醫(yī)藥生物技術(shù)及生物技術(shù)藥物(二)――重組蛋白質(zhì)藥物的現(xiàn)狀及發(fā)

1、 nnovatlon&Management 見疾病,如重組13一葡糖腦苷脂酶用于治療Gaucher病,艾杜糖苷酸酶用于治療I型粘多糖增多癥,a一1蛋白酶抑制劑用于先天性a一1抗胰蛋白酶缺乏癥,重組腺苷脫氨酶用于治療由阿糖腺苷酶缺陷造成的嚴重組合免疫缺陷病等。1b增強蛋白質(zhì)生物活性通路的藥物:主要通過增強血液或內(nèi)分泌通路或增強免疫反應(yīng)來達到治療作用。本組藥物多在臨床上酶,將血漿酶原降解為血漿酶的鏈激酶,凝血酶抑制常用,特別是許多細胞因子及生長因子對疾病產(chǎn)生劑重組水蛭素等。本組藥物未來的發(fā)展主要依賴于對很高的療效,如促紅細胞生成素(EPO、重組粒細蛋白質(zhì)在人類生理及藥理學(xué)功能的了解。胞集落刺激因子

2、(GCSF、各種干擾素(IFN ac、第二類:有特殊靶向活性的蛋白質(zhì)治療藥物。13、y等等。此外屬于該類的蛋白藥物還包括本類藥物以單克隆抗體、免疫球蛋白相關(guān)分子凝血劑:用于治療肺栓塞、心肌梗塞、急性缺血性為主,利用受體一配體相互作用發(fā)揮效應(yīng)的分子也包卒中、深靜脈導(dǎo)管堵塞等的阿替普酶(Activase、括其中。盡管該組藥物目前上市的品種還有限,但銷瑞替普酶(Retavase、替奈普酶(TNKase、售額增長快速,也是目前研究最多、未來最有發(fā)展前尿激酶(Abbokinase等;止血劑:如vIl a因子景的群體。根據(jù)是否直接發(fā)揮作用或僅起到運載體功(NovoSeven用于治療血友病A、B患者及使用V

3、lll用,該類藥物又被分為兩組:因子或Ix因子治療后導(dǎo)致的出血傾向;內(nèi)分泌紊2a直接干擾靶分子或靶組織功能的蛋白亂糾正劑:如治療各期骨質(zhì)疏松癥、骨痛的鮭魚降鈣質(zhì)藥物:主要是各種治療性抗體,如利妥昔單抗素、人甲狀旁腺激素等;生育及發(fā)育調(diào)節(jié)劑:如促(Rituxan、曲妥珠單抗(Herceptin、貝伐單抗卵泡激素(FSH、人絨毛膜促性腺激素(HCG、(Avastin、英夫利昔單抗(Rernicade、阿達木奧曲肽(Sandostatin、重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白一2單抗(Humira等。(關(guān)于抗體藥物將在后續(xù)連載(rhBMP2,Infuse、重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白一7中專述(rhBMP一7。osteog

4、enjcprotein7、角質(zhì)細胞生2b傳遞其他化合物或蛋白質(zhì)的藥物:該組藥長因子(KGF,Kepivance、血小板衍生的生長因物利用蛋白質(zhì)可特異性結(jié)合治療靶點(通過抗原一抗子(PDGF,Regranex等;其他:如治療焦痂、體結(jié)合或配體一受體結(jié)合方式的能力,借助蛋白質(zhì)開裂傷的重組胰蛋白酶(Granulex、治療急性代償為傳輸載體,將高毒性的小分子藥物、毒紊或同位素失調(diào)的充血性心力衰竭的血管擴張藥及利尿藥重組腦等效應(yīng)分子靶向運送到疾病部位,發(fā)揮治療作用,利鈉肽【奈西立肽,Natrecor等。也被稱為“生物導(dǎo)彈”或“導(dǎo)向藥物”。單抗及某些1C提供新功能或新活性的蛋白藥物:主要應(yīng)細胞因子是傳輸載

5、體的最佳候選者。Mylotarg是抗腫用天然存在的蛋白質(zhì)來治療人類病理生理學(xué)疾病,如瘤抗生素Calicheamicin與抗CD33單抗的偶聯(lián)物,對大分子酶促降解的膠原酶、透明質(zhì)酸酶和阿法鏈道也是第一種被批準的單抗導(dǎo)向藥物免疫偶聯(lián)物。酶,對小分子代謝物酶促降解的聚乙二醇化天冬酰胺Calicheamicin是毒性很大的高效“彈頭”,對癌細中國醫(yī)藥技術(shù)經(jīng)濟與管理l噬疆專題連載胞的殺傷作用比阿霉素強1000倍,與抗CD33單抗聯(lián)接后?？蛇x擇性地傳遞至IJCD33+的急性髓性白血病細胞并將其殺傷。對正常組織的毒副作用明顯減少。Zevalin是Yttrium一90標記的鼠源性抗體,針對的靶點是CD20抗原

