異葉敗醬中三萜化合物常春藤皂苷元對(duì)人早幼粒白血病

1、異葉敗醬中三萜化合物常春藤皂苷元對(duì)人早幼粒白血病細(xì)胞HL-60的增殖抑制、周期阻滯及凋亡誘導(dǎo)的作用丁 蘭，侯 茜，徐福春，張 瓊，王 瀚，劉國(guó)安（西北師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，甘肅，蘭州，730070）摘要：利用倒置顯微鏡觀察法、臺(tái)盼藍(lán)排染法、hoechst33258熒光染色法、DNA ladder電泳以及流式細(xì)胞分析技術(shù)，檢測(cè)了從甘肅產(chǎn)異葉敗醬中分離得到的三萜化合物常春藤皂苷元（HG）對(duì)人早幼粒白血病細(xì)胞HL-60的增殖抑制、周期阻滯及凋亡誘導(dǎo)作用結(jié)果表明，常春藤皂苷元在較低濃度（1040molL-1）條件下，對(duì)HL-60細(xì)胞增殖具有良好的抑制作用；在較高濃度（4050molL-1）條件下，對(duì)

2、HL-60細(xì)胞具有致死作用；同時(shí)，常春藤皂苷元對(duì)HL-60細(xì)胞的G1期阻滯和凋亡誘導(dǎo)作用極可能是其實(shí)現(xiàn)增殖抑制和致死作用的主要途徑關(guān)鍵詞：常春藤皂苷元；人早幼粒白血病細(xì)胞；生長(zhǎng)抑制；周期阻滯；凋亡中圖分類號(hào)：Q946；Q255 文獻(xiàn)標(biāo)示碼：A 文章編號(hào)：The effect of Hederagenin，a triterpnoid from Patrinia heterophylla Bunge.on the proliferation inhibition，cell cycle arrest and apoptosisof Human promyelocytic leukemia HL-60

3、 cellsDING Lan，HOU Qian，XU Fu-chun，ZHANG Qiong，WANG Han，LIU Guo-an（College of Life Science，Northwest Normal University，Lanzhou 730070，Gansu，China）Abstract：The effects of Hederagenin（HG），a triterpnoid from Patrinia heterophylla，on the proliferation inhibition，cell cycle arrest and apoptosis of Human

4、promyelocytic leukemia HL-60 cells were measured by morphological observation，typanblue exclusion method， Hoechst 33258 stain assay，DNA ladder and flow cytometry respectively The results showed that Hederagenin could inhibit the proliferation of HL-60 at low concentrations（1040molL-1）while make the

5、cells death at the high concentrations（4050molL-1）It suggested that HG could make proliferation inhibition and cell death on HL-60 cells through G1 phase arrest and apoptosis Key words：Hederagenin；Human promyelocytic leukemia cells；cell cycle arrest；proliferation inhibition；apoptosis 基金項(xiàng)目：甘肅省教育廳科研資助

6、項(xiàng)目（0601-27）作者簡(jiǎn)介：丁蘭（1964），女，四川德陽(yáng)人，教授，博士，碩士研究生導(dǎo)師. 主要研究方向?yàn)樘烊凰幬锘瘜W(xué)與細(xì)胞工程。E-mail：dinglan異葉敗醬（Patrinia heterophylla Bunge）是敗醬科（Valerianaceae）敗醬屬（Patrinia Juss）植物多年生草本植物1，也是傳統(tǒng)中藥材墓頭回的藥源植物之一，墓頭回的另一藥源植物為糙葉敗醬，臨床上將其用于治療白血病2，3、具有很好的療效，同時(shí)墓頭回還用于治療子宮癌，子宮頸癌，胃癌病等1目前，對(duì)于上述2種植物的化學(xué)成分的研究已有了較為系統(tǒng)的報(bào)道4，5，6，其主要的化學(xué)成分為三萜類化合物，包括熊果酸

7、、齊墩果酸，敗醬皂苷和常春藤皂苷等7有關(guān)這2種植物抗腫瘤的研究主要還集中在植物粗提物的體內(nèi)外抗腫瘤測(cè)試8，9，10，如：有研究表明兩種植物的水提物對(duì)小鼠S180肉瘤抑制率達(dá)62.5%，并觀察到是直接殺傷作用8而其單體化合物的抗腫瘤研究非常有限，因而，目前尚不能知道哪種（哪些）化合物在對(duì)白血病治療過(guò)程中起著主導(dǎo)作用本課題組從甘肅隴南地區(qū)的異葉敗醬中分離得到了10余種化合物，鑒定出7個(gè)三萜化合物、2 個(gè)甾體化合物和1個(gè)三萜皂甙，并用SRB法對(duì)其中分離到的得率較高的化合物進(jìn)行體外毒性測(cè)試，部分化合物表現(xiàn)出較高的抗癌活性，但對(duì)其抗癌機(jī)理沒(méi)有進(jìn)一步研究6常春藤皂苷元(hederagenin，縮寫(xiě)為HG)

