腫瘤抗原致敏樹(shù)突狀細(xì)胞治療膠質(zhì)瘤的實(shí)驗(yàn)研究

1、腫瘤抗原致敏樹(shù)突狀細(xì)胞治療膠質(zhì)瘤的實(shí)驗(yàn)研究        【摘要】     目的 研究腫瘤凍融抗原致敏樹(shù)突狀細(xì)胞（DC）治療膠質(zhì)瘤的療效。方法 從大鼠骨髓中分離出單核細(xì)胞后，加入添加rGMCSF和rIL4的IMDM培養(yǎng)基中培養(yǎng)后鑒定。制備大鼠C6膠質(zhì)瘤凍融抗原以及DC疫苗，同時(shí)腫瘤凍融抗原致敏DC體外細(xì)胞毒試驗(yàn)；建立動(dòng)物模型，體內(nèi)應(yīng)用DC疫苗并觀察療效。結(jié)果 單核細(xì)胞培養(yǎng)8天后可獲得大量的樹(shù)突狀細(xì)胞；體外細(xì)胞毒試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)對(duì)相應(yīng)的C6腫瘤細(xì)胞有明顯的殺傷作用；動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)

2、現(xiàn)治療組腫瘤生長(zhǎng)明顯抑制，而對(duì)照組腫瘤明顯生長(zhǎng)，兩組腫瘤體積有顯著性差異P<0.01。結(jié)論 建立了體外擴(kuò)增大鼠骨髓DC以及制備DC疫苗的方法,采用凍融抗原致敏DC疫苗治療荷瘤動(dòng)物生存時(shí)間明顯延長(zhǎng)，腫瘤生長(zhǎng)明顯抑制，為研究其在腦膠質(zhì)瘤臨床免疫治療打下基礎(chǔ)。     【關(guān)鍵詞】  樹(shù)突狀細(xì)胞；腦膠質(zhì)瘤；免疫治療；凍融抗原    Experimental Study of Vaccination with Dendritic Cells Pulsed with Tumor Cell Lysates for

3、 Immunotherapy of C6 GliomaLIU Zaiming, LEI Ting, NIU Hongquan, DONG Fangyong, DONG Zheng, WANG Yu, XUE DelinDepartment of Neurosurgery, Tongji hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, Wuhan 430030, ChinaAbstract：Objective  To investigate effect of dendri

4、tic cells pulsed with tumor antigens which are used to treat with intracranial glioma.Methods  dendritic cells were isolated from rat bonemarrow precursors stimulated in vitro with granulocytemacrophage colonystimulating factor (GMCSF) and interleukin4 (IL4).Then mature DCs were analyzed; Produ

5、ce lysates and dendritic cells vaccinum; then we established animal model treated with dendritic cells vaccinum. The rat brains were then removed and examined histologically,and spleens were harvested for cellmediated cytotoxicity assays.Results  Mature dendritic cells with typical cloved leafs

6、haped nucleus and long cytoplasmic dendrites, immunocytochemisty showed expressions of OX6 and OX62 were positive, cellmediated cytotoxicity assays showed that there were statistically significant compared with control cells. At necropsy, the size of neoplasm is larger in tumor than control group (P

7、<0.01).Conclusion A method to generate large number of dendritic cells from rat bonemarrow in vitro and manufacture dendritic cells vaccinum is established, and dendritic cells pulsed with lysate could inhibit significantly the growth of tumor; which may contribute to further study on the role of

8、 them in the immuntherapy of brain glioma.Key words：Dendritic cells;Glioma; Immuntherapy; Tumor lysates0  引言    樹(shù)突狀細(xì)胞（dendritic cells，DC）作為功能最強(qiáng)的抗原提呈細(xì)胞，能激活靜息型T細(xì)胞，激發(fā)初始免疫應(yīng)答。隨著DC體外誘導(dǎo)擴(kuò)增技術(shù)的發(fā)展及分子生物學(xué)技術(shù)應(yīng)用于DC瘤苗構(gòu)建方法的發(fā)現(xiàn)， DC瘤苗有望成為腫瘤免疫治療的一種有效方式。我們建立了利用大鼠骨髓分離培養(yǎng)和鑒定樹(shù)突狀細(xì)胞以及制備樹(shù)突狀細(xì)胞疫苗的方法, 并觀察了DC疫苗治療