6、。作為第一個用于腫瘤治療的放射免疫偶聯(lián)物,2002年被批準用于治療Rituxan無效的B 細胞性非霍奇金氏淋巴瘤。第三類:重組蛋白質(zhì)疫苗(此處略,參見本系列文章第一篇。第四類:用于診斷的重組蛋白質(zhì)藥物。該類重組蛋白質(zhì)藥物兼有藥物及診斷試劑的雙重功能,可用于某些特定疾病的體外及體內(nèi)診斷,特別是體內(nèi)診斷,如腫瘤顯像劑多用抗體偶聯(lián)上同位素,在腫瘤定位診斷的同時,同位素也可能對瘤細胞發(fā)揮抑制或殺傷作用。2重組蛋白質(zhì)藥物的特性分析蛋白質(zhì)是基因功能的執(zhí)行體,蛋白一蛋白相互作用構(gòu)成的網(wǎng)絡(luò)是生命活動的基礎(chǔ),生命體的多樣性和復(fù)雜性基于蛋白質(zhì)的多樣化及功能活性的強大?；蚪M分析顯示,人類約有2500040000種

7、基因,但由于基因的選擇性拼接及基因的翻譯后修飾(如糖基化、酰基化、磷酸化作用等,具有不同功能的蛋白質(zhì)數(shù)量超過該數(shù)字。從疾病發(fā)生機制角度分析,當任何蛋白發(fā)生突變或異常時,或當機體某種蛋白濃度過高或過低時,都會導(dǎo)致相應(yīng)疾病的發(fā)生。這意味著利用蛋白質(zhì)來治療或緩解疾病具有巨大的機會和潛力。從理論上說,蛋白質(zhì)藥物幾乎可勝任對所有發(fā)病機制清楚、病理學(xué)靶點明確的疾病的治療。與小分子藥物相比,大分子蛋白質(zhì)治療有以下幾個優(yōu)點:(1蛋白質(zhì)往往有很高的特異性和復(fù)雜的功能,這并不是簡單的化合物能模仿或替代的,因此,蛋白質(zhì)藥物對特定疾病的療效往往非常明確。(2由于蛋白質(zhì)作用的高度特異性,蛋白質(zhì)藥物干擾正常生理活動進而引

8、起副作用的可能性相對較小。(3由于很多治療用蛋白質(zhì)是人體內(nèi)天然存在的蛋白質(zhì),因此機體對其有良好的耐受性。(4對于基因突變或缺失引起的疾病,蛋白質(zhì)療法可以提供有效的替代治療,而無需基因治療。(5蛋白質(zhì)藥物的臨床發(fā)展及美國FDA批準的時間快于小分子藥物。2003年發(fā)表的一份研究報告顯示。1980年至2002:年-問FDA批準的33種蛋白質(zhì)藥物,與同一時期內(nèi)批準的294種小分子藥品相比,平均臨床研發(fā)及獲批時間快1年左右【s】。(6由于蛋白質(zhì)獨特的結(jié)構(gòu)和功能,企業(yè)能夠獲得長期有效的蛋白質(zhì)專利保護;因此,爭奪生物技術(shù)專利必將越演越烈,成為一個沒有硝煙的戰(zhàn)場。盡管眾多重組蛋白質(zhì)藥物取得巨大成功,但就蛋白本

9、身特點、生產(chǎn)過程等也均存在許多不利因素,直接影響蛋白藥物的發(fā)展,需要在研發(fā)、生產(chǎn)過程中不斷改進。Vol3.No”.November 2009InnovatLon&Management首先。蛋白質(zhì)本身特點【6】:蛋白質(zhì)的溶解性、給藥途徑、體內(nèi)分布和穩(wěn)定性等因素。將會阻礙蛋白質(zhì)藥物的成功應(yīng)用;蛋白質(zhì)都是具有親水和疏水雙重特性的大分子。不容易進入機體的細胞和其他組織,并且體內(nèi)蛋白酶和或其他的廓清機制影響治療性蛋白的半衰期使其療效大幅度降低;大分子蛋白具有良好的免疫原性,特別是當含有突變序列或異源表位時。一旦觸發(fā)免疫應(yīng)答,即可中和藥物活性,影響療效,也可能引起輸液反應(yīng),甚至過敏或自身免疫病。其次,生產(chǎn)

