水稻是我國最主要的糧食作物之一但傳統(tǒng)的淹水 -

1、NH4+對不同基因型水稻吸收NO3-的影響學(xué)生 司江英 學(xué)號01140 導(dǎo)師 封克揚(yáng)州大學(xué)農(nóng)學(xué)院 225009水稻是我國最主要的糧食作物之一，但傳統(tǒng)的淹水栽培每畝耗水量可達(dá)400600立方米 (石元春，1997)，這對淡水資源缺乏的我國來說，無疑是限制農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的一大障礙因素。此外，水稻對氮肥利用率的偏低（通常僅20 %- 40 %）又極易發(fā)生氮的淋洗和反硝化作用，前者造成地下水污染，后者引起臭氧層的破壞。因此，發(fā)展節(jié)水灌溉栽培技術(shù)和提高水稻對氮肥的利用率作為一種戰(zhàn)略性的目標(biāo)已成為農(nóng)業(yè)科學(xué)家們的共識。水稻是生態(tài)適應(yīng)性較強(qiáng)和水分生態(tài)幅度較寬的作物，其需水量超過旱作物主要由生態(tài)需水所致。也就是

2、說，在滿足生理需水的前提下，節(jié)約生態(tài)需水是完全可能的。對此，八十年代我國就有人提出水稻旱作的概念（周毓衍 常銳1981；朱庭蕓 1986）。最近，國內(nèi)通過覆蓋減少水分蒸發(fā)的水稻旱種研究工作又有新的進(jìn)展（梁永超 等 1999）。然而，水稻一旦旱種，即意味著施入土壤的NH4-N肥在土壤通氣得以大大改善的條件下會迅速轉(zhuǎn)變?yōu)镹O3，而NO3不能象NH4那樣為土壤膠體所吸附，易被淋洗進(jìn)入地下水或通過反硝化損失，還可能通過N2O破壞臭氧層。這樣一來如何提高水稻對氮肥的利用率以及減少NO3-N對地下水的污染程度就更多地取決于水稻本身對NO3- 的吸收和利用能力這一焦點(diǎn)問題上。1 選題依據(jù)水稻對NH4+-N和

3、NO3-N都可吸收。但兩種形態(tài)的氮都存在時，不同基因水稻表現(xiàn)出完全不同的吸收特點(diǎn)。對秈稻而言，NH4+-N的存在并不降低NO-3-N的吸收，甚至還有一定的促進(jìn)作用。但NH4+-N卻可以明顯抑制粳稻對NO3-N的吸收（封克等，2000年）。為了選擇在旱作條件下對NO3-吸收和利用能力強(qiáng)的水稻基因型，通過現(xiàn)代生物技術(shù)或雜交育種手段將有關(guān)特性轉(zhuǎn)移到目標(biāo)品種中去，以達(dá)到提高氮肥利用率減輕氮污染的目的。需要探討在NH4+存在條件下，水稻對NO3-吸收和同化的機(jī)理及基因型差異。NO3-N的吸收包括三個階段：第一，NO3-從質(zhì)外體透過細(xì)胞膜進(jìn)入根細(xì)胞的跨膜運(yùn)輸過程。第二，NO3-N還原過程（涉及到硝酸還原酶

4、）。第三，還原后的同化過程（此階段與氨吸收后的同化過程相同）。顯然NH4+-N對NO3-N吸收的影響可能存在前兩過程，即跨膜吸收階段和體內(nèi)還原階段。必須區(qū)分出是通過影響與跨膜運(yùn)輸有關(guān)的因子（如膜電位、膜結(jié)構(gòu)、膜的去極化、載體對NO3-的親和能力等）造成的；還是由于進(jìn)入根細(xì)胞后，NH4+對硝酸還原酶（NR）直接抑制或通過同化產(chǎn)物再對NR造成反饋抑制造成；或是兩者共同影響的結(jié)果?？捎孟聢D表示： NH4+ 膜結(jié)構(gòu)改變？ N化合物膜電位改變？H+-ATP酶活性改變？硝酸還原酶活性改變？ 吸附位點(diǎn)親和性改變？運(yùn)轉(zhuǎn)速度改變 NO3- 體內(nèi)積累 NO3- 吸收受阻此外，就根的解剖結(jié)構(gòu)而言，水稻根皮層中靠近表

