二維相關熒光光譜技術

1、第18卷第12期2006年12月化學進展PROGRESSINCHEMISTRYVol.18No.12Dec.,2006二維相關熒光光譜技術余婧武培怡333(復旦大學高分子科學系聚合物分子工程教育部重點實驗室上海200433)摘要從發(fā)展歷史、計算方程、一般規(guī)則和特有性質等方面系統(tǒng)地介紹了近年來在二維相關熒光光譜技術方面的方法探索和應用進展。以不同的外擾方式,如濃度、激發(fā)波長、猝滅以及其他外擾方式如pH等分類,舉例闡述了二維熒光相關光譜的可操作性及其應用,并與普通一維熒光光譜比較,說明了二維熒光相關光譜技術的優(yōu)勢。關鍵詞二維相關熒光光譜技術相關分析外擾中圖分類號:O657.3文獻標識碼:A文章編號

2、:()122Two2JingWuPeiyi33(ofMolecularEngineeringofPolymers,DepartmentofMacromolecularScience,FudanUniversity,Shanghai200433,China)AbstractThetechniqueandprogressintwo2dimensionalfluorescencecorrelationspectroscopyissystematicallyintroducedintheaspectsofhistory,mathematicequations,generalregulationandc

3、haracteristicproperties.Theintroductionissortedintherangeofdifferentperturbations,suchasconcentration,excitationwavelength,fluorescencequenchingandthepH.Thereareseveralexamplesineachcasehelpingtoillustratetheoperabilityandapplicationofthenewtechnique.Additionally,thenewtechniqueisalsocomparedwiththe

4、traditionalone2dimensionalfluorescencespectroscopy,whichindicatestheadvantageofthetwo2dimensionalfluorescencecorrelationspectroscopyclearly.Keywordstwo2dimensionalfluorescencecorrelationspectroscopy;correlationanalysis;perturbationNoda于1986年就二維NMR技術理論提出了31背景介紹1.1歷史發(fā)展一個概念性的突破,把磁實驗中多重射頻勵磁看作是對體系的一種外部擾動

5、。這種全新的看待二維NMR技術的視角為二維相關技術在其他領域的應二維相關技術起源于30年前,并最先被應用于核磁共振領域。其基本原理是,通過多脈沖技術激發(fā)核自旋,采集時間域上原子核自旋弛豫過程的衰減信號,經雙傅里葉變換而得到二維相關核磁譜1,2用提供了無限的潛力。1989年,Noda11又在二維相關NMR譜的基礎上提出一項新的實驗方案,用一個低頻率的擾動作用在樣品上,通過測定比振動弛豫慢許多,但與分子尺寸運動緊密相關的不同弛豫過程的紅外振動光譜,將數(shù)學相關分析技術用于紅外光譜中,得到二維紅外相關光譜圖。這些慢的弛豫過程可以用現(xiàn)有的普通紅外光譜儀,通過簡單的時。二維相關技術的應用將光譜信號擴展到第

6、二維上,提高了光譜分辨率,簡化了含多重重疊峰的復雜光譜,并能通過提供各信號峰之間變化的相關關系,鑒別和研究分子內和分子間的相互作用。收稿:2006年2月,收修改稿:2006年4月3國家杰出青年基金(No.20425415)、國家自然科學基金(No.20474013,20573022)、國家基礎研究專項經費(No.2005CB623800)和教育部博士點基金(No.2005CB623800)項目資助33通訊聯(lián)系人e2mail:peiyiwu 1994-2010 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reser

7、ved. 1692化學進展第18卷間分辨技術加以研究。這就解決了阻礙二維相關技術發(fā)展的最重要難題:普通光譜的時間標尺比核磁的時間標尺短得多1993年,Noda等4,因此難以用儀器檢測研究。如圖1a所示,參數(shù)A和C處的交峰為負值,表示一個峰在增長,而另一個峰在減小;參數(shù)B和D處的交峰為正值,表示兩個峰在同時增大(或減小)。14,15再次對已有理論進行修正,將二維相關光譜技術由狹義擴展到廣義,即外擾形式從原來的波形僅限于正弦波形擴展到多種多樣,從簡單的正弦波、脈沖波到隨機的噪音或靜態(tài)的物理變化都可應用于外擾,如電場學9,105,6、熱7,8、磁、化、近紅、機械1117甚至聲波等變化。此后,二維相關

