凍存保護(hù)劑對(duì)低溫保存的組織工程骨修復(fù)骨缺損的影響

1、凍存保護(hù)劑對(duì)低溫保存的組織工程骨修復(fù)骨缺損的影響        【摘要】     目的 探討不同方法低溫保存的組織工程骨修復(fù)節(jié)段性骨缺損的差異。方法 以骨髓基質(zhì)干細(xì)胞(marrow stromal cells，MSCs)復(fù)合部分脫蛋白骨培養(yǎng)制備組織工程骨，組織工程骨分別用添加或不添加凍存保護(hù)劑的保存液于-80深低溫凍存3個(gè)月，3個(gè)月后復(fù)溫凍存的組織工程骨。選擇60只新西蘭白兔，制作15mm長的橈骨節(jié)段性骨缺損模型，實(shí)驗(yàn)根據(jù)植入不同的材料分為A、B、C和D組。A組：骨

2、缺損區(qū)植入添加凍存劑保存的組織工程骨；B組：骨缺損區(qū)植入未添加凍存劑保存的組織工程骨；C組：骨缺損區(qū)植入未行低溫保存的組織工程骨；D組：骨缺損區(qū)植入部分脫蛋白骨。術(shù)后4、8、16周取材，行X線檢查、組織學(xué)觀察、計(jì)算機(jī)圖像分析和生物力學(xué)測定。結(jié)果 術(shù)后4、8、16周各組骨缺損區(qū)均有新骨生成，成骨量隨時(shí)間的推移而增加。經(jīng)X線、組織學(xué)和生物力學(xué)評(píng)估，A組與C組比較未見差異(P>0.05)，A組或C組分別與B組和D組比較，成骨能力依次為：A或C> B > D(P<0.001，P<0.05)，其中A或C組術(shù)后16周骨缺損完全修復(fù)，骨髓腔再通，生物力學(xué)性能接近正常骨。結(jié)論 選

3、擇適宜的凍存保護(hù)劑對(duì)組織工程骨的生物活性有一定的保護(hù)作用。     【關(guān)鍵詞】  組織工程；低溫保存；骨缺損；修復(fù)    Effect of repair of bone defect by tissue engineered bone cryopreserved by cryopreservation mediumLAN Xu,GE Baofeng,LIU Xuemei(Department of Spine Surgery,General Hospital of Lanzhou Military Co

4、mmand,PLA,Lanzhou 730050,China)Abstract： Objective To study the difference of repairing segmental bone defect by tissue engineered bone cryopreserved by various methods.Methods MSCs were cocultured with partially deproteinized bone to produce tissue engineered bone.The tissue engineered bone had bee

5、n cryopreserved at -80 with or without cryopreservation medium for 3 months and thawed 3 months later.The experimental model of 15mm radial segmental defect was produced in 60 New Zealand white rabbits，which were divided  into A,B,C,D groups according to different transplant materials.Group A:T

6、he bone defects were repaired by tissue engineered bone stored in preservation solution with cryopreservation medium.Group B: The bone defects were repaired by tissue engineered bone stored in preservation solution without cryopreservation medium.Group C: The bone defects were repaired by tissue eng

7、ineered bone without cryopreservation.Group D: The bone defects were repaired by partially deproteinized bone.When the samples were harvested 4,8,16 weeks postoperatively,a series of examination were carried out,including the roentgenographical,histomorphological,biomechanical and computerized graph

8、ical analysis.Results All of the defects which had been treated with implants exhibited new bone formation 4,8,16 weeks postoperatively,with the time being.There was no difference between the group A and C(P>0.05) ,according to radiological,histomorphological and biomechanical evaluation.The comp

9、arision study showed that ability of new bone formation in 4 groups was ranged as follows:A or C>B>D(P<0.001，P<0.05) .After 16 weeks,the defects in group A and C were bridged with the appearance of marrow cavities,the biomechanical property in implants approached to those of normal bone.

