人胎盤(pán)與臍動(dòng)、靜脈血造血干祖細(xì)胞歸巢相關(guān)黏附分子表達(dá)的研究

1、人胎盤(pán)與臍動(dòng)、靜脈血造血干/祖細(xì)胞歸巢相關(guān)黏附分子表達(dá)的研究 作者：蘇蕊，陳代雄，方寧，陳琦，龔芳澤【摘要】 為了評(píng)價(jià)人胎盤(pán)組織造血干/祖細(xì)胞（hematopoietic stem/progenitor cell，HSPC）的歸巢能力，采用機(jī)械法制備人胎盤(pán)組織單個(gè)細(xì)胞懸液，用流式細(xì)胞術(shù)分析胎盤(pán)組織及臍動(dòng)、靜脈血有核細(xì)胞中CD34+細(xì)胞及其亞群的含量，檢測(cè)三者來(lái)源的CD34+細(xì)胞表面歸巢相關(guān)黏附分子CD44、CD11a、CD62L、CD49d、CD49e和CD54的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，胎盤(pán)組織CD34+細(xì)胞及CD34+CD38-細(xì)胞百分率明顯高于臍動(dòng)、靜脈血；臍動(dòng)脈與臍靜脈血中HSPC百分率沒(méi)有

2、明顯差異。胎盤(pán)來(lái)源CD34+細(xì)胞高度表達(dá)黏附分子CD11a、CD49d、CD44、CD49e及CD54，其中表達(dá)CD49e及CD54水平明顯高于臍動(dòng)、靜脈血CD34+細(xì)胞。胎盤(pán)來(lái)源的CD34+CD62L+細(xì)胞百分率為(64.5815.52)%，低于臍靜脈血來(lái)源的表達(dá)。結(jié)論：人胎盤(pán)富含HSPC。胎盤(pán)來(lái)源的CD34+細(xì)胞多數(shù)黏附分子的表達(dá)水平近似或高于臍血，提示胎盤(pán)HSPC的歸巢能力有可能強(qiáng)于臍帶血。 【關(guān)鍵詞】 胎盤(pán)Expressions of Homing-Related Adhesion Molecules in Hemato-poietic Stem/Progenitor Cells De

3、rived from Human Placenta，Umbilical Cord Arterial and Venous BloodAbstract The aim of this study was to evaluate the homing capabilities of hematopoietic stem/progenitor cells (HSPCs) derived from human placenta tissues (PT). Single cell suspension of human PT was prepared by mechanical method. The

4、expression levels of homing-related adhesion molecules (HRAM) including CD11a，CD49d，CD44，CD49e，CD62L and CD54 on CD34+ cells and the percentages of CD34+ cells and their subpopulations in nucleated cells (NC) from fresh human PT，umbilical cord arterial blood (UCAB) and umbilical cord venous blood(UC

5、VB) were detected by using flow cytometry. The results showed that the percentage of CD34+cells and CD34+CD38- cells in placenta were higher than those in UCAB and UCVB. There were no significant difference in percentage of HSPC between UCAB and UCVB. Placenta-derived CD34+ cells strongly expressed

6、CD11a，CD49d，CD44，CD49e and CD54，among which expression levels of CD49e and CD54 on placenta-derived CD34+ cells were significantly higher than those on UCAB and UCVB-derived CD34+ cells. While the percentage of CD34+CD62L+ cells in placenta was only lower than that in UCVB. It is concluded that huma

7、n placenta is rich in HSPC. Moreover，the expression levels of most HRAM in CD34+ cells from PT are higher than those from UCAB and UCVB or are close to them. It suggested that HSPCs derived from PT might have stronger homing capabilities than those from UCB.Key words placenta; umbilical cord artery;

8、 umbilical cord vein; hematopoietic stem/progenitor cell; adhesion molecule; homing 自發(fā)現(xiàn)臍帶血富含造血干/祖細(xì)胞（hematopoietic stem/progenitor cell，HSPC）以來(lái)，臍血HSPC的移植已成為治療骨髓造血功能衰竭、惡性血液病、重癥免疫缺陷、某些遺傳病等疾病的重要手段1-4。但是，單份臍血所含的HSPC數(shù)量難以使一個(gè)成人獲得造血干細(xì)胞重建。因此，尋找富含HSPC的新資源是非常必要的，國(guó)內(nèi)已有學(xué)者發(fā)現(xiàn)胎盤(pán)組織中含有比臍帶血更豐富的HSPC5。作為HSPC的成功移植，除要有足夠數(shù)量的

9、HSPC外，還要求HSPC能及時(shí)、高效地歸巢至骨髓造血微環(huán)境“龕”，這對(duì)HSPC的植活與造血重建具有決定意義6。HSPC表面黏附分子的正常表達(dá)是干細(xì)胞移植時(shí)HSPC實(shí)現(xiàn)歸巢及成功植入的關(guān)鍵。本研究中，我們利用了胎兒胎盤(pán)血循環(huán)的特點(diǎn)，即臍動(dòng)脈血是由胎兒流到胎盤(pán)，而臍靜脈血?jiǎng)t是由胎盤(pán)流回胎兒，分別測(cè)定臍動(dòng)、靜脈血及胎盤(pán)組織中HSPC的含量及三者CD34+細(xì)胞表面黏附分子的表達(dá)，初步探討了胎盤(pán)HSPC的歸巢能力，以期為人胎盤(pán)HSPC最終應(yīng)用于臨床移植提供有價(jià)值的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。材料和方法主要試劑熒光標(biāo)記的CD分子系列單克隆抗體，anti-human CD34 Cy-chrome購(gòu)自美國(guó)PharMingen