5、皮有一層厚壁細(xì)胞（如圖），這是水稻對濕生環(huán)境的適應(yīng)性表現(xiàn)。這一層厚壁的機(jī)械組織保護(hù)著皮層的通氣組織，防止根細(xì)胞中的氧徑向散失到土壤中，保證氧向根尖輸送，以此來滿足水稻在厭氧條件下正常生長。然而，這一層厚壁細(xì)胞也可能阻礙養(yǎng)分的吸收。用離子選擇電極實驗證明，當(dāng)用NH4+和NO3-同時提供給水稻時，在根尖1mm處NH4+吸收快于NO3-的吸收，在水稻根的基部地區(qū)，NH4+的吸收下降，而NO3-的吸收特點(diǎn)表現(xiàn)為在根尖的21mm處增加到最大值，繼而也趨于下降，但總的趨勢是NH4+的吸收快于NO3-，可見水稻皮層的這一層特殊的結(jié)構(gòu)與氮的吸收可能有關(guān)。研究NH4+對不同基因型水稻吸收NO3-的影響，把這一環(huán)

6、節(jié)也歸為機(jī)理研究的組成部分。目前，以不同基因型水稻為材料，將NH4+影響膜有關(guān)性質(zhì)與NO3-跨膜吸收相聯(lián)系的研究以及將水稻的解剖結(jié)構(gòu)與NO3-的吸收相聯(lián)系的研究都未有報道。開展此項研究具有重要的意義。 2 研究內(nèi)容2.1 首先區(qū)分NH4+對不同基因型水稻利用NO3的影響主要是直接影響NO3的跨膜吸收過程，還是通過影響NO3在體內(nèi)的還原過程從而進(jìn)一步間接影響NO3的吸收。2.2 研究不同基因型水稻根細(xì)胞膜上H+ATP酶的活性。2.3 研究NH4+ 對不同水稻基因型根系吸收NO3的Km值和Vmax的影響；2.4 研究水稻根系皮層最外一層厚壁細(xì)胞對NO3-、NH4+吸收的影響及基因型差異（包括明顯出

7、現(xiàn)厚壁細(xì)胞的時間及木質(zhì)化程度）。3 研究方案3.1 試驗材料 典型粳（武育粳） 典型秈（南特號） 秈雜（汕優(yōu)63） 粳雜（泗優(yōu)917）3.2 材料培養(yǎng)將四個供試水稻品種經(jīng)1% NaClO3滅菌半小時后，于0.2mmol/LCaSO4溶液中浸泡24小時，進(jìn)行催芽。播種分水培和旱作兩種水分處理，旱作水分保持在最大田間持水量的50%，置于光溫培養(yǎng)箱中，溫度為280C，每日光照12小時，光強(qiáng)4000LX。水培光溫控制如旱作，先將催芽后的種子鋪于石英沙上（石英沙間用0.2mmol/LCaSO4溶液充滿），生長至7天時，將幼苗轉(zhuǎn)移至pH6.0的營養(yǎng)液中，水稻培養(yǎng)期間，每天用稀HCl和稀NaOH調(diào)節(jié)營養(yǎng)液的

8、pH值，每天自動通氣2小時，每三天換一次營養(yǎng)液。3.3 試驗方法判定NH4+在初始階段是影響NO3的跨膜吸收，還是本身或其同化代謝產(chǎn)物通過影響NR活性等造成的反饋抑制。培養(yǎng)的水稻材料生長至18天時，轉(zhuǎn)入無氮培養(yǎng)液培養(yǎng)2天，準(zhǔn)備做吸收試驗。設(shè)不同營養(yǎng)液處理，分別為： 對照（僅含15NO3） 添加NH4+（15NO3+NH4+） 添加特異性硝酸還原酶（NR）抑制劑（15NO3+NR抑制劑）；將水稻移至上述不同營養(yǎng)液中，吸收時間設(shè)為2、5、10、15、20、30、40、60、90、120分鐘十個重復(fù)。測定： 葉片NR活性； 營養(yǎng)液中15NO3減少量； 根及地上部分15N分配情況。根據(jù)所得數(shù)據(jù)，可以明

9、確NH4+ 是否與特異性NR抑制劑一樣直接對水稻根細(xì)胞內(nèi)的硝酸還原酶活性有抑制作用；對不同基因型的影響程度有多大差異；如果對硝酸還原酶活性屬于非直接影響，那么從接觸NH4+ 開始至發(fā)生抑制作用一般需要多長時間。注：NR抑制劑采用M2WO4。利用鎢可取代硝酸還原酶輔酶中的MO而使其喪失功能的特性。細(xì)胞膜H+ATP酶活性的比較培養(yǎng)的材料，苗齡20天左右；將根切下并用去離子水沖洗。然后切成小段，加入勻漿緩沖劑在低溫下研磨。通過加入不同酶試劑。并經(jīng)高速離心、過濾等處理后分離出微球形生物膜。再經(jīng)過二相系統(tǒng)處理分離出細(xì)胞膜；利用釩酸鹽（Na3VO4）抑制H+ATP酶活性的特點(diǎn)，設(shè)加與不加Na3VO4兩個處