10、Conclusion The choice of proper cryopreservation solution could optimize the bioactivity of tissue engineered bone.Key words：tissue engineering;cryopreservation;bone defect;repair目前，國內(nèi)外骨庫對(duì)于異體骨和異種骨的保存積累了豐富的經(jīng)驗(yàn)，但對(duì)于組織工程骨的保存卻是一個(gè)空白點(diǎn)。相對(duì)于異體骨和異種骨的保存，組織工程骨的保存需要更為嚴(yán)格的標(biāo)準(zhǔn)。如何使保存后的組織工程骨具有較好的生物活性，需要進(jìn)行相關(guān)研究。材料與方法1 部分脫

11、蛋白骨支架材料的制備取腦死亡患者捐獻(xiàn)尸體骨的干骺端，修整為1.5cm×0.5cm×0.3cm大小。材料一側(cè)為皮質(zhì)骨，另一側(cè)保留部分松質(zhì)骨，共80塊。生理鹽水反復(fù)沖洗，-70深低溫冰箱冷凍，經(jīng)脫脂、脫細(xì)胞和部分脫蛋白處理，冷凍干燥機(jī)凍干。材料用雙層血漿袋密封包裝，環(huán)氧乙烷消毒，4冰箱冷藏保存。2 組織工程骨的制備和低溫保存取健康新西蘭白兔2只，雙側(cè)脛骨結(jié)節(jié)處備皮消毒，無菌條件下用骨穿針穿刺抽取紅骨髓8ml，加入含肝素的DMEM培養(yǎng)液（Gibco公司），混勻后加入3ml淋巴細(xì)胞分離液（Gibco公司），1800r/min離心10分鐘，吸除中間層細(xì)胞后再離心，所得細(xì)胞沉淀以1&#

12、215;106/ml密度接種于含15%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，于37、5%CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)。待細(xì)胞相互融合達(dá)90%生長面積時(shí)用0.25%胰蛋白酶（Sigma公司）消化傳代培養(yǎng)。細(xì)胞傳至3代時(shí)，移入含1×10-8mol/L地塞米松、50mg/L維生素C和1×10-2mol/L 磷酸甘油鈉的DMEM培養(yǎng)液誘導(dǎo)培養(yǎng)3天，誘導(dǎo)后的細(xì)胞表型經(jīng)鑒定為成骨樣細(xì)胞。將支架材料用DMEM培養(yǎng)液浸泡1天后棄殘液,每個(gè)支架材料以1×106/ml密度接種經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)的MSCs,于37、5%CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)7天。以含15%胎牛血清DMEM培養(yǎng)液為基本保存液，凍存保護(hù)劑的基

13、本成分為二甲亞砜(dimethylsulfoxide,DMSO) 、羥乙基淀粉和蔗糖，按照一定的濃度和比例合理搭配。組織工程骨分別用添加或不添加凍存保護(hù)劑的保存液于-80深低溫凍存3個(gè)月，3個(gè)月后復(fù)溫凍存的組織工程骨。具體降溫步驟如下：將組織工程骨分裝入含不同保存液的凍存管內(nèi)，室溫下放置1015分鐘，然后置于4 20分鐘，以-1 /min降溫至-20，保存30分鐘，再以-1 /min降溫至-80，放入深低溫冰箱保存。3個(gè)月后取出凍存管，快速置于37水浴12分鐘，直至保存液完全融化。3 不同移植材料掃描電鏡觀察各組取組織工程骨1塊，PBS漂洗3遍，戊二醛固定，酒精梯度脫水，標(biāo)本經(jīng)干燥和噴金處理后

14、，用掃描電鏡觀察細(xì)胞在材料表面的黏附和分布。掃描電鏡觀察部分脫蛋白骨的三維形態(tài)結(jié)構(gòu)。4 動(dòng)物模型和實(shí)驗(yàn)分組選擇3周齡雌性新西蘭白兔60只，體重為2.02.5kg，由衛(wèi)生部蘭州生物制品研究所提供。動(dòng)物全身麻醉后，常規(guī)消毒雙上肢，沿上肢前外側(cè)做縱行切口，長25mm，逐層切開、分離、顯露橈骨，于橈骨中上1/3交界處截骨，去除橈骨和骨膜，制造15mm長的右側(cè)肢體橈骨節(jié)段性骨缺損模型。實(shí)驗(yàn)根據(jù)植入不同的材料分為A組：骨缺損區(qū)植入添加凍存劑保存的組織工程骨；B組：骨缺損區(qū)植入未添加凍存劑保存的組織工程骨；C組：骨缺損區(qū)植入未行低溫保存的組織工程骨；D組：骨缺損區(qū)植入單純部分脫蛋白骨。5 檢測項(xiàng)目5.1 X