8、182127技術的應用范圍逐漸從核磁擴展到紅外22,232426外、拉曼、X射線衍射、凝膠滲透色譜28,293538擾t的Tmin和Tmax區(qū)間內,在1和2測量的光強同步的變化,表征兩個動態(tài)光譜信號之間的協(xié)同程度。當發(fā)生在波數(shù)1和2處的動態(tài)變化完全一致時,(1,2)達到最大值;而當兩個動態(tài)變化正交(即相差為2)時,它的值為零;當兩個動態(tài)變化彼此反相(即相差為)時,它的值最小。圖1是二維相關光譜的等高圖。同步光譜是以1=2對角線為對稱軸的對稱圖形。相關峰在對角線和非對角線區(qū)域均會出現(xiàn)。在對角線上出現(xiàn)的相關峰和數(shù)學上的自相關函數(shù)有關,因此被稱作自峰(autopeak)。由圖1a所示,對角線上的A、

9、B、C、D峰為自峰。自峰總為正值,它的強度代表特定的光學變量在外擾Tmin和Tmax區(qū)間內變化的程度。因此在外擾區(qū)間內光譜的任一區(qū)域內出現(xiàn)顯著的變化都會出現(xiàn)強自峰。剩下的近似不變的區(qū)域將不會產生自峰。換言之,自峰代表了系統(tǒng)在外擾影響下隨光強變化不同區(qū)域相關光譜變化的敏感度。位于對角線兩側的同步二維光譜峰稱作交叉峰(crosspeak),表示位于不同波數(shù)1和2的波峰的同步變化。交叉峰的存在可能意味著兩個峰的變化有共同的機理和起源。自峰永遠是正值,而交叉峰可能是正值也可能是負值。在所觀察的外擾t的變化區(qū)間內,如果在不同波數(shù)處的兩個峰同時增大或減小,則在二維光譜上交峰為正值;反之則為負值。圖1二維相

10、關光譜示意圖4Fig.1Schematiccontourmap:(a)synchronousand(b)asynchronous2Dcorrelationspectrum41.2.2異步光譜圖1b為異步二維相關光譜示意圖。異步光譜表示的是在繼承的變化,其1和2處光強連續(xù)的、光譜強度(1,2)表征兩個動態(tài)光譜信號彼此間相差的程度。當兩個動態(tài)信號彼此正交時,它的值達到最大或最小;而當兩個動態(tài)信號同相或異相時,它的值為零。與同步光譜不同的是,異步光譜在對角線兩側是反對稱的。異步光譜沒有自峰出現(xiàn),完全是由對角線兩側的交峰組成。異步的交峰產生是由于兩個光譜峰的強度變化存在相對的加速度。這種特性可以幫助我

11、們區(qū)分重疊在一起的起源不同的 1994-2010 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. 第12期余婧等二維相關熒光光譜技術1693峰。只要光強的連續(xù)變化有足夠大的差別,即使兩峰緊密靠近也可準確加以區(qū)分,二維異步光譜在光學參數(shù)范圍內一定會有交峰出現(xiàn)。異步交峰可以是正值也可以是負值。如果在1發(fā)生的光強變化明顯地在2之前,則出現(xiàn)正峰(對對角線左上方區(qū)域而言);如果在2之后,則出現(xiàn)負峰(對對角線左上方區(qū)域而言)。但如果(圖1b所示,A和C1,2)0,則規(guī)則相反。處的交峰發(fā)生在B和D之后。1.2.

