專題五 DNA和蛋白質(zhì)技術(shù)

1、專題5 DNA和蛋白質(zhì)技術(shù)學(xué)習(xí)導(dǎo)航DNA和蛋白質(zhì)技術(shù)，包括DNA的提取、蛋白質(zhì)的提取、DNA片段的擴(kuò)增等，是開展分子生物學(xué)研究的基本技術(shù)。本專題將從基礎(chǔ)入手，學(xué)習(xí)DNA的粗提取、PCR技術(shù)和血紅蛋白的提純。學(xué)習(xí)這些技術(shù)，不僅能夠幫助學(xué)生初步了解分子生物學(xué)的基本實(shí)驗(yàn)方法，而且能夠鞏固必修課中學(xué)習(xí)的有關(guān)DNA和蛋白質(zhì)的理論知識。本專題的3個(gè)課題相對獨(dú)立，沒有嚴(yán)格的先后順序。課題1的操作難度不高，學(xué)生比較容易獲得結(jié)果。課題2的操作難度也不高，但PCR技術(shù)的原理是難點(diǎn)，學(xué)生要充分利用教材的圖文資料，并且在教師的引導(dǎo)下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作。課題3的操作難度比較大，所以學(xué)生一定要在教師的精心指導(dǎo)下完成操作。課題1

2、 DNA的粗提取與鑒定導(dǎo)學(xué)誘思1提取DNA的方法提取生物大分子的基本思路是 。對于DNA的粗提取而言，就是要利用 、 等在物理和化學(xué)性質(zhì)方面的差異，提取DNA，去除其他成分。1）DNA的溶解性 DNA和蛋白質(zhì)等其他成分在不同濃度的 中溶解度不同，利用這一特點(diǎn)，選擇適當(dāng)?shù)柠}濃度就能使 充分溶解，而使雜質(zhì)沉淀，或者相反，以達(dá)到分離目的。 圖51是DNA在NaCl溶液中的溶解度曲線，請根據(jù)曲線圖，思考：在什么濃度下，DNA的溶解度最??？DNA在NaCl溶液中的溶解度是如何變化的？如何通過控制NaCl溶液的濃度使DNA在鹽溶液中溶解或析出？此外，DNA不溶于 溶液，但是細(xì)胞中的某些蛋白質(zhì)則溶于酒精。利

3、用這一原理，可以將DNA與蛋白質(zhì)進(jìn)一步的分離。2）DNA對酶、高溫和洗滌劑的耐受性 蛋白酶能水解 ，但是對 沒有影響。大多數(shù)蛋白質(zhì)不能忍受6080oC的高溫，而DNA在 以上才會變性。洗滌劑能夠瓦解 ，但對DNA沒有影響。3）DNA的鑒定 在 條件下，DNA遇 會被染成 色，因此二苯胺可以作為鑒定DNA的試劑。2實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)1）實(shí)驗(yàn)材料的選取 凡是含有 的生物材料都可以考慮，但是使用 的生物組織，成功的可能性更大。在下面的生物材料中選取適合的實(shí)驗(yàn)材料：魚卵、豬肝、菜花（花椰菜）、香蕉、雞血、哺乳動(dòng)物的紅細(xì)胞、獼猴桃、洋蔥、豌豆、菠菜、在液體培養(yǎng)基的大腸桿菌思考：哺乳動(dòng)物的紅細(xì)胞的特點(diǎn)？2）破碎細(xì)胞

4、，獲取含DNA的濾液 動(dòng)物細(xì)胞的破碎比較容易，以雞血細(xì)胞為例，在雞血細(xì)胞液中加入一定量的 ，同時(shí)用 攪拌，過濾后收集濾液即可。如果實(shí)驗(yàn)材料是植物細(xì)胞，需要先用 溶解細(xì)胞膜。例如，提取洋蔥的DNA時(shí)，在切碎的洋蔥中加入一定的 和 ，進(jìn)行充分的攪拌和研磨，過濾后收集研磨液。思考：為什么加入蒸餾水能使雞血細(xì)胞破裂？加入洗滌劑和食鹽的作用分別是什么？如果研磨不充分，會對實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生怎樣的影響?此步驟獲得的濾液中可能含有哪些細(xì)胞成分？3）去除濾液中的雜質(zhì) 閱讀課本的三個(gè)方案，思考：為什么反復(fù)地溶解與析出DNA，能夠去除雜質(zhì)？方案二與方案三的原理有什么不同？4）DNA的析出與鑒定 將處理后的溶液過濾，加入