15、線檢查 術(shù)后4、8及16周X線攝片，根據(jù)Lane等1的X線評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)對(duì)各組移植區(qū)骨形成、骨連接和骨塑形進(jìn)行評(píng)分。術(shù)后4、8及16周處死動(dòng)物，取尺橈骨全段，觀察移植物的顏色、質(zhì)地和血管形成，與宿主骨融合和周圍軟組織分布情況。5.2 組織學(xué)觀察 標(biāo)本經(jīng)4%多聚甲醛固定后，用10%的EDTA脫鈣，常規(guī)脫水、浸蠟和包埋，石蠟切片厚度為5m，行Mansson染色，顯微鏡下觀察移植區(qū)的骨愈合情況。用MLAS醫(yī)用計(jì)算機(jī)圖像分析系統(tǒng)采集術(shù)后4周和16周的組織切片，在4倍物鏡下尋找包含移植材料的視野，計(jì)算每一視野中材料與材料內(nèi)所形成新骨的面積百分比。5.3 生物力學(xué)測定 用萬能材料試驗(yàn)機(jī)(美國Instron公司)

16、測量各實(shí)驗(yàn)組術(shù)后16周尺橈骨標(biāo)本的最大扭轉(zhuǎn)強(qiáng)度，以正常兔的尺橈骨為對(duì)照。6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 10.0軟件包對(duì)檢查結(jié)果行多個(gè)樣本均數(shù)的方差分析和兩兩比較的q檢驗(yàn)，P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果1 不同材料掃描電鏡觀察結(jié)果各組組織工程骨細(xì)胞在材料表面均可黏附，呈梭形或多角形，相鄰細(xì)胞間有突起相互連接，細(xì)胞周圍有網(wǎng)狀膠原附著。其中， A組和C組材料表面黏附大量細(xì)胞，并有較多膠原連接；B組材料表面黏附細(xì)胞較少，膠原連接很少；D組部分脫蛋白骨仍保留有原骨的骨小梁、小梁間隙和骨內(nèi)管腔系統(tǒng)，骨鹽支架的三維結(jié)構(gòu)形態(tài)依然存在。2 X線檢查2.1 X線觀察 A組和C組術(shù)后4周，截骨端有新骨形成，

17、移植材料紋理模糊；8周，大量新骨形成，移植材料邊界不清，部分髓腔再通；16周，新生皮質(zhì)骨與宿主皮質(zhì)骨自然連接，顯示出正常骨干結(jié)構(gòu)，移植材料分辨不清，髓腔再通。B組和D組術(shù)后4周，截骨端有骨痂形成，移植材料紋理清晰；8周，大量新生骨向材料中心生長，移植材料邊界不清；16周，髓腔部分再通，骨缺損存留少量移植材料。2.2 X線評(píng)分 移植區(qū)骨形成、骨連接和骨塑形的X線綜合評(píng)分，A與C組比較未見差異(P>0.05)，A組或C組分別與B組和D組比較，成骨能力依次為：A或C>B>D(P<0.001，P<0.05)，結(jié)果見表1。表1 各組骨缺損修復(fù)放射學(xué)評(píng)估（略）與A組或C組比較

18、：*P<0.05，*P<0.0013 組織學(xué)觀察A組：術(shù)后4周，移植材料周圍和內(nèi)部出現(xiàn)大量軟骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞，呈島狀生長的新生骨組織貫穿整個(gè)移植材料(圖1a)；8周，新生骨小梁周圍可見大量成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞，編織骨向板層骨過渡，移植材料逐漸被新生骨取代，骨髓腔出現(xiàn)；16周，移植材料完全被新生骨取代，骨小梁排列整齊，皮質(zhì)骨形成，骨髓腔再通。B組：術(shù)后4周，移植材料周圍有軟骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞形成，新生骨橋接移植材料和宿主骨(圖1b)；8周，骨小梁周圍出現(xiàn)大量成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞，移植材料內(nèi)部出現(xiàn)交錯(cuò)排列的編織骨，骨髓腔出現(xiàn)；16周，新生骨逐漸改建為板層骨，但不完善，骨缺損大部分被修復(fù)，仍存

19、留少量移植材料。C組：術(shù)后4周，移植材料周圍和內(nèi)部出現(xiàn)有軟骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞形成，材料周圍形成大量新生生骨(圖1c)；8周，材料周圍出現(xiàn)大量成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞，新生骨增多并向材料內(nèi)長入；16周，新生骨逐漸取代移植材料，骨髓腔出現(xiàn)，骨改建尚不完善。D組：術(shù)后4周，移植材料周圍有軟骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞形成，材料周圍形成大量新生骨，新生骨呈明顯的梯度生長，靠近界面端成骨細(xì)胞活躍，遠(yuǎn)離界面的部位成骨較少(圖1d)；8周，移植材料周圍和內(nèi)部成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞聚集，材料內(nèi)部出現(xiàn)交錯(cuò)排列的編織骨，新生骨逐漸取代移植材料；16周，移植材料被新生骨取代，骨髓腔出現(xiàn)。a.移植材料周圍和內(nèi)部出現(xiàn)大量軟骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞，呈