9、腦膠質(zhì)瘤的療效，為腦膠質(zhì)瘤免疫治療提供理論基礎(chǔ)。1  材料和方法1.1  材料和試劑儀器  成年清潔級(jí)SD大鼠（雄性），體重(200±20)g，由華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。C6細(xì)胞株（同濟(jì)醫(yī)院神經(jīng)外科實(shí)驗(yàn)室提供），IMDM培養(yǎng)基、1640培養(yǎng)基、胎牛血清（Gibco 公司），rGMCSF與rIL4（Protechec 公司），SABC免疫組化染色試劑盒(博士德公司)。1.2  大鼠骨髓來(lái)源DC的提取和培養(yǎng)  斷頸處死SD大鼠,固定后消毒雙下肢，取出脛、腓骨。以下在無(wú)菌臺(tái)內(nèi)操作,70%的乙醇中及PBS漂洗。將脛、腓骨兩端剪

10、掉直止紅骨髓,用IMDM液將骨髓沖出至培養(yǎng)皿中。尼龍濾膜過(guò)濾。將過(guò)濾后的IMDM懸液離心, 加入紅細(xì)胞裂解液, 離心。細(xì)胞沉淀加入IMDM完全培養(yǎng)液, 再加入rIL4 (500U/ml,終濃度), rGMCSF (500U/ml,終濃度)。37, 5%CO2濕化培養(yǎng)。接種后2天半量換液, 第4、6 天只補(bǔ)充rIL4, rGMCSF。1.3  大鼠骨髓來(lái)源DC的鑒定  分別在第18天用相差顯微鏡觀察DC細(xì)胞。取培養(yǎng)8天的細(xì)胞離心收集細(xì)胞沉淀， 2.5%的戊二醛固定2小時(shí)， 漂洗， 置入4預(yù)冷的1%餓酸固定2小時(shí)， 梯度乙醇脫水， 包埋, 切片染色, 透射電鏡觀察。采用博士德公

11、司即用型SABC免疫組化染色試劑盒, DAB顯色對(duì)DC細(xì)胞進(jìn)行免疫組化鑒定； 同時(shí)表達(dá)OX62+,OX6+的細(xì)胞是DC細(xì)胞,  嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明進(jìn)行。1.4  大鼠C6膠質(zhì)瘤DC疫苗的制備  收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞，放入液氮中，10min后取出迅速放入37水浴完全融化再放入液氮中，反復(fù)4次。稀釋至1ml，用微孔濾膜過(guò)濾，4保存?zhèn)溆?。在培養(yǎng)4天的DC中加入C6膠質(zhì)瘤凍融抗原，比例為13。培養(yǎng)至8天收集DC并計(jì)數(shù)，既制成大鼠C6膠質(zhì)瘤DC疫苗。1.5  負(fù)載凍融抗原DC動(dòng)物實(shí)驗(yàn)體外細(xì)胞毒試驗(yàn)(MTT法)  C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞制成靶細(xì)胞。制備效應(yīng)

12、細(xì)胞, 為單純DC，DC+C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞，DC+C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞凍融抗原3組。取C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞106個(gè)接種于大鼠腹部皮下。一周后無(wú)菌取荷瘤小鼠脾臟，獲得T細(xì)胞。T細(xì)胞加RPMI1640液3 ml，10% FCS，IL2 （10U/ml，終濃度），再加入不同的3組效應(yīng)細(xì)胞，DC和T細(xì)胞為150。37，5%CO2，濕化培養(yǎng)5天，制成效應(yīng)細(xì)胞CTL。用MTT法檢測(cè)：（試劑：MTT工作液，5mg/ml；萃取液以10g SDS + 99.4mlDMSO + 0.6ml乙酸制成）將效靶細(xì)胞按101, 51, 2.51加入96孔板, 每孔靶細(xì)胞C61500個(gè),總體積100l,37×4h,振蕩培養(yǎng)。每

13、孔加入MTT工作液10l, 37×3h,振蕩培養(yǎng)。吸棄上清60l, 加入萃取液100l, 37×2h,振蕩培養(yǎng)。在酶標(biāo)儀上檢測(cè)各孔OD值，檢測(cè)波長(zhǎng)550nm,參考波長(zhǎng)620nm。CTL殺傷活性=1-實(shí)驗(yàn)組殺傷后靶細(xì)胞OD值未殺傷靶細(xì)胞OD值×100%1.6  大鼠C6腦膠質(zhì)瘤動(dòng)物模型的建立  動(dòng)物共分3組： A組，大鼠C6腦膠質(zhì)瘤動(dòng)物模型治療組； B組， 大鼠C6腦膠質(zhì)瘤動(dòng)物模型非治療組； C組， 空白組。A組10只， B組10只， C組5只。 C6腦膠質(zhì)瘤模型的建立: 稱重， 6%水合氯醛腹腔注射。大鼠麻醉后固定在立體定向手術(shù)臺(tái)上， 作右前額

