分子克隆操作技術(shù)注意事項匯編

1、分子克隆操作技術(shù)注意事項、引物設(shè)計1 .設(shè)計模板：基因過表達的設(shè)計模板為mRNA（根據(jù)基因名稱和樣品種屬從NCBI查詢），啟動子（轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域）的設(shè)計模板為基因組DNA片段（根據(jù)基因名稱和種屬從UCSC查詢，并在NCBI核實序列），DNA甲基化分析（CpG島，根據(jù)基因名稱和種屬從UCSC查詢,并在NCBI核實序列）；2 .設(shè)計軟件：VectorNTI用于設(shè)計過表達引物，VectorNTI用于設(shè)計啟動子（轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域）克隆引物；Methprimer用于設(shè)計DNA甲基化分析引物（BSP,MSP）3 .5和3'端的酶切位點和保護性堿基所用的載體的多克隆位點（MCS）有，所克隆的序列沒有，可以

2、同時做雙酶切，我們的酶庫有，價格便宜的，加了保護性堿基可以直接進行PCR產(chǎn)物酶切的（詳情見保護性堿基.doc）;二、引物溶解1 .引物的儲液濃度為10?？贛,計算加入滅菌水的量；2 .打開管蓋前，必須先12000RPM離心2min,因為引物為粉末，容易飄出;3 .加入滅菌水溶解前，應(yīng)稍微打開管蓋即可，以免粉末飄出；4 .引物溶液應(yīng)-20C保存；5 .引物使用的工作液濃度為10口M,需要多少稀釋多少，剩余的應(yīng)丟棄；三、PCR1 .操作注意事項：操作前，應(yīng)熟知所用PCR酶的說明書，并熟知說明書標示的注意事項（弓I物、模板和酶的建議用量，變性溫度及時間，延伸速度等），PCR是極為靈敏的技術(shù)，因此要決

3、定避免交叉污染，注意冰上操作，這樣可以提高擴增的特異性；2 .理解掌握每步操作的原理和注意事項；3 .PCR實驗進行前，應(yīng)考慮以下幾個問題：引物的使用量，引物的反應(yīng)濃度一般為0.2-1PM；模板的用量，各種模板的建議用量參考PCR酶說明書，原則上第一次進行PCR反應(yīng)時，采取中間值；4.PCR常見問題及對策問題原因?qū)Σ邲]有任何條帶（白板）PCR體系中成分是否有遺漏添加重新進行實驗沒有目的條帶，但有引物二聚體反應(yīng)效率過低，其中原因可能是引物與模板的配比不合適，不是模板加得越多反應(yīng)效率就越周，退火溫度過高，導致引物與模板無法配對調(diào)整引物與模板的配比，一般按照PCR酶的說明書的建議選擇合適的引物和模板

4、的添加量，降低退火溫度有目的條帶，但產(chǎn)量低反應(yīng)效率低，其中原因可能是引物與模板的配比不合適，不是模板加得越多反應(yīng)效率就越局，退火溫度周），導致引物與模板結(jié)合配對不穩(wěn)調(diào)整引物與模板的配比，一般按照PCR酶的說明書的建議選擇合適的引物和模板的添加量，降低退火溫度有目的條帶，但有其他雜帶反應(yīng)特異性不周1,其中原因可能是引物設(shè)計存在缺陷，退火溫度較低提高退火溫度，如果目的帶與雜帶相距較遠，產(chǎn)物產(chǎn)量可以滿足下游實驗需要，可不考慮重新設(shè)計引物四、長引物退火產(chǎn)生DNA雙鏈一般通過PCR擴增所需的DNA雙鏈，如果DNA雙鏈膠短（150bp以內(nèi)），這可以通過合成互補長引物，并在引物兩側(cè)預留酶切后的酶切位點，通過

5、變性退火程序即可形成互補的DNA雙鏈，一般在制備shRNA編碼框，miRNA過表達或干擾編碼框時，可以米取上述策略；五、全基因合成如果通過PCR技術(shù)無法獲取目標DNA片段，我們一般委托DNA合成公司進行全基因合成，只需告知我們需要合成的序列，并在序列的兩側(cè)加上克隆所需的酶切位點，服務(wù)公司合成后將克隆至克隆載體中，我們收到重組克隆載體（我們自己需要進行酶切鑒定和測序鑒定），需要利用預留的酶切位點亞克隆至我們的目標載體中，然后進行酶切鑒定和測序鑒定；六、瓊脂凝膠電泳1 .作用：PCR產(chǎn)物鑒定，酶切產(chǎn)物鑒定，膠回收純化PCR或酶切產(chǎn)物；2 .膠濃度：一般為1%,根據(jù)分析產(chǎn)物的大小選擇合適的膠濃度；3