20、島狀生長新生骨組織貫穿整個(gè)移植材料；b.移植材料周圍有軟骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞形成，新生骨橋接移植材料和宿主骨；c.移植材料周圍和內(nèi)部出現(xiàn)有軟骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞形成，材料周圍形成大量新生骨；d.移植材料周圍有軟骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞形成，新生骨呈明顯的梯度生長圖1 術(shù)后4周，各組移植材料修復(fù)骨缺損的組織學(xué)觀察(Mansson染色 ×100)（略）4 組織形態(tài)計(jì)量學(xué)移植材料植入體內(nèi)后，隨著時(shí)間的推移，新骨形成增多，材料逐漸被降解，采集術(shù)后4周和16周的組織切片，尋找包含移植材料的視野，計(jì)算移植材料與材料內(nèi)形成新骨面積百分比，A組與C組比較未見差異(P>0.05)，A組或C組明顯低于B組和D組(

21、P<0.001，P<0.05)，間接推斷各組成骨能力依次為：A或C>B>D，結(jié)果見表2。5 生物力學(xué)測定術(shù)后16周尺橈骨力學(xué)強(qiáng)度比較，A與C組比較未見差異(P>0.05)，A組或C組明顯高于B和D組(P<0.001，P<0.05)，A組或C組術(shù)后16周尺橈骨力學(xué)強(qiáng)度接近正常尺橈骨(P>0.05），結(jié)果見表3。表2 各組骨缺損修復(fù)組織形態(tài)學(xué)分析（略）與A組或C組比較：*P<0.05，*P<0.001表3 各組骨缺損修復(fù)生物力學(xué)分析（略）與A組或C組比較：*P<0.05，*P<0.001討論低溫凍存是保存活體組織的重要方法，冷

22、凍損傷是活體組織細(xì)胞最主要的負(fù)反應(yīng)。損傷機(jī)制主要是凍融時(shí)冰晶對(duì)細(xì)胞的機(jī)械性和滲透性損傷，表現(xiàn)在以下2個(gè)方面2，3：（1）慢速冷凍過程中，細(xì)胞外液水分不斷結(jié)晶造成游離水分減少，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)外滲透壓不等，使得大量水分由細(xì)胞內(nèi)向細(xì)胞外滲出，逐漸導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)滲透壓升高，造成“溶質(zhì)性損傷”。（2）快速冷凍過程中，細(xì)胞內(nèi)水分尚未轉(zhuǎn)移到細(xì)胞外，而細(xì)胞內(nèi)外同時(shí)結(jié)冰，細(xì)胞內(nèi)冰晶機(jī)械性破壞細(xì)胞器和細(xì)胞核而導(dǎo)致細(xì)胞損傷，造成“細(xì)胞內(nèi)冰晶損傷”。目前認(rèn)為生物組織的冷凍損傷主要是“溶質(zhì)性損傷”所產(chǎn)生的滲透壓、電解質(zhì)含量和pH值的改變作用于細(xì)胞膜脂質(zhì)造成的細(xì)胞膜滲漏。在復(fù)溫過程中，細(xì)胞膜滲漏使大量水分進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)導(dǎo)致細(xì)胞水腫而

23、死亡，稱為滲透性休克4。此外，復(fù)溫過程中如復(fù)溫速率較慢，則會(huì)再次形成冰晶加重細(xì)胞損傷。由于冷凍速率越快引起細(xì)胞內(nèi)冰晶形成越多，而速率過慢又可導(dǎo)致“溶質(zhì)性損傷”。因此，低溫保存需要選擇造成損傷最輕的降溫速率。此外，復(fù)溫速率對(duì)低溫保存后細(xì)胞活力的恢復(fù)有很大影響，嚴(yán)格說復(fù)溫過程是降溫過程的逆函數(shù)5。如果沒有足夠快的復(fù)溫速率，細(xì)胞內(nèi)再次形成冰晶的概率很高。為了減輕冷凍損傷，選擇適宜的降溫和復(fù)溫速率是低溫保存的一個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)。分階段降溫比勻速降溫對(duì)細(xì)胞活力和功能影響小，因此本實(shí)驗(yàn)采用分階段降溫措施，降溫速度11.5/min，3個(gè)月后快速復(fù)溫，較好地保持了凍存細(xì)胞的活力和功能。凍存保護(hù)劑是減少冷凍損傷的另一

