凱基TUNEL細(xì)胞凋亡原位檢測(cè)試劑盒

1、凱基TUNEL細(xì)胞凋亡原位檢測(cè)試劑盒通用BIOTIN標(biāo)記POD法,適用于細(xì)胞、組織樣本使用說(shuō)明書一、TUNEL制品說(shuō)明凱基TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒是用來(lái)檢測(cè)細(xì)胞在凋亡過(guò)程中細(xì)胞核DNA的斷裂情況,其原理是生物素biotin 標(biāo)記的dUTP在脫氧核糖核苜酸 末端轉(zhuǎn)移酶TdT Enzyme 的作用下,可以連接到凋亡細(xì)胞中斷裂的 DNA的3OH末端,并可與連接了的辣根過(guò)氧化酶的鏈霉親和素 Streptavidin-HRP 特異結(jié)合,在辣根過(guò)氧化酶底物二氨基聯(lián)苯胺DAB的存在下,產(chǎn)生很強(qiáng)的 顏色反響呈深棕色,特異準(zhǔn)確地定位正在凋亡的細(xì)胞,因而在普通顯微鏡下 即可觀察和計(jì)數(shù)凋亡細(xì)胞；由丁正常的或正在

2、增殖的細(xì)胞幾乎沒(méi)有 DNA的斷裂, 因而沒(méi)有3-OH形成,很少能夠被染色.本試劑盒適用丁組織樣本石蠟包埋、冰凍和超薄切片和細(xì)胞樣本細(xì)胞 涂片的凋亡原位檢測(cè).本試劑盒特點(diǎn) 操作簡(jiǎn)便：使用 Ready-to-Use 型試劑,并配有 Proteinase K 和DAB.高靈敏度：可以單一檢出初期的凋亡細(xì)胞.高特異性：能特異性染色凋亡細(xì)胞.快速操作：整體操作約需3小時(shí).用途廣泛：可應(yīng)用于組織切片、細(xì)胞樣本等.方便觀察：使用光學(xué)顯微鏡觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果.高正確性：有陽(yáng)性對(duì)照片的制備方法,可以確認(rèn)試劑盒的有效性使用本卷須知1. 使用前請(qǐng)認(rèn)真閱讀本說(shuō)明書,提前準(zhǔn)備好相關(guān)試劑.2 .因本試劑盒中組分均為微量,使用前

3、請(qǐng)離心集液.3. 為預(yù)防試驗(yàn)誤差、降低試劑的損耗,建議使用精密度高的進(jìn)口微量移液槍與 槍頭.4 . TdT酶反響液最好在使用前根據(jù)樣本數(shù)量集中配制,再分別滴加于各樣本片 上,預(yù)防每個(gè)樣本單獨(dú)配制而產(chǎn)生的試劑損耗.5. 為預(yù)防樣本脫落,請(qǐng)使用硅烷( Silane )處理的載玻片或采用多聚賴氨酸鋪片.6. 固定好的樣本可以在-20 C的70%乙醇中放置30分鐘或至過(guò)夜,以改善細(xì)胞的滲透性.7. 使用PBS清洗細(xì)胞樣本時(shí),不要直接加在細(xì)胞樣本上,以預(yù)防細(xì)胞樣本的脫落.8. 進(jìn)行PBS清洗時(shí),以5分鐘清洗3次為標(biāo)準(zhǔn).9. DAB為固體粉末,使用前參加 PBS配制成20 X DAB (10 mg/ml

4、)后, 按說(shuō)明書顯色使用.二、TUNEL試劑盒組分組份Cat:KGA70220 assaysCat:KGA70350 assaysCat:KGA704100 assays儲(chǔ)存條件EquilibrationBuffer1.0 mL2.5 mL5.0 mL-20 CBiotin-11-dUTP20山50此100 pL-20 CTdT Enzyme80山200 pL400 pL-20 C50 x Proteinase K40山100 pL200 pL-20 CStreptavidin-HRP10山25此50 pL4C避光DAB2mg5mg10 mg-20 C試劑盒以外自備儀器和試劑光學(xué)顯微鏡、37