10、理。然后利用H+ 濃度不同會導(dǎo)致特定生化指示劑顏色深淺不同的性質(zhì)，通過比色測定出H+ATP酶的泵H+ 能力，并計算出不同水稻基因型根細(xì)胞上H+ATP酶的特征參數(shù)Km和Vmax。測定不同水稻基因型吸收NO3的特征參數(shù)（Km、 Vmax）以及加入NH4+ 對這些參數(shù)的影響。培養(yǎng)的水稻材料生長至18天時，轉(zhuǎn)入無氮培養(yǎng)液培養(yǎng)2天，用于測定根系對NO3吸收；吸收試驗采用常規(guī)耗竭法。分析純KNO3和0.2mmol/LCaSO4 溶液配制，NO3N濃度系列為0.05, 0.1 , 0.2, 0.4, 0.6, 1.0, 2.0 mmol/L，pH均為6.0。取生長均勻的健壯秧苗10株，將其根系全部插入50m

11、l的NO3N系列吸收液中吸收2小時，光溫控制與培養(yǎng)時相同。取出秧苗，用吸水紙吸干根部水分，稱取根鮮重。同時采用紫外分光光度法測定吸收液中NO3N的濃度。根據(jù)吸收前后NO3N濃度的變化量計算出單位鮮根單位時間內(nèi)NO3N的凈吸收量，即根系對NO3N的凈吸收速率。采用Michaelis-Menten方程處理數(shù)據(jù)，求得吸收的動力學(xué)參數(shù)Vmax 和Km。 此外，測定NH4+對不同水稻基因型NO3吸收動力學(xué)的影響。吸收液用分析純（NH4）2SO4、KNO3和0.2mmol/LCaSO4 溶液配制，吸收液中含1.0mmol/L的NH4+和不同濃度的NO3系列溶液（濃度如上），測定條件、測定方法與上述相同，同

12、樣可求得NH4+影響下NO3吸收動力學(xué)參數(shù)Vmax 和Km。 研究不同基因型水稻根系皮層最外一層厚壁組織培養(yǎng)的材料生長至14天左右，開始測定；分別在距根尖1mm, 5mm, 7mm, 11mm, 21mm, 61mm處取橫切面；制作半薄切片并拍照；比較不同基因型水稻明顯出現(xiàn)這一層厚壁細(xì)胞的時間，隨著根的生長，比較木質(zhì)化的程度。結(jié)合其它影響因素，為研究NH4+對不同基因型水稻NO3-的吸收提供理論依據(jù)。4 部分研究進(jìn)展 NH4+和NO3-共存時，水稻幼苗對NH4+的吸收速率明顯快于對NO3-的吸收速率。對不同水稻亞種而言，NH4+NO3-吸收速率比存在明顯的差異，粳稻幼苗是秈稻幼苗的兩倍多。在N

13、H4+吸收上，粳稻比秈稻更具優(yōu)勢；在NO3-吸收上，秈稻比粳稻更具優(yōu)勢。NO3-對水稻幼苗NH4+吸收速率的影響較小，且品種間受影響的程度相差不大。NH4+對NO3-吸收的影響較大，且對于不同水稻亞種有不同的反應(yīng)。NH4+能明顯抑制粳稻幼苗對NO3-的吸收，而對秈稻幼苗NO3-吸收的影響較小，低濃度的NH4+（< 1.0 mmol /L）甚至能促進(jìn)秈稻對NO3-的吸收。動力學(xué)研究表明， 水稻幼苗在NO3-吸收方面存在著明顯的基因型差異。有NH4+存在時，不同品種在NO3-吸收方面的差異顯得更為明顯。秈稻比粳稻、雜交稻比常規(guī)稻、旱稻比水稻在NO3-吸收方面更具優(yōu)勢。這種優(yōu)勢更多地體現(xiàn)在根系吸收NO3-的最大速率（Vmax）上。NH4+并不影響水稻幼苗根系對NO3-的親和性（Km的倒數(shù)），而只影響根系對NO3-的吸收速率。不同基因型水稻幼苗對NO3-的