12、3讀譜規(guī)則曼、紅外、近紅外研究中也是最普遍的一種外3234擾。而熒光光譜技術還有一些特有的外擾手段,如改變激發(fā)光波長應36,3735,38、應用熒光猝滅效等。固定激發(fā)波長ex不變,掃描發(fā)射波長,則得到熒光發(fā)射光譜;反之,固定發(fā)射波長f不變,掃描激發(fā)波長,則得到熒光激發(fā)光譜。以改變激發(fā)光波長為二維熒光相關光譜技術的外擾時,固定研究體系的濃度不變,用一系列不同的波長N)ex,m(m=1激發(fā),得到對應的一系列發(fā)射光譜If(f,ex,m)。(f1,f2)和35(f2ex,1-1二維相關光譜的解讀遵循兩個規(guī)則。其一,在時,波數(shù)1的變化快于波數(shù)2;相反,若相應的同步光譜強度(1,2)與異步光譜強度(1,2

13、)正負情況相異,即(1,2)與(1,2)的乘積小于零時,波數(shù)2的變化快于1。1.3二維熒光相關光譜Y1( )Y2( )d (2)是If(f1,ex)激發(fā)波長微區(qū)間的2( )是If(f2,ex)的共軛傅里光光譜的另一種特有技術。溶液中的猝滅劑分子與熒光物質分子之間發(fā)生相互作用,會引起熒光物質分子的熒光效率降低,或者熒光物質激發(fā)態(tài)的壽命縮短,從而導致熒光強度的降低39。熒光猝滅效應可以用Stern2Volmer方程來定量表述:F0=1+KSVCqF本文中所介紹的廣義二維熒光相關光譜完全不同于傳統(tǒng)的激發(fā)2發(fā)射矩陣二維熒光光譜。前者體現(xiàn)了體系中不同熒光峰之間的相互作用,而后者只是簡單地將激發(fā)波長和發(fā)射

14、波長作為兩個維度,體現(xiàn)了發(fā)射強度與激發(fā)波長間的依賴關系33,35(3)此處,F、F0分別代表有無猝滅劑存在下的熒光強度,Cq是猝滅劑濃度,KSV被稱作Stern2Volmer常數(shù),是猝滅效率的量度,猝滅效率越高,KSV越大。固定體系中發(fā)色團濃度不變,改變猝滅劑濃度Cq,m(m=1N),得到一系列溶液,其熒光強度表示為F(i,Cq,m),i涵蓋了光譜的整個波長范圍。同步和異步二維熒光相關光譜的強度(f1,f2)和(f1,f2)由下式得到36。將廣義二維相關光譜技術應用于熒光光譜時,為得到二維圖中的相關峰,必須對體系選定合適的外擾,該外擾須是能引起熒光峰強度變化的某一因素。熒光物質稀溶液的熒光強度

15、If(f,ex,C)通常表示如下:(If(f,ex,C)=Iex(ex)ex)C(ex)35(1)(1,2)+i(1,2)=(Cq,N-Cq,1)-1式中,ex和f分別是激發(fā)和發(fā)射波長,Iex(ex)是激發(fā)光的強度,(ex)是發(fā)色團的摩爾消光系數(shù),C是發(fā)色團的濃度,0,所以371nm(Y1)與365nm峰同歸屬于芘;(371,384)0,(371,388)0,所以384nm(Y3)、388nm(Y4)與371nm同歸屬于芘;而377nm(A1)、399nm(A2)、424nm(A3)、452nm(A4)與371nm的相關圖7蒽、芘混合物環(huán)己烷溶液的二維相關熒光(a)同步光譜;(b)異步光譜35

16、Fig.7(a)Synchronousand(b)asynchronous2DfluorescencecorrelationspectroscopyofthemixtureofANandPYincyclohexanesolution,constructedfromthespectraofFig.635峰均為負值,所以這4個特征峰歸屬于蒽。類似于上面提到的,所有的Yi與Yj之間,Ai與Aj之間的 1994-2010 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. 第12期余婧等二維相關熒光光譜技術1

17、697相關峰都是正的,而Yi與Aj之間的相關峰都是負的?？疾於S異步譜圖7b,由于相關信號只出現(xiàn)在不同熒光物質的特征峰之間,對于有嚴重重疊現(xiàn)象的復雜體系,結合同步與異步圖中的信號,可以得到更確切的各峰歸屬信息。如圖7b,399nm與409nm,438nm和467nm峰有明顯的異步相關。結合同步分析中得到的399nm是蒽的特征峰這一信息,409nm等3個峰則應歸屬于芘。二維相關分析提高光譜分辨率的優(yōu)勢在這個例子中也得到了很好的體現(xiàn)。例如,芘的412nm特征峰在一維譜圖上是強峰392nm的肩峰,難以分辨,而在二維圖里,412nm峰則可以看得十分清楚。芘的另外幾個較弱的特征峰如438nm和467nm