5、C孵箱、微量移液器、染色濕盒、蓋玻片、載玻片、染色缸 o二甲苯、多聚甲醛、PBS、H2O2、TritonX-100 、檸檬酸鈉、復(fù)染染液：蘇木 素或甲基綠等.三、操作流程概覽四、檢測(cè)樣本的預(yù)處理TUNEL檢測(cè)時(shí)樣本的預(yù)處理是試驗(yàn)的關(guān)鍵所在,本說(shuō)明書推薦的條件僅為 普遍情況,用戶需根據(jù)自已的樣本材料與首次試驗(yàn)結(jié)果來(lái)調(diào)整各個(gè)條件參照 Page 9 ,如處理時(shí)間、處理濃度等,來(lái)優(yōu)化出適合自身樣本的試驗(yàn)條件,從 而做出客觀的試驗(yàn)結(jié)果.1 .細(xì)胞樣本的準(zhǔn)備自蜂干的細(xì)B&樣本細(xì)胞漆片或鹿片浸入固茜瓦 室溫15-25D 固定15-30 min-lhB6= 4%聚甲醴格于 PH7.4 的 PBS 中,gSS4

6、?的70%乙蕾中瞄 如分鐘或至過(guò)菠*以改善細(xì)胞的海透性PBS 溢t浸入封聞演中,室溫1S25T? HffllOmm封閉海 3%H2O?j&f甲藤封間氟配制方法m Lm30%HzCh溶于頃甲醇PBS漂洗浸A通逶成中,冰上C28rIS毒Zrnino.i%iiiwiix-iooc.i需g配知it番祖制濰m先配制0.1%腳酬*h.,垣檸椽醐滔+100訕?biāo)?再在BE制好的 LOOmLffl 0J!4?KKffl 中ft入 O-hnlT&onXM.ffiAfelBJfe 詳見 Page S操作本卷須知：1. 為預(yù)防樣本脫落,請(qǐng)使用硅烷Silane 處理的載玻片或采用多聚賴氨酸鋪片.2. 使用PBS清洗細(xì)胞

7、樣本時(shí),不要直接加在細(xì)胞樣本上,以預(yù)防細(xì)胞樣本的脫落.3. 進(jìn)行PBS清洗時(shí),以5分鐘清洗3次為標(biāo)準(zhǔn).4. 固定液、PBS、封閉液、通透液、染色缸需用戶自備,請(qǐng)按上述方法配制.五、標(biāo)記和顯色反響預(yù)處理好的樣本漂洗兩波,律本周圍用吸水紙吸干每個(gè)伴木滴加5.PL TdT 91反響羸 加蓋玻片斜.成光濕潤(rùn)反響COiiun (TdT45 UL Equilitcration Buffer -+1 U- L Bi o-tizm 11-dDTP +4?阻性對(duì)照片不加TdT SAT. TtfT EM?ae,寄,蚌配尸PBS漂洗三沃,樣本周圍用吸水紙吸干滴加50P-L StrptavidiurEKP工作海 加蓋

8、玻片5TC濕滴隆光反響SOinin(Streptavidirr-HRP TfffRs O.5I1 L Strep十a(chǎn)viknrEEF+995PL PES)PBS漂洗三治滴加CTfL-1001她工作液,室*fife反響lOminCDADTfRft： 5HL 30XD2B+1UL 30%Mc+94|lL FBS 茶籬蚌配宙塵P蹈漂洗三沃.光學(xué)顯微鐐下觀察、拍照亦 靜&觀察操作本卷須知：1. 進(jìn)行PBS活洗時(shí),以5分鐘活洗3次為標(biāo)準(zhǔn).2. PBS活洗后,為了各種反響的有效進(jìn)行,請(qǐng)盡量除去 PBS溶液后再進(jìn)行下- 步反響3. 在載玻片上的樣本上加上實(shí)驗(yàn)用反響液后,請(qǐng)蓋上蓋玻片或保鮮膜,或在濕盒中進(jìn)行,

9、這樣可以使反響液均勻分布于樣本整體,又可以預(yù)防反響液枯燥造成 實(shí)驗(yàn)失敗.4. TdT酶反響液即用即配,短暫丁冰上保存.不宜長(zhǎng)期保存,長(zhǎng)期保存會(huì)導(dǎo)酶 活性的失活.5. 如果20 X DAB溶液顏色變深成為紫色,那么不可使用,需重新配制現(xiàn)象可能原因建議6. 蘇木素復(fù)染：將切片放入蘇木素染液,染色 30s-10min 根據(jù)樣本做適當(dāng) 調(diào)整,蒸僻水沖洗干凈后放入鹽酸甲醇溶液中 5s ,立即用蒸僻水沖洗干凈. 分別用70%、85%、95%、無(wú)水乙醇浸泡5分鐘.用二甲苯浸泡10分鐘,更 換二甲苯后再浸泡10分鐘.晾干后在切片上加中性樹膠,加蓋玻片.六常見問(wèn)題的原因與推薦解決方案非特異性染色例如:非凋亡細(xì)胞