5、與濾液體積 、冷卻的 ，靜置 ，溶液中會出現(xiàn) ，這就是粗提取的DNA。用玻璃棒 攪拌，卷起絲狀物，并用濾紙吸取上面的水分。取兩支20ml的試管，各加入物質(zhì)的量濃度為 的NaCl溶液5ml，將絲狀物放入其中一支試管中，用玻璃棒攪拌，使絲狀物溶解。然后，向兩支試管中各加入4ml的 。混合均勻后，將試管置于 中加熱5min，待試管冷卻后，比較兩支試管溶液顏色的變化，看看溶解有DNA的溶液是否變 。3操作提示以血液為實(shí)驗(yàn)材料時(shí)，每100ml血液中需要加入3g ，防止 。加入洗滌劑后，動(dòng)作要 、 ，否則容易產(chǎn)生大量的泡沫，不利于后續(xù)步驟地操作。加入酒精和用玻璃棒攪拌時(shí)，動(dòng)作要 ，以免 ，導(dǎo)致DNA分子不

6、能形成絮狀沉淀。二苯胺試劑要 ，否則會影響鑒定的效果。4結(jié)果分析與評價(jià)疑難點(diǎn)撥1 DNA的溶解度與NaCl溶液濃度的關(guān)系：當(dāng)NaCl溶液濃度低于0.14mol/L時(shí)，隨濃度的升高，DNA的溶解度降低；當(dāng)NaCl溶液濃度高于0.14mol/L時(shí)，隨濃度升高，DNA的溶解度升高。2 制備雞血細(xì)胞液時(shí)，要在新鮮的雞血中加入檸檬酸鈉的原因制備雞血細(xì)胞液時(shí)，要在新鮮的雞血中加入抗凝劑檸檬酸鈉，防止血液凝固。其原理是檸檬酸鈉能與血漿中Ca2+發(fā)生反應(yīng)，生成檸檬酸鈣絡(luò)合物，血漿中游離的Ca2+大大減少，血液便不會凝固，因?yàn)殡u血紅細(xì)胞，白細(xì)胞都有細(xì)胞核，DNA主要存在于細(xì)胞核中，所以在離心或靜置沉淀后，要棄出

7、上層清液血漿。3提取DNA的第一步是材料的選取，其目的是一定要選取DNA含量較高的生物材料，否則會由于實(shí)驗(yàn)過程中或多或少的損失而造成檢測的困難；第二步是DNA的釋放和溶解，這一步是實(shí)驗(yàn)成功與否的關(guān)鍵，要盡可能使細(xì)胞內(nèi)的DNA全部溶解；第三步是DNA的純化，即根據(jù)DNA的溶解特性、對酶及高溫的耐受性的不同等特性，最大限度地將DNA與雜質(zhì)分開；最后一步是對DNA進(jìn)行鑒定，這是對整個(gè)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果的檢測。4在DNA的析出的步驟中用到玻璃棒攪拌時(shí)，注意動(dòng)作要輕緩，以免加劇DNA分子的斷裂，導(dǎo)致DNA分子不能形成絮狀沉淀。5盛放雞血細(xì)胞液的容器，最好是塑料容器。雞血細(xì)胞破碎以后釋放出的DNA，容易被玻璃容器

8、吸附，由于細(xì)胞內(nèi)DNA的含量本來就比較少，再被玻璃容器吸附去一部分，提取到的DNA就會更少。因此，實(shí)驗(yàn)過程中最好使用塑料的燒杯和試管，這樣可以減少提取過程的DNA的損失。典例解析本實(shí)驗(yàn)中有三次過濾：過濾用蒸餾水稀釋過的雞血細(xì)胞液過濾含粘稠物的0.14mol/LNaCl溶液過濾溶解有DNA的2mol/LNaCl溶液以上三次過濾分別為了獲得（ ）A含核物質(zhì)的濾液、紗布上的粘稠物、含DNA的濾液B含核物質(zhì)的濾液、濾液中DNA粘稠物、含DNA的濾液C含核物質(zhì)的濾液、濾液中DNA粘稠物、紗布上的DNAD含較純的DNA濾液、紗布上的粘稠物、含DNA的濾液答案：A解析:用蒸餾水稀釋雞血細(xì)胞液，使血細(xì)胞的細(xì)胞