10、過程的挑戰(zhàn):重組蛋白質(zhì)生產(chǎn)過程復(fù)雜,要求使用特定的工程細胞類型,特別是抗體及融合蛋白類分子量大、結(jié)構(gòu)復(fù)雜的蛋白,其生理活性與翻譯后修飾密切相關(guān),因此需要使用哺乳類細胞系統(tǒng)13】。哺乳類細胞生產(chǎn)體系對軟硬件要求均很高,在工業(yè)化大規(guī)模表達、分離純化和存儲時,蛋白的穩(wěn)定性、折疊、聚集等可影響蛋白質(zhì)的生物學(xué)活性。第三。、生產(chǎn)成本過高及產(chǎn)量不足也是瓶頸,導(dǎo)致重組蛋白藥物治療費遠超過普通小分子藥物:例如,在美國,腫瘤患者一個療程治療費用,使用傳統(tǒng)化療藥物(環(huán)磷酰胺、阿霉素、甲氨蝶呤與使用單抗藥物(Herceptin西、Avastin、Erbitu(、Rituxan相比較,分別為1001600美元和5500

11、32500美元;類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA患者一年的治療費用,使用傳統(tǒng)藥物(阿斯匹林、布洛芬、甲氨喋呤、強的松與使用單抗藥物(Enbrel西、Remicade、Rituxan相比較。分別為100300美元和1500022450美元【71。3重組蛋白質(zhì)藥物的發(fā)展趨勢3.1新生物實體與新化學(xué)實體【New Chemjcal Entities, NCEs/新分子實體(New Molecular Entities, NMEs相對應(yīng),新生物實體New Biological Entities,NBEs已經(jīng)成為下一代治療藥物中最有潛力的部分f89】。經(jīng)過25年的開發(fā)。比較容易成為藥物的激素、細胞因子和生長因子、蛋白酶

12、及一部分單克隆抗體多已經(jīng)成為藥物。尋找新的藥物靶點及新生物實體、運用更復(fù)雜的技術(shù)進行改構(gòu)、突破蛋白質(zhì)藥物劑型限制等將變得更為重要和富于挑戰(zhàn)。盡管新的重組蛋白質(zhì)藥物將向更加多元化發(fā)展,下面幾方面無疑將受到更多關(guān)注:單克隆抗體已經(jīng)成為腫瘤、自身免疫性疾病、炎癥、心血管疾病、移植排斥以及感染性疾病等多種適應(yīng)癥的臨床治療藥物。并因其具有高度特異性、顯著的有效性、藥效持續(xù)時間長等越來越受到重視。自從美國FDA1986年首次批準治療性抗體(MuromomabCD3進入臨床以來,僅在美國就有21個抗體藥物已經(jīng)被批準上市。6種體內(nèi)診斷用單克隆抗體也在臨床使用。正在臨床試驗的數(shù)百個抗體藥物也顯示出巨大的發(fā)展?jié)摿?/p>

13、,治療性抗體已成為品種最多的一類生物技術(shù)藥物12,4,10。第一個治療性抗體來源于小鼠雜交瘤(后綴為omab。因經(jīng)常引起與過敏反應(yīng)類似的嚴重的輸液反應(yīng)。除與放射性同位素偶聯(lián)的鼠源性抗體仍有少量使用外?，F(xiàn)已經(jīng)基本退出臨床。利用分子生物學(xué)技術(shù),將人類Ig的序列代替嚙齒類動物的部分或絕大部分序列,產(chǎn)生了人一鼠嵌合性抗體(后綴為ximab或人源化抗體(后綴為zumab。目前臨床使用的抗體藥物多屬于此類,正在開發(fā)中的抗體分子也以人源化抗體居多。近年來,應(yīng)用人fg轉(zhuǎn)基因 小鼠XenoMouse技術(shù)或噬菌體抗體顯示技術(shù)制備的 nnovation&Management開發(fā)為藥物的機會很渺茫。為此。人們在不斷探

