定量PCR基本原理及方法ppt課件

1、定量定量PCR基本原理及方法基本原理及方法基因有限公司基因有限公司 黃妤黃妤熒光定量熒光定量PCR基本原理基本原理熒光定量熒光定量PCR標(biāo)記方法標(biāo)記方法熒光定量熒光定量PCR不同方法學(xué)的應(yīng)用不同方法學(xué)的應(yīng)用內(nèi) 容內(nèi) 容 定量定量PCR技術(shù)的產(chǎn)生技術(shù)的產(chǎn)生1992年由年由Higuchi等人第一次報(bào)告：使用等人第一次報(bào)告：使用EB加入加入PCR反應(yīng)體系，經(jīng)改裝的帶有冷反應(yīng)體系，經(jīng)改裝的帶有冷CCD的的PCR儀檢測樣品的熒光強(qiáng)度儀檢測樣品的熒光強(qiáng)度核酸核酸 染料熒光染料熒光后來用與雙鏈后來用與雙鏈DNA有更強(qiáng)結(jié)合力的有更強(qiáng)結(jié)合力的SYBR Green I取代取代EB 熒光定量熒光定量PCR基本原理基

2、本原理Real-time ChemistriesPCR的理論方程：的理論方程：Y=x(1+ Ev)n Y：擴(kuò)增物數(shù)量；：擴(kuò)增物數(shù)量； X ：起始模板數(shù)量；：起始模板數(shù)量；Ev：擴(kuò)增效率；：擴(kuò)增效率；n：擴(kuò)增循環(huán)數(shù)擴(kuò)增循環(huán)數(shù)1. 終點(diǎn)法定量原理終點(diǎn)法定量原理前提：在最佳實(shí)驗(yàn)、循環(huán)次數(shù)前提：在最佳實(shí)驗(yàn)、循環(huán)次數(shù)n一定、一定、Ev相同相同原理：根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物的量計(jì)數(shù)反應(yīng)物中原始分子數(shù)，即：原理：根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物的量計(jì)數(shù)反應(yīng)物中原始分子數(shù)，即：lnx=lnY-nln(1+Ev)=lnY - b (b為常數(shù)為常數(shù))2. 實(shí)時(shí)檢測法定量原理實(shí)時(shí)檢測法定量原理前提：在最佳實(shí)驗(yàn)、相同前提：在最佳實(shí)驗(yàn)、相同Ev以、擴(kuò)

3、增產(chǎn)物量相同以、擴(kuò)增產(chǎn)物量相同原理：反應(yīng)物中原始分子數(shù)原理：反應(yīng)物中原始分子數(shù)X與其所需要的擴(kuò)增循環(huán)次數(shù)與其所需要的擴(kuò)增循環(huán)次數(shù)n成反比，由此計(jì)算出標(biāo)本中靶分子的準(zhǔn)確含量，即：成反比，由此計(jì)算出標(biāo)本中靶分子的準(zhǔn)確含量，即：LgX=LgYnLg(1+Ev)=b - na (a、b為常數(shù)為常數(shù)) 熒光定量熒光定量PCR的定量原理的定量原理閾值：閾值：PCR擴(kuò)增信號進(jìn)入相對穩(wěn)擴(kuò)增信號進(jìn)入相對穩(wěn)定的對數(shù)增長期時(shí)的熒光值。定的對數(shù)增長期時(shí)的熒光值。閾值閾值threshold的設(shè)定的設(shè)定PCR efficiency=10(-1/slope)-1Where slope=1/mSlope -3.322100%

4、efficiencyPCR循環(huán)在到達(dá)Ct值所在的循環(huán)數(shù)時(shí)，剛剛進(jìn)入真正的指數(shù)擴(kuò)增期對數(shù)期），此時(shí)微小誤差尚未放大，因此Ct值的重現(xiàn)性極好，即同一模板不同時(shí)間擴(kuò)增或同一時(shí)間不同管內(nèi)擴(kuò)增，得到的Ct值是恒定的。Ct值值n：擴(kuò)增循環(huán)數(shù)：擴(kuò)增循環(huán)數(shù) n: 擴(kuò)增循環(huán)數(shù)的確定擴(kuò)增循環(huán)數(shù)的確定logN=log N0 +nlogE n=Ct每個(gè)模板的每個(gè)模板的Ct值與該模板的起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在線性關(guān)系。利用已知起始拷貝值與該模板的起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在線性關(guān)系。利用已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)未知樣品的數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)未知樣品的Ct值，即可計(jì)算出該樣品的起始拷貝值，即可計(jì)算出該樣品的起