14、中線旁3mm直切口， 以自制磨鉆磨開(kāi)3×3mm大小骨窗。 無(wú)菌條件下， 采用立體定向技術(shù)， 用微量進(jìn)樣器向右側(cè)頂葉皮層下2mm注射C6細(xì)胞106個(gè)（10l）。 縫合頭皮， 常規(guī)飼養(yǎng)。 A組大鼠， 在接種后第2天的C6腦膠質(zhì)瘤動(dòng)物模型皮下注射大鼠C6膠質(zhì)瘤DC疫苗0.5ml， 每只注射DC約2×106個(gè)。1.7  大鼠腦標(biāo)本的處理  A組和B組第10天及第20天取腦，C組在第1天取腦。直接取腦后-80凍存制片。以接種的部位為中心冠狀將腦組織分割成三塊，石蠟固定，制作組織病理切片，厚度為5m，常規(guī)HE染色。同時(shí)進(jìn)行組織病理切片圖像分析，顯微鏡下借助圖像分析儀

15、測(cè)量腫瘤體積V=L×S2;L和S分別代表腫瘤組織冠狀最大切面的最長(zhǎng)徑或最短徑。2  結(jié)果2.1  相差顯微鏡觀察  48h后,DC在培養(yǎng)基中呈懸浮生長(zhǎng),含用大量單核細(xì)胞和紅細(xì)胞；第35天,細(xì)胞貼壁生長(zhǎng), 紅細(xì)胞大部分消失, 單核細(xì)胞比例增加；58天后,大量懸浮細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則, 細(xì)胞有伸展的毛刺。2.2  透射電鏡  成熟的樹(shù)突狀細(xì)胞大小1520m,胞體呈不規(guī)則形態(tài),細(xì)胞表面樹(shù)狀突起。2.3  免疫組織化學(xué)技術(shù)分析  培養(yǎng)的DC細(xì)胞第8天,細(xì)胞可表達(dá)OX62+和OX6+，見(jiàn)圖1A、1B。2.4  腫瘤凍融抗

16、原致敏樹(shù)突狀細(xì)胞動(dòng)物實(shí)驗(yàn)體外細(xì)胞毒試驗(yàn)C6抗原DC為88.32%、65.49%、50.93%；C6+DC為30.76%、22.21%、15.38%；DC為20.21%、15.13%、13.67%。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析示C6抗原DC與C6+DC相比P0.01,C6抗原DC和DC相比P0.01。2.5  病理切片結(jié)果分析  組織病理切片示實(shí)驗(yàn)組可見(jiàn)腫瘤生長(zhǎng)明顯抑制，對(duì)照組腫瘤明顯生長(zhǎng)，見(jiàn)圖2、3。2.6  動(dòng)物生存曲線  對(duì)照組生存時(shí)間(19.76±10.56)天，治療組生存時(shí)間(37.68±15.23)天。兩組之間有顯著性差異P<0.01,

17、見(jiàn)圖4。圖4  動(dòng)物生存曲線（略）2.7  組織病理切片圖像分析  C6細(xì)胞接種后10天，20天后實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組各取5只大鼠測(cè)量腦內(nèi)腫瘤體積。對(duì)照組腫瘤大小(mm3)：10天 56.55±1.38，20天69.73±1.13；實(shí)驗(yàn)組腫瘤大?。?0天 11.78±0.91, 20天 21.78±1.22。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析兩對(duì)照組腫瘤體積無(wú)顯著性差異（P>0.05）, 兩治療組腫瘤體積無(wú)顯著性差異（P>0.05）,而治療組腫瘤體積顯著小于對(duì)照組（P<0.01）。3  討論   

18、 DC在機(jī)體分布廣泛但數(shù)量極少,它們只占外周血單核細(xì)胞的0.5%。DC數(shù)量甚微極大的限制了DC的研究和應(yīng)用。DC主要來(lái)源于骨髓和血液,在不同因素的作用下,分別發(fā)育成為各種類型的DC。Fresnay1報(bào)告用GMCSF和IL4體外擴(kuò)增骨髓來(lái)源DC。本實(shí)驗(yàn)選擇了同時(shí)用GMCSF和IL4協(xié)同誘導(dǎo)培養(yǎng)大鼠骨髓DC；經(jīng)過(guò)體外培養(yǎng)擴(kuò)增,從每只大鼠骨髓中可以得到8×107的DC。確定一種細(xì)胞是否為樹(shù)突狀細(xì)胞需從形態(tài)學(xué)，特異性標(biāo)志等多方面來(lái)考慮，不同的種屬其表面標(biāo)志可以不同，大鼠樹(shù)突狀細(xì)胞的表面標(biāo)志OX62+，OX6+。OX62為一粘附分子，OX6是MHC II分子。盡管MHC II分子在OX62的某

