慢病毒包裝試劑盒說明書

1、YRGene慢病毒包裝試劑盒說明書產(chǎn)品編號(hào)：LPK010產(chǎn)品規(guī)格：10個(gè)10cm皿產(chǎn)品簡(jiǎn)介：贏潤(rùn)生物的慢病毒包裝試劑盒包括如下成分：（1）優(yōu)化配比的慢病毒包裝輔助質(zhì)?；旌衔?，可兼容大多數(shù)慢病毒表達(dá)載體。（2） 高效轉(zhuǎn)染試劑（Invitrogen Lip2000原裝產(chǎn)品分裝，293T細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率接近 100%）。（3 ）高效率的慢病毒濃縮液，無需超速離心，也不需要價(jià)格昂貴的過濾柱，快速富集病毒粒子，其優(yōu) 勢(shì)在于操作安全簡(jiǎn)單，對(duì)設(shè)備要求低，產(chǎn)毒效率高，能夠快速、高效地收獲高滴度病毒。產(chǎn)品組成：慢病毒包裝步驟產(chǎn)品名稱規(guī)格每平皿用量使用次數(shù)貯藏條件YRGe ne Len tiviral Mix（包裝質(zhì)

2、?；旌衔铮?20ul15ul1012 次-20 CLip2000轉(zhuǎn)染試劑300ul30ul10次4CConcen Soluti on（慢病毒濃縮液）30 ml3ml1011 次4C1. 轉(zhuǎn)染前，傳代 293FT細(xì)胞于10cm培養(yǎng)皿中（例如，接種 1 x 107細(xì)胞于10cm培養(yǎng)皿中，使用完全 培養(yǎng)基DMEM+10%FBS 培養(yǎng)），當(dāng)細(xì)胞密度能夠達(dá)到 90-95%即可進(jìn)行轉(zhuǎn)染。Tips :培養(yǎng)基里面不要添加抗生素。2. 轉(zhuǎn)染前1-3小時(shí)，更換培養(yǎng)基，加入7ml新鮮的完全培養(yǎng)基（DMEM+10%FBS ）,注意不要添加抗生素。3. 準(zhǔn)備轉(zhuǎn)染。在5ml離心管中，分別配制 A管與B管試劑（Tube A

3、 and Tube B）Tube ATube BOpti-MEM I Medium1.5 mlOpti-MEM I Medium1.5 mlYRGe ne Len tiviral Mix20ulLip200030ul慢病毒表達(dá)載體（客戶自行準(zhǔn)備，大提質(zhì)粒）10ug配好后，放置5min，然后將A管緩慢加入B管，混合均勻。室溫放置20min，使得脂質(zhì)體-DNA混合物形成。Tips :混合后可能會(huì)出現(xiàn)淡淡的乳白狀，不會(huì)影響轉(zhuǎn)染。然后將混合液逐滴均勻加入10cm培養(yǎng)皿，輕微混勻。置于37C, 5% CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。4. 第三天，更換培養(yǎng)基，加入10ml的完全培養(yǎng)基，同樣注意不要加抗生素。5.

4、轉(zhuǎn)染后48-72h后收取上清，轉(zhuǎn)移至 15ml離心管。Tips :上清里面含有病毒，請(qǐng)小心操作。6. 3000rpm在4C離心15min，去除沉淀。7. 上清液用0.45卩m濾器過濾后轉(zhuǎn)移到新的離心管中。慢病毒濃縮：1. 每10ml過濾后的病毒初始液，加入Concen Solution 3ml，每20-30min混合一次，共進(jìn)行 3-5次。2. 4C放置過夜。3. 4C, 3000 g,離心 45min。4. 去掉上清，靜置管子1-2min，吸走殘余液體。5. 加入無血清DEME充分溶解慢病毒沉淀。6. 病毒懸液分裝成200卩l(xiāng)每份，保存在離心管中，速凍后儲(chǔ)存在-80 C。慢病毒滴度測(cè)定：進(jìn)行

5、慢病毒感染實(shí)驗(yàn)之前，我們強(qiáng)烈建議您進(jìn)行慢病毒滴度檢測(cè)。41. 在滴定測(cè)定的前一天取48孔板，每孔接種 3X 10 293FT細(xì)胞。2. 加polybrene到新鮮的完全培養(yǎng)基中，使其終濃度為8卩g/ml。3. 加含有polybrene的完全培養(yǎng)基10倍稀釋病毒。具體操作如下：取一個(gè) 1.5ml離心管（或96孔板）,加入90卩l(xiāng)培養(yǎng)基和10卩l(xiāng)待測(cè)病毒原液，混合均與后吸取10卩l(xiāng)病毒混合液至第二個(gè)離心管（或96孔板第二個(gè)孔），混合時(shí)盡量不要產(chǎn)生氣泡，如此稀釋至第八個(gè)孔（即稀釋105倍）。4.各Titer1 i l0.1 110.01 110.001 i l0.0001 i lVirus Stock1010101010Medium with8 i g/ml polybrene9090909090Load volume101010101010病稀 液 對(duì)的48孔中，置于37C, 5% CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，16h-24h后用新鮮的完全培養(yǎng)基換液。?。? l毒釋到應(yīng)5.轉(zhuǎn)染后72h，用熒光顯微鏡技術(shù)熒光細(xì)胞數(shù)量（如果觀察不清晰可以先用PBS換液后再進(jìn)行觀察）。一般情況下，在最高稀釋度10m的孔數(shù)出現(xiàn)N（N10，則需要繼續(xù)稀釋。注意事項(xiàng):1. 細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)對(duì)于病毒包裝至關(guān)重要，因此需保證良好的細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)和較少的細(xì)胞傳代次數(shù)。2.