5、始拷貝數(shù)。數(shù)。 Ct值與起始模板的關(guān)系值與起始模板的關(guān)系Y軸Ct值X起始拷貝數(shù)的對數(shù)標(biāo)準(zhǔn)曲線標(biāo)準(zhǔn)曲線由系列稀釋的已知濃度的樣品做標(biāo)準(zhǔn)曲線由系列稀釋的已知濃度的樣品做標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算待測樣品的初始模板濃度計(jì)算待測樣品的初始模板濃度log N0 =-Ct logE+logN 絕對定量絕對定量未知濃度的樣品與標(biāo)準(zhǔn)曲線相比較未知濃度的樣品與標(biāo)準(zhǔn)曲線相比較l 內(nèi)摻式染料內(nèi)摻式染料 SYBR Green I, LC Greenl 序列特異性探針序列特異性探針 Taqman l Molecular Beaconsl FRETl 引物特異性探針引物特異性探針Amplifluor (Intergen)l LUX 熒

6、光定量熒光定量 PCR 標(biāo)記方法標(biāo)記方法5353SGExcitationSGSGSGSGEmission5353SGSGSGSGSGExcitationEmissionRQ53535353ExcitationRQQRQRExcitationRQExcitationRQQRExcitationEmissionOligo 1: FluoresceinOligo 2: LC Red 640ExcitationEmissionTransfer 熒光定量熒光定量PCR不同方法學(xué)的應(yīng)用不同方法學(xué)的應(yīng)用 研究目的研究目的 標(biāo)記方法標(biāo)記方法l 定量分析基因拷貝數(shù)的絕對定量，基因表達(dá)調(diào)控的相對定量）定量分析基因

7、拷貝數(shù)的絕對定量，基因表達(dá)調(diào)控的相對定量）l Sybr-Green (LC Green), Taqman, Molecular Beacon, etc 研究目的l 基因型分析基因型分析SNP、突變型分析）、突變型分析）l Taqman, Molecular Beacon, FRET, LC Greenl 熔解曲線分析熔解曲線分析l Sybr-Green, LC Green, Molecular Beacon, FRET某科研用戶使用Rotor-Gene 3000進(jìn)行基因表達(dá)檢測結(jié)果 （自備標(biāo)準(zhǔn)品，檢測樣品做復(fù)管）l 絕對定量絕對定量某科研用戶使用Rotor-Gene 3000進(jìn)行基因表達(dá)相對定

8、量分析，下圖為用Ct法得出的分析結(jié)果 。（自備標(biāo)準(zhǔn)品，檢測樣品做3次重復(fù)復(fù)管）HouseKeeper GeneGene of Interestl 相對定量相對定量利用溶解曲線進(jìn)行實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化RG3000）l 熔解曲線分析熔解曲線分析deg.737475767778798081828384858687888990919293949596979899100dF/dT.35.3.25.2.15.1.05Bin ABin BAnnealing at 60deg.737475767778798081828384858687888990919293949596979899100dF/dT1.21.11.

9、9.8.7.6.5.4.3.2.10Bin AAnnealing at 63 標(biāo)記方法標(biāo)記方法l Taqmanl 定量分析，基因型分析l Sybr-Greenl 定量分析，熔解曲線分析，基因型分析 (LC Green)l Molecular Beaconl 定量分析，熔解曲線分析，基因型分析l FRETl 定量分析，熔解曲線分析，基因型分析l Ampliflour Probe，LUXl 定量分析 基因型分析基因型分析l 利用擴(kuò)增信號的種類來分型利用擴(kuò)增信號的種類來分型 Taqmanl 根據(jù)熔解曲線的不同來分型根據(jù)熔解曲線的不同來分型 FRET, Molecular Beaconl LC Gre

10、en雙Taqman探針法檢測野生型和突變型 在基因型分析中，可采用兩種不同的Taqman探針分別針對野生型和突變型)，即一個(gè)突變型探針以一種熒光素Flr標(biāo)志，而野生型探針則用不同的熒光物Tet標(biāo)志。如果只有一種信號被擴(kuò)增出來，則樣本為對應(yīng)的基因型野生型或突變型的純合子；如二者都被有效地?cái)U(kuò)增出來，則樣本為雜合型。l 利用擴(kuò)增信號的種類來分型利用擴(kuò)增信號的種類來分型雜合型野生型突變型 FRET探針進(jìn)行熔解曲線分析確定基因型 FRET探針與模板結(jié)合時(shí)，因共振能量的傳遞而信號增強(qiáng)，而當(dāng)在Tm 值時(shí)，F(xiàn)RET探針與PCR產(chǎn)物分開，熒光信號減弱。通過實(shí)時(shí)捕捉到的PCR產(chǎn)物在熔解過程中熒光信號的變化，得到PCR產(chǎn)物的熔解曲線。因?yàn)榘l(fā)生基因突變的PCR產(chǎn)物有特定的Tm 值，通過測定探針與PCR產(chǎn)物分開時(shí)的熔解溫度Tm值，就能確定樣品的基因型。l 利用熔解曲線檢測基因突變利用熔解曲線檢測基因突變雜合型野生型突變型利用內(nèi)摻式染料進(jìn)行高分辨率熔解曲線HRM分析基因型HRM根據(jù)序列長度、GC含量和互補(bǔ)性分析樣品，可