18、也是同樣。2.336,37-研究所采用的外加猝滅劑分別為碘離子(I)和丙烯酰胺(AA)。其中,碘離子易猝滅親水的W7,而丙烯酰胺和W7、W14都能接觸。圖8a,b分別是加入不同濃度碘離子和丙烯酰胺的HM熒光譜圖,虛線描繪的是水的拉曼峰。如圖,隨著猝滅劑含量的增加,HM的熒光強度不斷降低;同時,不難發(fā)現(xiàn),丙烯酰胺的猝滅效率比碘離子高,這是因為丙烯酰胺能夠同時猝滅W7和W14,而碘離子只能猝滅W7的原因。,也39生的導致熒光強度下降的物理或化學作用過程。改變體系中猝滅劑濃度或是僅改變發(fā)色團和猝滅劑分子周圍的環(huán)境都能使體系發(fā)生猝滅。因此,實際應用中,猝滅外擾大致也有簡單應用猝滅劑濃度變化和需要考慮發(fā)

19、色團周圍化學環(huán)境等不同情況。372.3.1猝滅劑濃度簡單外擾眾所周知,熒光光譜法被廣泛地應用于蛋白質43分子的研究。在蛋白質分子中,能發(fā)射熒光的氨基酸殘基只有色氨酸(Trp)、酪氨酸(Tyr)和苯丙氨酸(Phe)。這3種氨基酸中,Trp的熒光強度最大,且因為它是蛋白質中固有的熒光團,可避免因引入外界干擾對研究產生負面影響,因而最常被用作內源4446探針來研究蛋白質的結構。但是,熒光基團的猝滅程度決定于其對溶劑的暴露影響,而蛋白質中的Trp殘基受其在蛋白質分子中位置的制約,很難控制其可接觸性,所以其熒光光譜常常顯得過于復雜而無法分析。例如馬的心臟肌血球素(HM)中包含兩種Trp:一種位于第7位,

20、較為親水,稱W7;而另一種位于第14位,被深埋在疏水的蛋白質分子主體中,稱W14。理論上,Trp的熒光發(fā)射對環(huán)境極性很敏感,W14的發(fā)射波長應該比W7的發(fā)射波長短。但這兩個峰重疊太嚴重,在一維熒光光譜中只能看到一個熒光發(fā)射峰。因此,Nakashima等采用外加猝滅劑為外擾,對該體系進行二維相關熒光光譜研究。3747,48圖8不同猝滅劑濃度的HM熒光光譜:(a)碘離子猝滅;(b)丙烯酰胺猝滅37Fig.8FluorescencespectraofHMintheabsenceandpresenceofquenchers:(a)quencherI;(b)quencherAATheconcentrat

21、ionofHMis10mmolLforallsamples.Thesampleswereexcitedat282nm-37圖9a,b是由碘離子作為外擾所得動態(tài)光譜分析得到的二維相關熒光光譜。同步譜中,猝滅劑濃度增加,兩種Trp的熒光強度都降低,因而只出現(xiàn)(335,335)一個自相關峰。在這個例子中,同步分析對于提高光譜分辨率并沒有多大幫助;而異步圖(圖9b)中,則存在(322,348)的正相關峰。結合前面的分析,W14的發(fā)射波長較W7短,因此,W14的發(fā)射峰應位于322nm,而W7的發(fā)射峰在345nm。由于(322,348)0,根據(jù)Noda的二維相關理論,348nm峰的變化快于322nm峰,即

22、碘離子對W7的猝滅作 1994-2010 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. 1698化學進展第18卷圖9碘離子猝滅作用后的HM二維熒光相關:(a)同步光譜;(b)異步光譜Fig.9(a)37圖10丙烯酰胺猝滅作用后的HM二維熒光相關:(a)同步光譜;(b)異步光譜37Fig.10(a)Synchronous37Synchronous37and(b)asynchronous2Dand(b)asynchronous2DfluorescencecorrelationspectraofHMi