14、索新的蛋白結(jié)構(gòu)。如蛋白一表位模擬物(ProteinEpitope Mimetics,PEM等【12】。TNFa拮抗劑依那西普(Enbrel在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、強直性脊柱炎等慢性自身免疫病領(lǐng)域的巨大成功激發(fā)了人們研發(fā)融合蛋白的熱情及信心。Enbrel是TNFa R和IgFc段通過由簡單氨基酸組成的短肽,即連接肽(1inker聯(lián)接而成的融合蛋白,其中TNFa R作為效應(yīng)分子,可通過中和TNFnt發(fā)揮作用, Fc段作為支架或載體分子,起到穩(wěn)定及延長半衰期作用。由于對Fc的研究非常透徹,技術(shù)上較成熟,加之已經(jīng)有較多的含F(xiàn)c的抗體藥物獲準上市。因此,基于Fc的融合蛋白大量出現(xiàn)。止IcM-,也有選擇白蛋白作為

15、載體的。融合蛋白的兩個組分之間可使用或不使用連接肽。以IgFc為支架結(jié)構(gòu)的融合蛋白屬于抗體樣分子。雖然有很多優(yōu)點,但抗體類藥物生產(chǎn)費用昂貴、組織滲透率低、結(jié)構(gòu)復(fù)雜、與靶點雙價結(jié)合等固有的特點或缺點仍限制其產(chǎn)業(yè)化發(fā)展。為克服IgFc作為融合蛋白載體的局限,多種無免疫專屬性的蛋白特異性結(jié)合支架正在開發(fā)并取得令人鼓舞的成果,其中預(yù)設(shè)計錨定重復(fù)蛋白(Designed Ankyrin RepeatProteins。DARPins研究較為深入【侶、】。是具有超過現(xiàn)有抗體藥物潛能的新一代蛋白治療藥。3.2重組蛋白質(zhì)藥物的修飾第一代重組蛋白幾乎精確地復(fù)制出病人體內(nèi)缺少的蛋白作為替代藥物,但除了早期由大腸桿菌生

16、產(chǎn)的少數(shù)重組蛋白藥物完全復(fù)制天然蛋白外。只有很少的重組蛋白與天然蛋白構(gòu)成完全相同。為得到更好的藥代動力學(xué)及療效,人們有意識地探索對天然蛋白結(jié)構(gòu)進行修飾或改造,結(jié)果顯示這種修飾蛋白往往能改善蛋白的藥代動力學(xué)特性,而且人體對這些修飾的蛋白有良好的耐受性,很少引起免疫反應(yīng)并發(fā)癥【3】。各種修飾多從改變重組蛋白質(zhì)的性狀入手,如增加分子量、減緩蛋白酶降解、降低免疫原性、提高生物及化學(xué)穩(wěn)定性等,進而改善其體內(nèi)藥代動力學(xué)性質(zhì),延長體內(nèi)半衰期或加速體內(nèi)的釋放、降低中和抗體產(chǎn)生率.提高患者適應(yīng)性及治療效果等。鑒于經(jīng)過修飾的蛋白比未經(jīng)修飾的蛋白有很多優(yōu)勢,重組蛋白質(zhì)的修飾已經(jīng)廣泛應(yīng)用,各種修飾技術(shù)及方案層出不窮。

17、目前較常用的包括基因水平的生物學(xué)修飾、蛋白質(zhì)水平的化學(xué)修飾等。3。2.1基因水平的生物學(xué)修飾基因水平的生物學(xué)修飾是指對表達載體目標基因的DNA堿基進行定點突變、置換或刪除,再通過工程細胞(細菌生物合成。達到對重組蛋白質(zhì)的氨基酸序列修改的目的。該修飾方法發(fā)生在mRNA轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)翻譯前。因此不但使蛋白質(zhì)的氨基酸序列發(fā)生變化,進而也會影響已改變氨基酸序列蛋白質(zhì)的翻譯后修飾(如糖基化和二級結(jié)構(gòu)(如游離半胱氨酸形成的二硫鍵的形成等。無論選擇何種表達體系和生產(chǎn)平臺,我們?nèi)匀?很難使重組蛋白與機體輸送自然分泌蛋白的方式準確專題連載 的一致。很多蛋白具有多余的游離半胱氨酸,在高濃度的情況下非常容易形成錯配的

18、二硫鍵或生成同源多聚體;有些蛋白的氨基酸結(jié)構(gòu)還容易促使聚合物形成,進而影響蛋白功能。例如,人體胰島p細胞經(jīng)高血糖生理信號刺激后?？删_地分泌適量的胰島素,快速發(fā)揮作用;而人們用注射器在皮下注射的是高濃度胰島素,這種高濃度往往導(dǎo)致胰島素形成六聚體聚合物.使其無法有效地與胰島素受體結(jié)合。只有在胰島素逐漸播散稀釋后才可發(fā)揮療效。從而導(dǎo)致患者必須在接受注射后1530分鐘才見效。目前該問題已經(jīng)低其活性。例如嵌合抗體利妥昔單抗(Rituximab糖基化后,其抗體依賴的細胞毒作用的活性也會發(fā)通過修飾胰島素核心蛋白B鏈的C末端巧妙地解決。生變化。如將人胰島素B鏈上的第28位的脯氨酸(Pro用賴氨酸蛋白質(zhì)水平的