24、個(gè)重要方法，其保護(hù)機(jī)制可能是防凍劑與水分子形成氫鍵，使最低共熔點(diǎn)降低，從而減輕或避免了冷凍復(fù)溫過程中冰晶對(duì)細(xì)胞的損傷6。由于各種凍存保護(hù)劑的作用機(jī)制不同，單一保護(hù)劑很難達(dá)到效果理想的冷凍保護(hù)要求，目前常采用多種凍存劑組成的混合保護(hù)劑。本實(shí)驗(yàn)采用含15%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液為基本保存液，凍存保護(hù)劑的基本成分為DMSO 、羥乙基淀粉和蔗糖，3種成分按照一定濃度和比例合理搭配。DMSO具有膜通透性好和滲透性強(qiáng)等特點(diǎn)，有助于細(xì)胞克服低溫保存過程中細(xì)胞內(nèi)外滲透壓劇烈變化引起的損傷，是目前最常采用的凍存保護(hù)劑7。其作用機(jī)制是：DMSO在細(xì)胞冷凍前滲透到細(xì)胞內(nèi)，可降低培養(yǎng)液冰點(diǎn)并防止游離蛋白質(zhì)聚集，提高

25、細(xì)胞膜對(duì)水的通透性。冷凍前滲透到細(xì)胞內(nèi)的DMSO在細(xì)胞內(nèi)外產(chǎn)生一定的摩爾濃度，降低細(xì)胞內(nèi)外未結(jié)冰溶液中電解質(zhì)濃度，從而保護(hù)細(xì)胞免受高濃度電解質(zhì)損傷，同時(shí)細(xì)胞內(nèi)水分不會(huì)過度外滲，避免細(xì)胞結(jié)構(gòu)過度脫水皺縮8。羥乙基淀粉通過競爭結(jié)合水的氫原子，使冰晶生成速度減慢，減弱水的固化過程，可以降低細(xì)胞外溶質(zhì)濃度過高造成的細(xì)胞損害9。低分子不可滲透物質(zhì)蔗糖能在降溫時(shí)向細(xì)胞外轉(zhuǎn)運(yùn)細(xì)胞胞內(nèi)溶質(zhì)，而復(fù)溫時(shí)則作用相反，從而減輕細(xì)胞滲透性損傷10。目前對(duì)于混合性凍存劑的研究主要是尋找對(duì)相應(yīng)組織和細(xì)胞具有保護(hù)效果最佳、毒性最小、不同種類和不同含量凍存劑的組合。本實(shí)驗(yàn)采用DMSO 、羥乙基淀粉和蔗糖混合物為組織工程骨的凍存

26、保護(hù)劑，結(jié)果添加凍存劑組與不添加凍存劑組相比較，復(fù)溫后的組織工程骨生物活性得到了極大程度的改善，與未行低溫保存的新鮮組織工程骨相比較，其修復(fù)骨缺損的能力未見明顯下降。保存組織工程骨所應(yīng)用的降溫復(fù)溫程序和速率、凍存劑含量和配方的選擇如何才能做到最佳，并且方法簡便、經(jīng)濟(jì)和實(shí)用，這些方面均有待于進(jìn)一步研究。     【參考文獻(xiàn)】  1Lane JM,Sandhu HS.Current approaches to experimental bone graftingJ.Orthop Clin North(Am),1987,18(2):213-

27、225.2Brien FJ,Harley BA,Yannas IV,et al.Influence of freezing rate on pore structure in freezedried collagenGAG scaffoldsJ.Biomaterials，2004,25(6):1077-1086.3 Windrum P,Morris TC,Drake MB,et al.EBMT chronic leukaemia working party complications subcommittee. variation in dimethyl sulfoxide use in stem cell transplantation: a survey of EBMT centresJ.Bone Marrow Transplant,2005,36(7):601-603. 4Kotobuki N,Hirose M,Machida H,et al.Viability and osteogenic potential of cryopreserved human bone marrowderived mesenchymal cellsJ.Tissue Eng,2005,11(