jié)論1、成熟脂肪細(xì)胞經(jīng)高糖高胰島素培養(yǎng)24h能明顯抑制其葡萄糖的攝取,可誘導(dǎo)建立胰島素抵抗細(xì)胞模型。適用于有關(guān)藥物篩選及機(jī)制研究。2、黃芪多糖、小檗堿、蒲黃總黃酮等中藥有效成分可在對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞基本無(wú)毒的安全濃度范圍內(nèi),在基礎(chǔ)及胰島素刺激狀態(tài)下不同程度增加脂肪細(xì)胞對(duì)胰島素的敏感性,改善胰島素抵抗

18、模型脂肪細(xì)胞的糖脂代謝。3、黃芪多糖及蒲黃總黃酮促進(jìn)3T3-L1前脂肪細(xì)胞的分化,上調(diào)分化相關(guān)基因PPARmRNA的表達(dá),表現(xiàn)出類似PPAR激動(dòng)劑的效應(yīng);小檗堿抑制3T3-L1前脂肪細(xì)胞的分化,減少細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)的積聚,下調(diào)脂肪細(xì)胞分化相關(guān)基因PPARmRNA和C/EBPmRNA的表達(dá),表現(xiàn)出類似PPAR抑制劑的效應(yīng)。中藥復(fù)方中不同成分的作用取向,體現(xiàn)了中藥作用的多靶點(diǎn)多途徑的特點(diǎn),為胰島素抵抗的防治提供新的思路,可以拓寬應(yīng)用中醫(yī)藥或中西醫(yī)結(jié)合方法防治胰島素抵抗的途徑。4、APS、BER、PTF可通過(guò)對(duì)胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的影響而改善胰島素抵抗。三種有效成分均可促進(jìn)胰島素刺激下胰島素受體B亞基酪氨酸磷酸