19、化學(xué)修飾(Lys或天門冬氨酸(Asp替代產(chǎn)生的胰島素類3.22蛋白質(zhì)水平的化學(xué)修飾是指利用化學(xué)手段對蛋似物,而其它結(jié)構(gòu)與人胰島素完全相同。氨基酸替白質(zhì)直接進行的修飾。最常見的是蛋白質(zhì)的聚乙二代后,降低了胰島素分子自聯(lián)作用,不易形成六聚醇交聯(lián),BPPEG化。蛋白質(zhì)的PEG修飾技術(shù)是近十體,皮下注射后主要以單體形式存在從而使之快速幾年發(fā)展起來的一種用于改進蛋白質(zhì)類藥物體內(nèi)藥吸收,因而產(chǎn)生了第二代速效胰島素,賴脯胰島素動學(xué)性質(zhì)的新技術(shù)。PEG修飾蛋白是將活化的PEG (HumaIog、門冬胰島素(Novolog和賴谷胰島分子鏈合到蛋白質(zhì)分子表面上,從而影響蛋白質(zhì)的素(Apldra。上述速效胰島素的聯(lián)

20、合用藥具有高空間結(jié)構(gòu)-最終導(dǎo)致蛋白質(zhì)各種生物化學(xué)性質(zhì)的改度合理性,不僅因為其蛋白分子的優(yōu)點,更因為患者變,如:化學(xué)穩(wěn)定性增加、抵抗蛋白酶水解能力提的順應(yīng)性。高、免疫原性和毒性降低或消失、血漿清除率降A(chǔ)ranesp。的成功實例可說明改變糖基化程度低、體內(nèi)半衰期延長等。的價值。由于代謝快、半衰期短,普通EPo用于慢目前研究已經(jīng)證實,PEG修飾蛋白質(zhì)技術(shù)具有性疾病引起的貧血治療時。多需要反復(fù)長期給藥。以下特點m161:半衰期延長:PEG與蛋白質(zhì)結(jié)合通過在基因水平的定點突變,置換兩個天冬酰胺殘基,可提供兩個額外的N一糖基化位點,使改造后后,由于PEG大分子的共價偶聯(lián),修飾產(chǎn)物分子量增加;由于PEG長鏈

21、結(jié)構(gòu)的屏蔽作用,使蛋白藥物I構(gòu)EPO(Aranesp富含唾液酸蛋白。與未修飾的不易被蛋白酶“捕獲”而降解。二者均使藥物在體EPO相比,Aranesp具有較低的受體親和力。但顯內(nèi)的停留時間延長-實現(xiàn)長效。安全性良好:對著延長了其生物半衰期,總體治療效果也有很大優(yōu)PEG一4000的毒性研究顯示將該聚合物制成10%的勢。2006:1,Amgen公司長效EPo Aranesp。的銷溶液,當最高劑量是PEG修飾蛋白質(zhì)正常給藥劑量的售額創(chuàng)紀錄的達到41.21億美元。遠遠超過普通EPO1ooot音時(16g/kg對小鼠、豚鼠、兔和猴都是安Epogen25.11億美元的水平。雖然大多數(shù)的蛋白質(zhì)糖基化過程都會改

22、善其藥全的。PEG修飾物的免疫原性低:PEG本身免疫源性極低,PEG與蛋白藥物結(jié)合后,其長鏈結(jié)構(gòu)可屏蔽代動力學(xué)性質(zhì),但一些重組抗體的糖基化反而會降Vol3.No1t,November2009 醫(yī)藥生物技術(shù)及生物技術(shù)藥物(二重組蛋白質(zhì)藥物的現(xiàn)狀及發(fā)展趨勢作者:朱迅, ZHU Xun作者單位:吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)院,吉林長春,130021刊名:中國醫(yī)藥技術(shù)經(jīng)濟與管理英文刊名:CHINESE JOURNAL OF PHARMACENTICAL TECHNOLGY ECONOMICS & MANAGEMENT年,卷(期:2009,3(11被引用次數(shù):2次參考文獻(18條1.Goldberg M;Gome

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