8、（化學(xué)結(jié)構(gòu)如圖一所示）是所分離的7個(gè)三萜化合物中，得率高，且細(xì)胞毒性較強(qiáng)的1種有關(guān)常春藤皂苷元抗腫瘤研究很少，李祖強(qiáng)11等用小鼠白血病細(xì)胞（L1210），人結(jié)腸癌細(xì)胞 (LS174T)等癌細(xì)胞株對(duì)山苦瓜中常春藤皂苷元成分進(jìn)行了體外細(xì)胞毒性測(cè)試，結(jié)果表明，常春藤皂苷元較好的細(xì)胞毒活性因此，進(jìn)一步研究該化合物的抗腫瘤作用及其機(jī)理，對(duì)于明晰異葉敗醬抗癌化學(xué)成分以及發(fā)現(xiàn)其中的抗癌先導(dǎo)化合物非常必要該文研究了常春藤皂苷元在不同濃度及時(shí)間條件下對(duì)人早幼粒白血病細(xì)胞HL-60的增殖、細(xì)胞周期及凋亡的影響，為進(jìn)一步闡明抗癌中藥墓頭回的抗癌成分及作用機(jī)理提供科學(xué)依據(jù)圖1 Hederagenin化學(xué)結(jié)構(gòu)式Fig

9、1 Chemical structure of Hederagenin1 材料與方法1.1 材料單體化合物常春藤皂苷元(HG)，由本課題組從甘肅隴南地區(qū)的異葉敗醬中分離得到6，將藥物溶于DMSO，在4冰箱中保存?zhèn)溆萌嗽缬琢０籽〖?xì)胞HL-60引自蘭州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院RMPI-1640培養(yǎng)基為Gibco原裝；胰蛋白酶購(gòu)自Sigma公司；新生小牛血清購(gòu)自杭州四季青生物技術(shù)有限公司；Heochst33258熒光染料，溴化乙啶（EB）購(gòu)自美國(guó)Sigma公司細(xì)胞培養(yǎng)板為美國(guó)Costar；超凈工作臺(tái)為蘇凈集團(tuán)安泰公司生產(chǎn)；二氧化碳飽和濕度恒溫箱（美國(guó)Forma Scientific）；Leitz-diav

10、ert倒置顯微鏡；Olympus熒光顯微鏡1.2 方法1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人早幼粒白血病細(xì)胞HL-60培養(yǎng)于含10%小牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液中，加青霉素100gmL-1，鏈霉素100gmL-1，置于5% CO2，37飽和濕度恒溫箱中培養(yǎng)1.2.2 HG對(duì)HL-60細(xì)胞生長(zhǎng)影響的形態(tài)學(xué)觀察 將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HL-60細(xì)胞，以5104個(gè)mL-1濃度接種于培養(yǎng)瓶中，同時(shí)加入不同濃度的HG母液，使培養(yǎng)液中HG的終濃度分別為：0，10，20，30，40，50molL-1，然后將培養(yǎng)瓶置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)分別在培養(yǎng)24h，48h，72h后取出細(xì)胞培養(yǎng)瓶，在倒置顯微鏡下觀察拍照1.2.3 生長(zhǎng)曲線

11、法測(cè)定HG對(duì)HL-60細(xì)胞增殖的影響 將濃度為5104個(gè)mL-1細(xì)胞接種與24孔板中，每孔接種1mL，每濃度設(shè)立3個(gè)平行組，接種的同時(shí)加入藥物，培養(yǎng)液藥物的終濃度分別為0，10，20，30，40，50molL-1將培養(yǎng)板置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔12h，取005mL臺(tái)盼藍(lán)染液與045mL細(xì)胞懸液充分混勻，染色5min后吸取適量細(xì)胞懸液，注入血細(xì)胞計(jì)數(shù)板小室，對(duì)活細(xì)胞計(jì)數(shù)，重復(fù)3次，取平均值以時(shí)間為橫坐標(biāo)（h），細(xì)胞數(shù)為縱坐標(biāo)（104），繪制生長(zhǎng)曲線1.2.4 Hoechst33258熒光染色法檢測(cè)HG誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞凋亡 取1105個(gè)mL-1濃度的細(xì)胞懸液，接種于6孔板中，每孔2mL，同時(shí)加入藥

12、物，6個(gè)孔中藥物的終濃度為0，10，20，30，40，50molL-1，分別于培養(yǎng)24h，48h，72h后取出，離心收集（500 rmin1），用預(yù)冷的PBS洗兩次，甲醇固定10min，再用預(yù)冷的PBS洗三次，涂片晾干用10gmL-1的Heochst33258在室溫避光下染色10min，蒸餾水沖洗3次，晾干后，熒光顯微鏡下觀察并拍照（激發(fā)波長(zhǎng)為340nm）1.2.5 DNA ladder電泳法檢測(cè)HG誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞凋亡 分別離心（800 rmin1）收集0，10，20，30，40，50molL-1濃度HG處理的HL-60細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS洗兩次，加入細(xì)胞裂解液（10 mmolL-1 Tr