9、膜、核膜破裂，釋放出核物質(zhì)，此時(shí)過濾只能得到含DNA和其他物質(zhì)如蛋白質(zhì)的濾液，這種濾液必須經(jīng)過實(shí)驗(yàn)中其他步驟得相繼處理，方能得到較純的DNA。DNA在0.13mol/LNaCl溶液中溶解度最低，成絲狀粘稠物，可經(jīng)過濾留在紗布上。課堂演練一、選擇題（10個(gè)）1.在研究DNA的基因樣本前，采集來的血樣需要蛋白水解酶處理，然后用有機(jī)溶劑除去蛋白質(zhì)。用蛋白水解酶處理血樣的目的是（ D ）A.除去血漿中的蛋白質(zhì) B.除去染色體上的蛋白質(zhì) C.除去血細(xì)胞表面的蛋白質(zhì)D.除去血細(xì)胞中的所有的蛋白質(zhì)，使DNA釋放，便于進(jìn)一步提純2與析出DNA粘稠物有關(guān)的敘述，不正確的是（ C ）A.操作時(shí)緩緩滴加蒸餾水，降低

10、DNA的溶解度 B.在操作A時(shí)，用玻璃棒輕緩攪拌，以保證DNA分子完整 C.加蒸餾水可同時(shí)降低DNA和蛋白質(zhì)的溶解度，兩者均可析出D.當(dāng)絲狀粘稠物不再增加時(shí)，此時(shí)NaCl的濃度相當(dāng)于0.14mol/L3洗滌劑能夠瓦解（ B ），但對DNA沒有影響。A.細(xì)胞壁 B.細(xì)胞膜 C.細(xì)胞核 D.細(xì)胞質(zhì)4在沸水浴的條件下，DNA遇（ D ）會被染成藍(lán)色。A.斐林試劑 B.蘇丹染液 C.雙縮脲試劑 D.二苯胺5在DNA提取過程中，最好使用塑料試管和燒杯，目的是（ B ）A.不易破碎 B.減少提取過程中DNA的損失 C.增加DNA的含量 D.容易洗刷6下列操作中，對DNA的提取量影響最小的是（ B ）A.使

11、雞血細(xì)胞在蒸餾水中充分破裂，放出DNA等核物質(zhì)B.攪拌時(shí)，要使用玻璃棒沿一個(gè)方向輕緩攪拌C.在“析出DNA粘稠物”時(shí)，要緩緩加蒸餾水，直至溶液中粘稠物不再增加D.在用酒精沉淀DNA時(shí)，要使用冷酒精，甚至再將混合液放入冰箱中冷卻E在DNA的溶解和再溶解時(shí)，要充分?jǐn)嚢?DNA的粗提取中，將與濾液體積相等的、冷卻的（ D ），靜置23min，溶液中會出現(xiàn)白色絲狀物。8.以血液為實(shí)驗(yàn)材料時(shí)，需要向血液中加入（ C ），防止血液凝固。A.醋酸鈉 B.龍膽紫 C.檸檬酸鈉 D.醋酸洋紅9.在向溶解DNA的NaCl溶液中，不斷加入蒸餾水的目的是（ C ）A.加快溶解DNA的速度 B.加快溶解雜質(zhì)的速度 C.

12、減少DNA的溶解度，加快DNA析出 D.減小雜質(zhì)的溶解度，加快雜質(zhì)的析出10.去除濾液中的雜質(zhì)時(shí)，直接在濾液中加入嫩肉粉，利用嫩肉粉中的（ C ）分解蛋白質(zhì)。A.胃蛋白酶 B.胰蛋白酶 C.木瓜蛋白酶 D.腸肽酶二、非選擇題（3個(gè)）1提取雞血中DNA時(shí)，要除去血液中的上清液，這是因?yàn)槭裁?？答案：因?yàn)樯锨逡菏茄獫{，不含有血細(xì)胞，DNA存在于沉郁試管底部的雞血細(xì)胞的細(xì)胞核中，所以提取雞血中的DNA時(shí)，要除去血液中的上清液。2填寫本實(shí)驗(yàn)完成下列實(shí)驗(yàn)操作時(shí)所用試劑。提取雞血細(xì)胞中核物質(zhì) 溶解核內(nèi)DNA： 析出2mol/LNaCl溶液中的DNA DNA粘稠物的再溶解 提取雜質(zhì)較少的DNA白色乳狀絲狀物