6、 .電壓：電壓高，泳動速度快，耗時短，但產(chǎn)熱量大，容易燒膠，條帶模糊，電壓低，泳動速度慢，耗時長，但產(chǎn)熱量小，條帶清晰，應(yīng)根據(jù)實際情況選擇合適的電壓；4 .電泳緩沖液：加入電泳緩沖液的量高過膠面1厘米以上，如果進行膠回收時，必須使用新的電泳緩沖液液，這是為了避免污染（電泳槽和膠槽也需清洗干凈并用超純水潤洗）和提高回收效率（舊電泳緩沖液的PH環(huán)境不利用DNA回收）；5 .理解掌握每步操作的原理和注意事項；七、酶切1 .DNA的用量：一般使用0.5lug,這樣可以保證條帶清晰，酶切充分；如果酶切產(chǎn)物中有目的條帶小于250bp使用考慮使用較多DNA進行酶切，否則目的條帶不清晰；2 .限制性內(nèi)切酶的用

7、量：根據(jù)酶的活性單位進行添加，一般lul酶含10個活性國際單位，可以在1小時內(nèi)充分酶切l(wèi)ugDNA,一般酶的用量不能超過酶切體系的1/10體積，否則產(chǎn)生星活性（酶切不特異）；3 .酶切體系：酶切總體系一般為20-303,體系大，可以使抑制酶切的因素稀釋，但做瓊脂糖凝膠電泳時需要配制較厚的膠，根據(jù)DNA的濃度和純度選擇合適的酶切體系；4 .緩沖液：根據(jù)限制性內(nèi)切酶廠家的要求選擇合適的緩沖液（buffer），進行雙酶切時，查詢廠家提供的雙酶切反應(yīng)緩沖液表格即可；5 .理解掌握每步操作的原理和注意事項；八、DNA片段純化1.PCR產(chǎn)物，酶切產(chǎn)物，酶修飾產(chǎn)物，如需進行下一步酶學操作，必須先進行純化回收

8、；2.方法：膠回收純化試劑盒或PCR產(chǎn)物回收純化試劑盒，膠回收純化試劑盒是通用試劑盒，適用于所有情況，PCR產(chǎn)物回收純化試劑盒只適用于產(chǎn)物中片段特異的情況，例如PCR產(chǎn)物特異，酶切產(chǎn)物大小特異，修飾酶產(chǎn)物；3 .進行膠回收時注意紫外線照射時間勿超過60S,否則導致DNA片段突變；4 .理解掌握每步操作的原理和注意事項；九、去磷酸化1 .單酶切的載體或目的片段進行連接時，它們各自在體內(nèi)和體外容易進行自連，為防止自連，必須利用磷酸化酶（CIP）進行去磷酸化處理；2 .理解掌握每步操作的原理和注意事項；十、磷酸化處理1 .某些情況下，如果該片段的末端沒有磷酸基團，自連是無法發(fā)生的，如需要對片段進行自

9、連，則需要利用激酶進行磷酸化處理；2 .理解掌握每步操作的原理和注意事項；d"一、DNA連接1 .載體片段與目的片段的用量：目的片段與載體片段的摩爾比應(yīng)大于3:1，小于10:1,載體片段與目的片段的總用量因大于50ng小于200ng;2 .連接體系：總連接體系一般為10-203,體系小，載體片段與目的片段的碰撞幾率提高，從而提高連接效率，在各種條件滿足的條件下，盡量進行小體系連接；3 .連接時間和連接溫度：參考連接酶的操作指南，如果片段的兩端均為粘末端，可進行室溫短時間連接，如果片段的兩端有一端或兩端為平末端，應(yīng)進行低溫長時間連接；4 .理解掌握每步操作的原理和注意事項；十二、感受態(tài)

10、細胞制備1 .感受態(tài)細胞種類：熱擊感受態(tài)細胞（CaCl2法），電擊感受態(tài)細胞（10%甘油法）；2 .細菌轉(zhuǎn)接：復蘇的細菌切勿培養(yǎng)超過16h,否則細菌太老了，活力極差；轉(zhuǎn)接比例應(yīng)控制在1:500-1:1000,這樣保證后續(xù)生長的細菌的活力，轉(zhuǎn)接培養(yǎng)體積,根據(jù)實際需要決定，但培養(yǎng)體積不可超過培養(yǎng)器皿總體積的1/3；3 .細菌生長條件：嚴格按照目的細菌的生長溫度，保證振蕩速度不低于225RPM,這樣可以保證換氧充分，生長旺盛；4 .細菌生長密度：如果進行熱擊感受態(tài)細胞制備，菌液的OD600值應(yīng)為0.2-03,肉眼觀察到現(xiàn)象為云霧狀，如果進行電擊感受態(tài)細胞制備，菌液的OD600值應(yīng)為0.5-0.6,肉