10、公司。FITC標(biāo)記的CD38單克隆抗體、CD49d單克隆抗體和CD54單克隆抗體及PE標(biāo)記的CD11a單克隆抗體均購(gòu)自晶美公司，PE標(biāo)記的CD62L及CD44單克隆抗體購(gòu)自Biolegend公司，F(xiàn)ITC標(biāo)記的CD49e單克隆抗體購(gòu)自SBA公司。IMDM培養(yǎng)液為Sigma公司產(chǎn)品。胎盤(pán)和臍帶血標(biāo)本經(jīng)知情同意后，無(wú)菌采集足月分娩胎兒的胎盤(pán)和臍動(dòng)、靜脈血標(biāo)本6份，乙肝表面抗原（HBsAg）均為陰性。新生兒娩出后，在距胎兒臍部最近端結(jié)扎兩處，從中間剪斷臍帶。胎盤(pán)殘存于子宮內(nèi)，并將距胎盤(pán)最近端臍帶夾閉以防止血液流出。碘伏充分消毒臍帶，用注射器分別穿刺臍動(dòng)脈和臍靜脈，收集臍帶靜脈血及動(dòng)脈血各約5 ml于

11、收集管內(nèi)，同時(shí)收集胎盤(pán)。臍動(dòng)、靜脈血分別用肝素抗凝（終濃度均為20 U/ml），4小時(shí)內(nèi)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。胎盤(pán)細(xì)胞的制備用Hanks液沖洗除去血塊，剪碎胎盤(pán)組織，并反復(fù)沖洗，盡量除去血液。將組織塊浸泡于IMDM培養(yǎng)液，采用搓網(wǎng)法分離細(xì)胞，收集細(xì)胞懸液，用320目尼龍網(wǎng)過(guò)濾，115g離心3分鐘，收集細(xì)胞沉淀，懸浮于IMDM培養(yǎng)液中，臺(tái)盼藍(lán)染色示細(xì)胞活力95%，調(diào)整細(xì)胞濃度為1107/ml。多色熒光染色分臍動(dòng)、靜脈血組和胎盤(pán)細(xì)胞懸液組，每組樣品100 l均分別與以下熒光標(biāo)記的CD分子抗體組合進(jìn)行染色。用小鼠IgG作同型對(duì)照。 CD34PECy5 20 l，CD38FITC 10 l； CD34PECy5

12、20 l，CD49dFITC 10 l和CD11aPE 10 l； CD34PECy5 20 l，CD49eFITC 10 l和CD44PE 20 l； CD34PECy5 20 l，CD54FITC 10 l，CD62LPE 20 l。充分混勻，室溫避光靜置20分鐘。每管加入2 ml紅細(xì)胞裂解液，混勻，室溫靜置10分鐘，180g離心5分鐘，棄上清，重新懸浮細(xì)胞。每管加入2 ml含1 g/L NaN3的PBS，混勻，180g 1%的多聚甲醛，混勻，2-8避光放置，逐一上機(jī)分析。流式細(xì)胞儀檢測(cè)表面標(biāo)志應(yīng)用流式細(xì)胞儀（FACS Calibur，Becton Dickinson）對(duì)熒光染色的胎盤(pán)細(xì)胞

13、和臍動(dòng)、靜脈血樣品進(jìn)行HSPC含量及表面黏附分子表達(dá)檢測(cè)。樣品的采集和分析采用Cell Quest軟件，根據(jù)淋巴和單核細(xì)胞的大小設(shè)定CD34細(xì)胞門(mén)。統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS 11.0軟件處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，以xSD表示。若方差齊性，則采用方差分析；若方差不齊，則采用非參數(shù)檢驗(yàn)。結(jié)果CD34+細(xì)胞及其亞群的含量實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，臍動(dòng)脈血和臍靜脈血之間HPSC含量無(wú)顯著性差別，胎盤(pán)組織和臍動(dòng)脈、靜脈血中CD34+細(xì)胞百分率分別為（2.990.55）%、（1.460.39）%及（1.530.33）%，CD34+CD38-細(xì)胞百分率在胎盤(pán)組織為(1.400.53)%，顯著高于臍動(dòng)脈、靜脈血（0.080.04，0.

14、210.20)。這說(shuō)明胎盤(pán)組織中含有比臍帶血更豐富的HSPC（表1）。Table 1. Comparison in proportional distribution of hematopoietic stem/progenitor cells in nucleated cells from placenta tissues，umbilical cord arterial and venous blood（略）臍動(dòng)脈、靜脈血和胎盤(pán)組織中CD34+細(xì)胞表達(dá)黏附分子的百分率從表2可以看出，CD11a、CD49d和CD44在臍動(dòng)脈、靜脈血及胎盤(pán)組織來(lái)源的CD34+細(xì)胞中均呈現(xiàn)高表達(dá)率，但三者之間均無(wú)顯著性差異（P0.05）。胎盤(pán)組織CD34+細(xì)胞表達(dá)CD49e和CD54分子百分率分別為(85.362.68)%和(72.4411.58)%，顯著高于臍動(dòng)脈(27.1811.00 )%和(22.8913.58)%及臍靜脈血CD34+細(xì)胞表達(dá)(34.1511.61) %和(28.3913.38)%，三者之間均有非常顯著差異（P0.001，附圖）。臍動(dòng)脈、靜脈血和胎盤(pán)來(lái)源的