13、DNA的鑒定 答案：蒸餾水2mol/LNaCl溶液蒸餾水2mol/LNaCl溶液冷卻的95%的酒精二苯胺3.關(guān)于DNA粗提取的實(shí)驗(yàn)材料的選擇，也經(jīng)過了多次實(shí)驗(yàn)效果的比較，最終選擇雞血做實(shí)驗(yàn)材料的原因是什么？請回答下列問題：雞血細(xì)胞中紅細(xì)胞 ，家雞屬于鳥類，新陳代謝旺盛，因而血液中 細(xì)胞樹木較多，可以提供豐富的 。實(shí)驗(yàn)前由老師制備血細(xì)胞液供同學(xué)們做實(shí)驗(yàn)材料，而不用雞全血，主要原因是 。生活在牧區(qū)的人們，采集牛、羊和馬血比較方便，若他們按實(shí)驗(yàn)要求完成實(shí)驗(yàn)步驟后，結(jié)果是 ，這是因?yàn)檫@些動(dòng)物和人一樣，成熟的紅細(xì)胞中 ，但若改用動(dòng)物肝臟做實(shí)驗(yàn)材料，實(shí)驗(yàn)?zāi)茼樌M(jìn)行。這是因?yàn)?。若選用動(dòng)物肝臟做實(shí)驗(yàn)材料，在

14、提取之前，最好增加 程序，使組織細(xì)胞更易分離。答案：含細(xì)胞核；紅；DNA 雞血細(xì)胞液中DNA相對含量很難提取到DNA；無細(xì)胞核；肝細(xì)胞有細(xì)胞核研磨課題2 多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段導(dǎo)學(xué)誘思1PCR原理填寫下列表格參與的組分在DNA復(fù)制中的作用解旋酶DNA母鏈合成子鏈的原料DNA聚合酶引物DNA的兩條鏈?zhǔn)欠聪蚱叫械?，通常將DNA的羥基末端稱為 ，而磷酸基團(tuán)的末端稱為 。DNA聚合酶不能 開始合成DNA，而只能 ，因此，DNA復(fù)制需要引物。DNA的合成方向總是 。在DNA的復(fù)制過程中，復(fù)制的前提是 。在體外可通過控制 來實(shí)現(xiàn)。在 的溫度范圍內(nèi)，DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)將解體，雙鏈分開，這個(gè)過程稱為 。

15、PCR利用了DNA的 原理，通過控制溫度來控制雙鏈的解聚與結(jié)合。由于PCR過程的溫度高，導(dǎo)致DNA聚合酶失活，后來 的DNA聚合酶的發(fā)現(xiàn)和應(yīng)用，大大增加了PCR的效率。PCR反應(yīng)需要在一定的緩沖溶液中提供： ， ， ， ，同時(shí)通過控制溫度使DNA復(fù)制在體外反復(fù)進(jìn)行。2PCR的反應(yīng)過程PCR一般要經(jīng)歷 循環(huán)，每次循環(huán)可以分為 、 和 三步。從第二輪循環(huán)開始，上一次循環(huán)的產(chǎn)物也作為模板參與反應(yīng)，并且由 延伸而成的DNA單鏈會與 結(jié)合，進(jìn)行DNA的延伸，這樣，DNA聚合酶只能 ，使這段固定長度的序列成指數(shù)擴(kuò)增。3實(shí)驗(yàn)操作在實(shí)驗(yàn)室中，做PCR通常使用 ，它是一種薄壁塑料管。具體操作時(shí)，用微量移液器，按