10、的強(qiáng)染色Biotin-dUTP 的非特異性結(jié)合勿使細(xì)胞干涸在TdT酶反響之后,再用含0.1% TritonX-100 和 1 mg/ml BSA 的 PBS 洗三次.TdT酶的濃度過(guò)高用 TdT dilution buffer*作 1: 21 ：10稀釋,內(nèi)源過(guò)氧化物酶未被封閉封閉液室溫15-25 C封閉10min 封閉液：3%H 2O2溶丁甲醇光照紫外線導(dǎo)致包埋試劑的聚合如：甲基丙烯酸會(huì)導(dǎo)致樣本DNA的斷裂嘗試改用其它包埋材料或其它聚合試劑在固定組織時(shí)樣本DNA已斷裂內(nèi)源核酸酶的作用保證樣品取樣后立即固定或通過(guò)肝靜脈灌注固定固定后某些核酸 酶活性依然較局 導(dǎo)致DNA斷裂用含有dUTP和dAP

11、T的溶液封閉染色背景較高福爾馬林固定導(dǎo)致某些含黑色素嘗試以甲醇固定,但可能會(huì)降低檢測(cè)的敏感性.前體的細(xì)胞染成黃色內(nèi)源過(guò)氧化物酶未被封閉封閉液室溫15-25 C封閉10min 封閉液：3%H 2O2溶丁甲醇Biotin-dUTP 的非特異性結(jié)合在TdT酶反響之后,再用含0.1% TritonX-100 和 1 mg/ml BSA 的 PBS 洗三次.樣本被支原體污染使用支原體檢測(cè)試劑盒檢測(cè),如陽(yáng)性那么制備未被污染的新樣木標(biāo)記反響試劑TdT酶與dUTP的濃度過(guò)高稀釋50% ,以降低標(biāo)記反響的濃度細(xì)胞處丁高度增殖期在非高增殖期取樣檢測(cè)DAB孵育時(shí)間過(guò)長(zhǎng)減少DAB染色時(shí)間標(biāo)記率低、染色淡至無(wú)如果以乙醇

12、或甲醉固定的樣本那么標(biāo)記效率較低因?yàn)樵诠潭〞r(shí)染色質(zhì)未能與蛋白質(zhì)交聯(lián),而在操作中用溶丁 PBS PH7.4中的4%多聚甲醛固定或福爾馬林或戊二醛固定.喪失過(guò)度的固定導(dǎo)致與蛋白過(guò)度交聯(lián)縮短固定時(shí)間,或用溶丁 PBS PH7.4的2%多聚甲醛固定促滲條件不佳,以增加通透劑促滲時(shí)間復(fù)染信號(hào)較弱履靶分子或濃度用溶丁 0.1M醋酸巴比妥的3-5%甲基綠增加通透劑的作用溫度15-25 C PH4.0 ,或蘇木素復(fù)染陽(yáng)性對(duì)照沒(méi)有信號(hào)DNase I的濃度過(guò)低k的U/m昧度翁DNase間如：以 400ug/ml 作用 5min 石蠟切片使用1500U/mL 的DNase I的檸檬酸鈉70 C作用30min.一般

13、E 使用 10U/ml DNase I反響緩沖液：10mM Tris-HCl ( PH7.9) , 10 mM NaCl, 5mM MnCl 2, 10mM CaCl 2, 25mM KCl 2 , 37 C 反 應(yīng) 30 min , PBS 洗去.組織樣木從載組織樣本被酶從降低蛋白酶K的處理時(shí)間玻片脫落玻片消化下來(lái)*TdT dilution buffer : 60 mM KPB 緩沖液pH7.2 , 150 mM KCl , 1 mM 2-mercaptoethanol , 50 % Glycerol非離子外表活性劑T riton X-100聚乙二醇辛基苯基酰免疫細(xì)胞化學(xué)中,Triton X-100 常用濃 度為1%和0.3%,但通常是先配制成30%的Triton X-100 儲(chǔ)藏液,臨用時(shí)稀 釋至所需濃度.30% Triton X-100 的配制：試劑：Triton X-100 28.2ml0.1mol/L PBSpH7.3 或 0.05mol/l TBSpH7.4