13、is-Hcl，pH=8.0，10 mmolL-1EDTA，05%的TritonX-100），于50恒溫水浴鍋中消化2h后，取出離心（12 000 rmin1），取上清液在上清液中加入50 uL的RNaseA（20mgmL-1），在37下孵育1h后，加入5L的蛋白酶K（20mgmL-1），又在37下孵育1h后，取出離心10min（12 000 rmin1）上清液用 2.5 倍體積的異丙醇和 1/10 體積 0.5 molL-1 的 NaCl 溶液沉淀DNA，于20 下24h后取出，離心10min（12 000 rmin1），棄去上清液，沉淀用TE溶液溶解（10 mmolL-1Tris-Hcl，p

14、H=8.0，1mmolL-1EDTA），用15%瓊脂糖凝膠在90V恒壓下電泳25h，EB染色，UVI凝膠圖像分析儀下檢測(cè)，并用自動(dòng)成像系統(tǒng)拍照1.2.6 流式細(xì)胞儀檢測(cè)HG影響HL-60細(xì)胞周期及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡 將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HL-60細(xì)胞，以5104個(gè)mL-1接種與培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)24h后，加入藥物，終濃度為40molL-1于24，36，48，60，72h分別收集細(xì)胞，于4下75%乙醇中固定24h以上，取出后PBS洗兩遍加入PI( 5105 gmL-1)在黑暗條件下染色30min，用流式細(xì)胞儀對(duì)其進(jìn)行細(xì)胞周期和凋亡分析2 結(jié)果與討論2.1 HG對(duì)HL-60細(xì)胞生長(zhǎng)的影響如圖2所示，當(dāng)濃度為1

15、0，20，30，40molL-1的HG作用于HL-60細(xì)胞24h時(shí)，10，20，30molL-1的HG對(duì)細(xì)胞形態(tài)影響很小，與對(duì)照組相比細(xì)胞形態(tài)正常，有小細(xì)胞團(tuán)的形成，但細(xì)胞增殖有逐漸降低的趨勢(shì)；當(dāng)40molL-1藥物作用于細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞形態(tài)改變，體積縮小，細(xì)胞表面皺縮，并可見(jiàn)明顯的顆粒沉淀當(dāng)同樣藥物濃度作用于細(xì)胞48h后，10molL-1細(xì)胞形態(tài)正常，細(xì)胞克隆形成細(xì)胞團(tuán)，與對(duì)照相比沒(méi)有明顯區(qū)別；但當(dāng)20和30molL-1HG處理時(shí)，細(xì)胞團(tuán)明顯變小，細(xì)胞數(shù)變少，說(shuō)明細(xì)胞生長(zhǎng)受到明顯抑制；40molL-1使細(xì)胞形態(tài)完全改變，細(xì)胞數(shù)參考文獻(xiàn):1 南京中醫(yī)藥大學(xué)中藥大辭典(下冊(cè)) M 上海: 上?？茖W(xué)技

16、術(shù)出版社， 2006：3405-34072 劉圣，周書(shū)明墓頭回研究進(jìn)展J中國(guó)中醫(yī)藥信息雜志，1999，4(2):6-83 程衛(wèi)東，李立墓頭回的研究進(jìn)展J甘肅中醫(yī)，2006，19(10):39-414 顧正兵，楊根金，叢海英，等糙葉敗醬化學(xué)成分的研究J中草藥，2002，33(9):781-7825 馬越美，田珍，樓之岑異葉敗醬揮發(fā)油成分的分離與鑒定J中藥通報(bào)，1987，12(6):38-396 丁蘭，徐福春，王 翰，等異葉敗醬化學(xué)成分的研究及體外毒性檢測(cè)J西北師范大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2007，43(3):62-657 李延芳，樓鳳昌等敗醬屬植物的研究概況J天然產(chǎn)物研究與開(kāi)發(fā)，2001， 13(3): 71-758 張?jiān)?，王惠芬，黃澤菘，等墓頭回治療腫瘤的小鼠實(shí)驗(yàn)研究J中西醫(yī)結(jié)合雜志，1984，4(2): 109-1119 王萍，王蘭中藥墓頭回提取物抗腫瘤活性的實(shí)驗(yàn)研究J中獸醫(yī)醫(yī)藥雜志，1997，(3):7-910 孫萬(wàn)里，姚小健，卯新民，等MTT檢測(cè)墓頭回對(duì)白血病細(xì)胞毒作用的實(shí)驗(yàn)研究J甘肅中醫(yī)學(xué)院院報(bào)，1990，7(3):34-3511 李祖強(qiáng)，羅 蕾，凌 敏山苦瓜的抗癌活性