16、PCR反應(yīng)體系的配方在 中依次加入各組分，再參照下表的設(shè)置設(shè)計(jì)好PCR儀的循環(huán)程序即可。4操作提示為避免外源DNA等因素的污染，PCR實(shí)驗(yàn)中使用的 、 、 以及蒸餾水等在使用前必須進(jìn)行 。PCR所用的緩沖液和酶應(yīng)分裝成小份，并在 儲存。使用前，將所需試劑從冰箱拿出，放在冰塊上緩慢融化。在微量離心管中添加反應(yīng)成分時(shí)，移液管上的槍頭要 。疑難點(diǎn)撥1.PCR技術(shù)簡介PCR是一種體外迅速擴(kuò)增DNA片段的技術(shù)，它能以極少量的DNA為模板，在幾小時(shí)內(nèi)復(fù)制出上百萬份的DNA拷貝。這項(xiàng)技術(shù)有效地解決了因?yàn)闃悠分蠨NA含量太低而難以對樣品進(jìn)行分析研究的問題，被廣泛的應(yīng)用于遺傳疾病的診斷、刑偵破案、古生物學(xué)、基因

17、克隆和DNA序列測定等各方面。2細(xì)胞內(nèi)參與DNA復(fù)制的各種組成成分及其作用解旋酶：打開DNA雙鏈 DNA母鏈：提供DNA復(fù)制的模板 4種脫氧核苷酸：合成子鏈的原料 DNA聚合酶：催化合成DNA子鏈 引物：使DNA聚合酶能夠從引物的3，端開始連接脫氧核苷酸（引物是一小段DNA或RNA，它能與DNA母鏈的一段堿基序列互補(bǔ)配對。用于PCR的引物長度通常為2030個(gè)核苷酸）3DNA的合成方向DNA的兩條鏈?zhǔn)欠聪蚱叫械?，通常將DNA的羥基末端稱為3，端，而磷酸基團(tuán)的末端稱為5，端。DNA聚合酶不能從頭開始合成DNA，而只能從3，端延伸DNA鏈，因此，DNA復(fù)制需要引物。當(dāng)引物與DNA母鏈通過堿基互補(bǔ)配對

18、結(jié)合后，DNA聚合酶就能從引物的3，端開始延伸DNA鏈，DNA的合成方向總是從子鏈的5，端向3，端延伸。4PCR的反應(yīng)過程PCR一般要經(jīng)歷三十多次循環(huán)，每次循環(huán)可以分為變性（當(dāng)溫度上升到90oC以上時(shí)，雙鏈DNA解聚為單鏈）、復(fù)性（溫度下降到50oC左右，兩種引物通過堿基互補(bǔ)配對與兩條單鏈DNA結(jié)合）和延伸（溫度上升到72oC左右，溶液中的四種脫氧核苷酸在DNA聚合酶的作用下，根據(jù)堿基互補(bǔ)配對原則合成新的DNA鏈）三步。從第二輪循環(huán)開始，上一次循環(huán)的產(chǎn)物也作為模板參與反應(yīng)，并且由引物延伸而成的DNA單鏈會與引物結(jié)合，進(jìn)行DNA的延伸，這樣，DNA聚合酶只能特異的復(fù)制處于兩個(gè)引物之間的DNA序列

19、，使這段固定長度的序列成指數(shù)擴(kuò)增。5PCR技術(shù)與DNA的復(fù)制PCR反應(yīng)是通過控制溫度使DNA復(fù)制在體外反復(fù)進(jìn)行。PCR反應(yīng)的實(shí)質(zhì)就是DNA復(fù)制，所以有關(guān)PCR反應(yīng)的題目與DNA復(fù)制的原理相同，計(jì)算方法也大體相同。例如：PCR反應(yīng)中的目的片段一般以2n的方式積累，其中n為反應(yīng)循環(huán)次數(shù)。一個(gè)DNA片段在30次循環(huán)后反應(yīng)物中大約有10億個(gè)這樣的片段。（230）典例解析一個(gè)由15N標(biāo)記的DNA分子，放在沒有標(biāo)記的環(huán)境中培養(yǎng)，利用PCR循環(huán)5次后標(biāo)記的DNA分子總數(shù)的（ ）A 1/10 B 1/5 C 1/16 D1/25答案：C解析：一個(gè)DNA分子利用PCR技術(shù)循環(huán)5次后產(chǎn)生的DNA分子數(shù)目為2n。而