23、naqueoussolutions,constructedfromFig.8afluorescencecorrelationspectraofHMinaqueoussolutions,constructedfromFig.8b用較對W14更易于發(fā)生,這與預期也是相吻合的。圖10a,b是丙烯酰胺作為外加猝滅外擾相對應的二維相關光譜。同步譜與圖9a類似,而異步圖中則看不到任何相關峰的存在。這是因為丙烯酰胺能同時猝滅W7和W14,且對兩者的猝滅速率沒有很大差別。另外值得一提的是,水的拉曼峰強度不受猝滅劑影響,因而二維相關光譜中沒有該峰的相關信息,從而排除了水相體系中難以避免的水的拉曼峰影響。這也是二

24、維相關熒光光譜的重大優(yōu)勢之一。362.3.2猝滅劑與其他因素相互作用的復雜情況上文中已經提到,熒光基團的猝滅程度決定于其對溶劑的暴露程度,也就是與猝滅劑相互接觸的程度。如果某種化學環(huán)境使得猝滅劑分子無法接近發(fā)色團,則猝滅效率會降低。例如,當熒光物質被包裹于表面活性劑在水中形成的微球中時,親水性猝滅劑的猝滅效率將會大大降低;反之,憎水性猝滅劑將會與熒光物質一同包裹于微球中,與熒光物質的碰撞幾率大大增高,因而其猝滅效率也會顯著增強。對用碘離子猝滅包裹在CTAC微球中PY2PYS混合物這一水相體系的研究表明,物質分子與猝滅劑的相互作用對猝滅過程有非常大的影響(本節(jié)所提到的各個化合物分子式及其全名和簡

25、稱見圖11)。由于重原子效應的影響,碘離子對于PY和。但PYS離子帶有4個負電荷,與猝滅劑碘離子所帶電荷相同,由于靜電相互排斥作用,PYS離子與碘離子相碰觸的幾率遠小于PS分子與碘離子的碰撞幾率。因而碘離子對PYS的猝滅效率可能比對PY的猝滅效率低很多。固定體PYS都有猝滅作用41,49系中其他因素不變,僅改變碘離子濃度,得到一系列的動態(tài)光譜(圖12),該譜圖有非常嚴重的重疊現(xiàn) 1994-2010 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. 第12期余婧等二維相關熒光光譜技術1699滅效果不明

26、顯,PYS的熒光發(fā)射強度變化不大的原因,這也進一步證實了上面的猜想。異步圖(圖13b)中出現(xiàn)了7個熒光特征峰,這些峰在高度重疊的一維譜圖中根本無法辨認,這又一次體現(xiàn)了二維相關光譜在提高光譜分辨率上的巨大優(yōu)勢。將這些峰編號為Yi(i=15)和Si(i=12)。考察這些相關峰,以Y1,S1為例,有(Y1,S1)0,(Y1,S1)0;對其他峰,也存在(Yi,Sj)0,(Yi,Sj)0,(i=15,j=12)。根據(jù)Noda的二維相關分析理論,PY對碘離子猝滅劑比PYS敏感。圖11各熒光物質、Fig.11Structural,36象,。下面是對該圖作二維相關分析(圖13a,b)。對照PY和PYS的熒光發(fā)

27、射光譜,PY367nm(Y0)和374nm(Y1)的熒光特征峰不在重疊的范圍之內,可用作下一步分析的參考標準。與文獻中的歸屬信36息對照,還可發(fā)現(xiàn)385nm(Y3),395nm(Y5)都是PY的特征峰。在同步譜(圖13a)中,完全沒有任何有關PYS的相關信息。這可能是由于碘離子對其猝圖13碘離子猝滅外擾CTAC微球體系中PY、PYS混合物的二維相關熒光光譜:(a)同步光譜;(b)異步光譜36Fig.13(a)Synchronousand(b)asynchronous362DfluorescencecorrelationspectraofthemixturesofPYandPYSinCTACmi