19、些細(xì)胞表達(dá)，但表達(dá)OX6和OX62的細(xì)胞一定為樹(shù)突狀細(xì)胞。一般認(rèn)為, 腦組織是免疫特赦部位，據(jù)目前的研究, 腦組織中可能存在樹(shù)突狀細(xì)胞,一些細(xì)胞在某些情況下可以轉(zhuǎn)化為樹(shù)突狀細(xì)胞。Nunez2等成功地建立腦組織來(lái)源的樹(shù)突狀細(xì)胞系A(chǔ)G116,將AG116與腫瘤抗原和T細(xì)胞一起培養(yǎng),可以促進(jìn)T細(xì)胞增殖和IL2產(chǎn)生, 增加IL6、IL12、p40的分泌。正常情況下,人腦中樹(shù)突狀細(xì)胞的功能受到抑制,這與其表面不能表CD80、CD86等分子有關(guān)3。腫瘤患者體內(nèi)DC功能缺陷，不能有效遞呈腫瘤抗原，導(dǎo)致免疫無(wú)能或免疫耐受，使腫瘤得以發(fā)生發(fā)展4。因此在臨床治療中著重于增加DC的數(shù)量和改善DC的功能,但這必須經(jīng)過(guò)

20、DC的提取,在體外培養(yǎng)、擴(kuò)增以及加入抗原制成疫苗的過(guò)程。將腫瘤相關(guān)抗原或腫瘤特異性抗原在體外對(duì)DC進(jìn)行致敏,致敏后的DC就可以有效地激活針對(duì)表達(dá)該抗原腫瘤的CTL細(xì)胞的活性，但目前多數(shù)腫瘤包括膠質(zhì)瘤都缺乏腫瘤相關(guān)抗原或腫瘤特異性抗原,且某些抗腫瘤T細(xì)胞反應(yīng)需要廣譜的抗原,而不是單一的抗原,因此目前應(yīng)用較多的還是腫瘤全抗原。Mule5報(bào)道體外用負(fù)載了腫瘤溶解物的DC作為刺激劑可訓(xùn)化同系鼠T細(xì)胞，導(dǎo)致腫瘤特異性T細(xì)胞增殖及細(xì)胞因子的產(chǎn)生；在臨床實(shí)驗(yàn)中，負(fù)載了黑色素瘤細(xì)胞溶解物和匙孔血藍(lán)蛋白（KLH）的DC疫苗免疫后產(chǎn)生了KLH特異性T細(xì)胞反應(yīng)，并產(chǎn)生記憶性CTL。Fecci6研究DC疫苗由于治療淋

21、巴瘤，多發(fā)性骨髓瘤，黑色素瘤，白血病和顱內(nèi)腫瘤有明顯效果。Liau7等人研究報(bào)告微酸洗脫腫瘤抗原肽致敏DC治療9L膠質(zhì)瘤發(fā)現(xiàn)能明顯的增長(zhǎng)動(dòng)物生存期。我們用破碎細(xì)胞的方法提取的抗原，盡管該法提取的抗原含有非免疫原性的多肽和細(xì)胞內(nèi)的溶解物，后者可導(dǎo)致自身免疫反應(yīng)，但從動(dòng)物實(shí)驗(yàn)并未見(jiàn)明顯的自身免疫反應(yīng)，比乳酸洗脫法提取抗原方法簡(jiǎn)便易行，并能明顯抑制腫瘤生長(zhǎng)8，9。本實(shí)驗(yàn)體外大量培養(yǎng)大鼠骨髓來(lái)源DC的方法和通過(guò)凍融抗原致敏樹(shù)突狀細(xì)胞制備DC疫苗的方法已建立,實(shí)驗(yàn)證明治療組荷瘤動(dòng)物的生存時(shí)間明顯延長(zhǎng)以及治療組腫瘤組織生長(zhǎng)明顯抑制，進(jìn)一步說(shuō)明DC疫苗的有效性，為深入研究腦膠質(zhì)瘤臨床免疫治療方案打下基礎(chǔ)。(

22、本文圖13見(jiàn)封2)（略）    【參考文獻(xiàn)】  1 Fresnay S, Chalmers DE. Polybrene and interleukin4: two opposing factors for retroviral transduction of bonemarrowderived dendritic cellsJ.J Gene Med, 2002,4(6):601612.2 Nunez R. Revision of the functional analysis and structural features of immorta

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