分別抗HER2和FGFR2的人源單域抗體的篩選及鑒定研究

1、分別抗HER環(huán)口FGFR2勺人源單域抗體的篩選及鑒定研究目的:HER2和FGFR遇白在多種癌細(xì)胞內(nèi)過表達(dá)，與多種癌癥的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移有關(guān),是癌癥治療的理想靶標(biāo)。雖然已有抗HER2勺抗體藥上市用于癌癥治療,但這些都是傳統(tǒng)的單克隆抗體。由于單克隆抗體是大分子蛋白,其應(yīng)用受到很大限制。本論文篩選抗HER2的新型的小分子人源單域抗體,希望能代替上市的單克隆抗體藥物。另外,也篩選抗FGFR2勺新型的小分子人源單域抗體。方法：第一部分,篩選抗HER2勺人源單域抗體。采用輔助噬菌體侵染制備人源單域抗體噬菌體文庫,采用原核細(xì)胞包涵體表達(dá)方法制備和純化HER2-domainII蛋白片段。采用噬菌體展示技術(shù)和H

2、ER2-domainII蛋白片段作為抗原篩選人源單域抗體文庫。經(jīng)過5輪文庫的篩選富集后,采用多克隆噬菌體ELISA和單克隆噬菌體ELISA方法進(jìn)一步篩選抗HER2-domainII的單域抗體，并獲得單域抗體的DNAff列。采用原核細(xì)胞可溶性表達(dá)方法制備和純化抗HER2-domainII的單域抗體蛋白，采用ELISA鑒定純化的單域抗體與HER2-domainII的結(jié)合能力，采用非競爭性ELISA檢測(cè)單域抗體與HER2-domainII的親和力。第二部分，篩選抗FGFR2勺人源單域抗體。采用輔助噬菌體侵染制備人源單域抗體噬菌體文庫，通過人工合成的方法制備FGFR2s白片段。采用噬菌體展示技術(shù)篩選抗

3、FGFR2s白片段的單域抗體，經(jīng)過5輪文庫的篩選富集后,采用多克隆噬菌體ELISA和單克隆噬菌體ELISA方法進(jìn)一步篩選抗FGFR2S白片段的單域抗體，并獲得單域抗體的DNAJ列。結(jié)果：第一部分，篩選抗HER2勺人源單域抗體。利用輔助噬菌體侵染制備了滴度為3.41Xl013/ml的人源單域抗體噬菌體文庫。通過原核細(xì)胞包涵體表達(dá)純化得到了HER2-domainII蛋白,SDS-PAG由泳圖顯示較高的蛋白純度；非還原性SDS-PAG也泳圖顯示HER2-domainII蛋白約為12kDa。經(jīng)過噬菌體展示技術(shù)5輪篩選后,抗HER2-domainII的單域抗體的滴度逐漸上升。采用多克隆噬菌體ELISA檢

4、測(cè)發(fā)現(xiàn)第3輪富集的單域抗體具有最強(qiáng)的的結(jié)合能力。從篩選后的文庫里隨機(jī)挑選196個(gè)單域抗體克隆,采用單克隆噬菌體ELISA檢測(cè)得到了8個(gè)陽性單域抗體；采用單克隆噬菌體ELISA和多個(gè)無關(guān)抗原檢測(cè)發(fā)現(xiàn)這8個(gè)陽性單域抗體能與HER2-domainII特異性結(jié)合。對(duì)于這8個(gè)陽性單域抗體的DNAM序發(fā)現(xiàn)只有2個(gè)不同的單域抗體（分別命名為aHER2-1C便口aHER2-2B4）。將這2個(gè)單域抗體克隆到pET22bg達(dá)載體內(nèi)進(jìn)行可溶性表達(dá)純化，SDS-PAGE電泳圖顯示得到了較高純度的蛋白。ELISA檢測(cè)發(fā)現(xiàn)純化的aHER2-1C1能與HER2-domainII結(jié)合，而純化的aHER2-2B4ttHER2-

5、domainII結(jié)合的能力弱。采用非競爭性ELISA檢測(cè)發(fā)現(xiàn)aHER2-1CWHER2-domainII結(jié)合的親和力為3.76uM。第二部分，篩選抗FGFR2勺人源單域抗體。通過人工合成白方法得到了FGFR2s白片段，高效液相色譜顯示較高的蛋白純度，質(zhì)譜分析顯示FGFR2S白片段約為4kDa。經(jīng)過噬菌體展示技術(shù)對(duì)人源單域抗體噬菌體文庫進(jìn)行了5輪篩選,采用多克隆噬菌體ELISA檢測(cè)發(fā)現(xiàn)第5輪富集的單域抗體具有最強(qiáng)的的結(jié)合能力。從篩選后的文庫里隨機(jī)挑選168個(gè)單域抗體克隆,采用單克隆噬菌體ELISA檢測(cè)得到了20個(gè)陽性單域抗體；采用單克隆噬菌體ELISA和多個(gè)無關(guān)抗原檢測(cè)發(fā)現(xiàn)這20個(gè)陽性單域抗體能與FGFR2g白片段特異性結(jié)合。對(duì)于這20個(gè)陽性單域抗體的DNA1U序發(fā)現(xiàn)只有2個(gè)不同的單域抗體（分別命名為aFG-7E用口aFG-9