28、cellarsolutions,constructedfromFig.12圖12不同碘離子濃度時CTAC微球體系中PY、PYS混合物的熒光發(fā)射光譜36Fig.12FluorescencespectraofthemixturesofPYandPYSwithvaryingconcentrationofNaIinCTACmicellarsolutions.除了熒光物質與猝滅劑之間的相互作用會影響猝滅外擾外,熒光物質與介質等(如表面活性劑)的相互作用也會影響猝滅劑的猝滅效率,從而形成外擾。例如PY包裹在SDS微球中時,位于微球內較靠外壁的地方,與水相中猝滅劑CPC的距離很近,可以產生猝滅效應。而AP在

29、水中電離后成為負離子,與表面活性劑SDS微球的帶負電表面相concentrations:c(PY)=10molL,c(PYS)=10molL,c36(CTAC)=0105molLThesamplesareexcitedat34315nm 1994-2010 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. 1700化學進展350nm左右53第18卷斥,位于微球內核,因而難以與猝滅劑碰觸。在二維相關光譜中,AP的自相關峰就較弱,而異步圖中的相關峰也說明AP對猝滅劑的敏感性低于PY。此處不再作詳細說明。

30、382.4其他外擾除了以上提到的最常用外擾:濃度,以及熒光分析的特有外擾即激發(fā)波長和猝滅效應外,另外一些適用于其他光譜如拉曼、紅外、近紅外等的外擾也可用于熒光光譜。pH外擾即是其中較為常見的一種。;當用多重紅外光量子(710880nm)54激發(fā)時,其發(fā)射波長是500nm左右。圖14a,b是以pH為外擾的血清素發(fā)射2發(fā)射二維熒光相關光譜。同步圖(圖14a)中,有很強的(336,336)自相關峰。異步圖(圖14b)提供了更多的光譜信息,其中存在異步相關峰(336,350),說明作為pH的函數(shù),這兩個峰變化并不同相。圖15pH外擾血清素二維相關激發(fā)2激發(fā)熒光光譜:(a)同步光譜,(b)異步光譜38圖

31、14pH外擾血清素二維相關發(fā)射2發(fā)射熒光光譜:(a)同步光譜,(b)異步光譜38Fig.14(a)Synchronousand(b)asynchronousemission2emission2DfluorescencecorrelationspectraoftheserotoninwithpHasperturbation.EmissionspectrausedincalculationarefrompH=810topH=12.5Fig.15(a)Synchronousand(b)asynchronousexcitaion2excitation2Dfluorescencecorrelations

32、pectraoftheserotoninwithpHasperturbation.EmissionspectrausedincalculationarefrompH=8.0topH=12.53838含于血液中的復合胺血清素是一種與感覺和行為能力如饑餓、疼痛、緊張、學習和睡覺等相關的神50經遞質,其化學成分是一種復合胺。血清素的紊亂與憂郁癥、精神分裂和強迫癥等精神疾病有很大51的關系。因此,對血清素的研究成為生理科學的52重要問題之一。血清素中主要的官能團是吲哚環(huán),因此,其光物理性質比較復雜。在pH值210的范圍內,水溶液中血清素的熒光發(fā)射都在紫外區(qū)域,最大的發(fā)射波長是336nm。當pH115時

33、,一般情況下血清素的53熒光發(fā)射波長在550nm;當用氬離子激光激發(fā)時,它的熒光峰為一315400nm的寬峰,峰頂位置在類似地,圖15a,b是同一研究體系的激發(fā)2激發(fā)二維熒光相關光譜。光譜區(qū)域250280nm和280340nm對應的熒光激發(fā)分別適用于血清素的不同離子化作用。作為pH的函數(shù),這兩種離子化作用的變化速率并不相同。相應地,在異步光譜中有這兩個區(qū)域之間的相關信號。從圖14b和15b中都可以觀察到,離子化和非離子化的熒光光譜信號變化并不一致。這可以用兩種不同的電離模型來解釋。一步電離模型:+-(5)HAH+A-若HA和A都有熒光特性并有不同的熒光發(fā)射譜,在pH作為外擾時,兩者應該同步線性