11、眼觀察到現(xiàn)象為濃云霧狀；5 .離心操作：隨著離心操作次數(shù)的增加，細菌會變得越來越脆弱和松散，所以在進行吸液操作時應(yīng)極為小心，在保證不吸走細菌的前提下，盡量移除上清；6 .無菌操作：注意無菌操作，注意別離酒精燈火焰太近，否則導致細菌燙死；7 .理解掌握每步操作的原理和注意事項；十三、轉(zhuǎn)化1 .轉(zhuǎn)化方法：熱擊轉(zhuǎn)化和電擊轉(zhuǎn)化；2 .注意事項：無菌操作，冰上操作，快速操作；3 .感受態(tài)細菌與DNA（連接產(chǎn)物或質(zhì)粒）復合時，應(yīng)把DNA加入感受態(tài)細菌中，并在冰上放置一段時間，以保證DNA與感受態(tài)細菌的表面從分接觸；4 .理解掌握每步操作的原理和注意事項；十四、平板克隆篩選1 .抗生素平板制備：加入抗生素時

12、，注意培養(yǎng)基的溫度，太高容易導致抗生素熱失活，太低容易導致培養(yǎng)基提取凝固，從而不能進行倒板操作；為控制合適的溫度，應(yīng)不時搖晃瓶子，這樣保證培養(yǎng)基的溫度與瓶子表面的溫度一致，用手感知瓶子表面的溫度，以不燙手為宜；2 .菌液涂布：加入合適的菌液并涂布均勻，菌液加多了，平板不易涂布均勻和干燥，加上轉(zhuǎn)化效率較高，則導致菌落太密,菌液加少了，平板不易涂布均勻，加上轉(zhuǎn)化效率較低，則導致菌落太稀疏，因轉(zhuǎn)化效率不能提前得知，為保證成功率，可進行梯度涂板；3 .培養(yǎng)條件：培養(yǎng)溫度按照該細菌的生長溫度，倒扣培養(yǎng)，切勿正置培養(yǎng)，培養(yǎng)時間一般不超過12-16h,否則容易長出衛(wèi)星菌（細菌發(fā)生突變了），后期加強觀察，根據(jù)

13、菌落大小隨時取出，并倒扣（并用封口膜封口）放置于4C；4 .克隆平板從4C取出時或后面的觀察和使用操作均需保證平板倒扣放置，否則平板上的冷凝水與克隆接觸，從而導致菌落交叉污染；5 .理解掌握每步操作的原理和注意事項；十五、細菌培養(yǎng)1 .接種：用牙簽挑取菌落（放置于4C下超過2周的菌落不易使用）并在培養(yǎng)基中潤洗，或用槍頭吹打甘油菌（在-80C下放置），然后槍頭在培養(yǎng)基中潤洗；培養(yǎng)體積不可超過培養(yǎng)器皿總體積的1/3；2 .培養(yǎng)條件：嚴格按照目的細菌的生長溫度，保證振蕩速度不低于225RPM,這樣可以保證換氧充分，生長旺盛；培養(yǎng)時間不要超過16小時，否則細菌老化，抗性丟失，質(zhì)粒產(chǎn)量嚴重降低；3 .理

14、解掌握每步操作的原理和注意事項；十六、質(zhì)粒提F1 .提取試劑盒：如果提取的質(zhì)粒只需進行酶切鑒定，請使用OMEGA廠家或其它國產(chǎn)生產(chǎn)廠家生產(chǎn)的小量試劑盒即可，如果提取的質(zhì)粒需進行細胞轉(zhuǎn)染，請使用QIAGEN廠家生產(chǎn)的中量提取試劑盒，這樣可以包裝足夠的產(chǎn)量和純度（超螺旋結(jié)構(gòu)，具有轉(zhuǎn)染活性）；2 .用于質(zhì)粒提取的細菌的培養(yǎng)時間不要超過16小時；3 .注意事項：不是用于提取質(zhì)粒的菌量越多，質(zhì)粒的產(chǎn)量就越多，因為質(zhì)粒提取試劑盒的每份試劑的能力是有限的，超過每份試劑的能力，反而導致產(chǎn)量減低；4 .理解掌握每步操作的原理和注意事項；十七、酶切鑒定1. DNA的用量：一般使用0.5-lug,這樣可以保證條帶清晰，酶切充分；如果酶切產(chǎn)物中有目的條帶小于250bp，使用考慮使用較多DNA進行酶切，否則目的條帶不清晰；2 .限制性內(nèi)切酶的用量：根據(jù)酶的活性單位進行添加，一般lul酶含10個活性國際單位，可以在1小時內(nèi)充分酶切l(wèi)ugDNA,一般酶的用量不能超過酶切體系的1/10體積,否則產(chǎn)生星活性（酶切不特異）；3 .酶切體系：酶切總體系一般為20-303,體系大，可以使抑制酶切的因素稀釋，但做瓊脂糖凝膠電泳時需要配制較厚的膠，根據(jù)DNA的濃度和純度選擇合適的酶切體系；4 .緩沖液：根據(jù)限制性內(nèi)切酶廠家的要求選擇合適的緩沖液（buffer），進行雙酶切時，查詢廠家提供的雙酶切反應(yīng)緩沖液表格即可；