34、變化,因而在異步圖中不會出現(xiàn)兩者之間的相關信號。 1994-2010 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. 第12期余婧等二維相關熒光光譜技術81701兩步電離模型:+-H2AH+HA-CzarneckiMA,MaedaH,OzakiY,etal.Appl.Spectrosc.,1998,52:9941000NakanoT,ShimadaS,SaitohR,etal.Appl.Spectrosc.,1993,47:13371342WangY,MurayamaK,OzakiY,etal.J

35、.Phys.Chem.B,1998,34:66556662NodaI.J.Am.Chem.Soc.,1989,111:81168118NodaI.Appl.Spectrosc.,1990,44:550561NodaI.Chemtracts2Macromol.Chem.,1990,1:89105NodaI,DowreyAE,MarcottC.Appl.Spectrosc.,1993,47:13171323NodaI.Appl.Spectrosc.,1993,47:13291336MarcottC,DoweryAE,NodaI.Anal.Chem.,1994,66:A1065A1075NodaI,

36、oweryAE,MarcottC.olymerSpectrocopy.Weinheim:iley232J,PY,DingYF,2002,35:WuPY.J.Phys.Chem.B,2003,107:42244226WuPY,SieslerHW.Chem.Phys.Lett.,2003,374:7478PengY,WuPY,SieslerHW.Biomacromolecules,2003,10411044WuPY,YangYL,SieslerHW.Polymer,2001,42:1018110186WuPY,SieslerHW.Chem.Mater.,2003,15:27522756NodaI,

37、MarcottC.J.Phys.Chem.A,2002,106:337133762H+A2-+2-(6)這種情況下,若H2A、HA和A中的兩種有熒光特性并有不同的熒光發(fā)射譜,則在pH作為外擾時,有熒光活性的兩者變化不可能同步線性,因而在異步圖中有此兩者之間的相關信號。對照二維相關熒光光譜中得到的信息與模型推理的結論,不難發(fā)現(xiàn),血清素的電離過程與兩步電離模型類似。因此,在離子化與非離子化物質之外,體系中必定還存在第三種電離狀態(tài)。實質上,這第三種電離狀態(tài)即高pH值時,用341nm激光激發(fā)所得的380nm附近很弱的熒光發(fā)射。總的來說,二維相關熒光光譜在測試動態(tài)光譜變化方面較普通一維光譜靈敏,它不僅能

38、夠識別光譜信號的同步變化,種電離狀態(tài)要的作用。910111213141516172021222324253結語二維熒光相關光譜在二維相關光譜系列中還是一項比較新的技術,迄今為止的報道大多以探索研究方法本身為主,極少有將其真正用于解決實際問題的。這主要是因為與發(fā)展相對成熟的紅外、近紅外等振動光譜相比,熒光光譜本身就是一種比較新的研究方法,其影響因素多,對環(huán)境極為敏感,而且很多歸屬并不十分明確。這是將二維熒光相關光譜推廣應用的障礙,但同時也使得該技術的發(fā)展應用有巨大的潛力和廣闊的前景。參考文獻12BaxA.TwoDimensionalNuclearMagneticResonanceinLiquid

39、s.Boston:Reidel,1982EmstRR,BodenhausenG,WakaunA.PrinciplesofNuclearMagneticResonanceinOneandTwoDimensions.Oxford:OxfordUniversityPress,198734567NodaI.HandbookofVibrationalSpectrosc.,2002,3:21232134NodaI,DowreyAE,MarcottC,etal.Appl.Spectrosc.,2000,54:236A248AAtakaK,OsawaM.Langmuir,1998,14:951959Grego

40、riouVG,ChaoJL,ToriumiH,etal.Chem.Phys.Lett.,1991,179:491496OzakiY,LiuYL,NodaI.Appl.Spectrosc.,1997,51:526533徐金澤(XuJZ),趙雨(ZhaoY),趙冰(ZhaoB)等.高等學?；瘜W學報(Chem.J.ChineseUniv.),2002,23:11101112262728293031323334353637ShenY,ChenFE,WuPY,etal.J.Chem.Phys.,2003,119:1141511419ChoiHC,JungYM,NodaI,etal.J.Phys.Chem

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