20、DNA的復(fù)制是半保留復(fù)制，其特點(diǎn)是：新形成的DNA雙鏈，一條是來自親代DNA分子的母鏈，另一條是新形成的子鏈。這樣最初由15N標(biāo)記的DNA分子復(fù)制后，其標(biāo)記的兩條鏈就分別進(jìn)入兩個(gè)子代DNA分子中，這樣兩個(gè)子代DNA分子被標(biāo)記了。以后均是在沒有標(biāo)記的環(huán)境中培養(yǎng)，不論經(jīng)過多少次復(fù)制，最初標(biāo)記的兩條鏈?zhǔn)冀K存在于兩個(gè)DNA分子中，這樣經(jīng)過n次循環(huán)后，標(biāo)記的DNA分子中2/2n,即1/2n-1。課堂演練一選擇題（10個(gè)）1DNA分子復(fù)制時(shí)，解旋的兩條鏈中（ C ）A僅一條作為復(fù)制模板 B兩條鏈作為模板并復(fù)制出兩個(gè)不同的DNA分子C兩條鏈作為模板并復(fù)制出兩個(gè)相同的DNA分子D兩條鏈作為模板，各自合成一條子

21、鏈，然后兩條母鏈重新結(jié)合為原來的雙螺旋分子，兩條新鏈結(jié)合成一個(gè)全新的DNA分子2.下列關(guān)于DNA復(fù)制過程的正確順序是（ D ）互補(bǔ)堿基對之間氫鍵斷裂互補(bǔ)堿基對之間形成氫鍵DNA分子在解旋酶的作用下解旋以解旋后的母鏈為模板進(jìn)行堿基互補(bǔ)配對子鏈與母鏈盤旋成雙螺旋狀結(jié)構(gòu)A B C D3.下列各項(xiàng)過程中，遵循“堿基互補(bǔ)配對原則”的有（ A ）DNA復(fù)制RNA復(fù)制轉(zhuǎn)錄翻譯逆轉(zhuǎn)錄A B C D4.實(shí)驗(yàn)室內(nèi)模擬生物體DNA的復(fù)制必需的一組條件是（ D ）酶游離的脫氧核苷酸ATPDNA分子mRNAtRNA適宜的溫度適宜的酸堿度A B C D5.利用PCR技術(shù)，把一個(gè)雙鏈DNA分子當(dāng)作第一代，經(jīng)過3次循環(huán)，在第

22、四代DNA分子中，有幾條第一代脫氧核苷酸的長鏈？（ A ）A 2 B 4 C 8 D 16，6.關(guān)于DNA分子的敘述中，正確的是（ C ）A .DNA的兩條鏈?zhǔn)菢O性相同，同向平行 B.DNA的兩條鏈?zhǔn)菢O性相同，反向平行C.DNA的兩條鏈中極性不同，反向平行的 D.DNA的兩條鏈?zhǔn)菢O性不同，同向平行7.假設(shè)PCR反應(yīng)中，只有一個(gè)DNA的片段作為模板，請計(jì)算在30次循環(huán)后，反應(yīng)物中大約有多少這樣的DNA片段（ B ）A 215 B 230 C 260 D 2318.DNA的合成方向總是（ C ）延伸。A從DNA分子的左端向右端 B從DNA分子的右端向左端C從子鏈的5，端向3，端 D從子鏈的3，端向

23、5，端9.要使PCR反應(yīng)在體外的條件下順利地進(jìn)行，需要嚴(yán)格的控制（ C ）A 氧氣的濃度 B酸堿度 C溫度 D 大氣的濕度10.DNA分子經(jīng)PCR反應(yīng)循環(huán)一次后，新合成的那條子鏈的脫氧核苷酸的序列應(yīng)與（ ）A模板母鏈相同 B非模板母鏈相同 C兩條模板母鏈相同 D兩條模板母鏈都不相同二非選擇題（2個(gè)）1PCR技術(shù)是把某一DNA片段在實(shí)驗(yàn)條件下，合成許許多多相同片段的一種方法，利用這種技術(shù)能快速而特異的擴(kuò)增任何要求的目的基因或者DNA分子片段，“人類基因組計(jì)劃”的研究中常用到這種技術(shù)。請結(jié)合有關(guān)知識，回答有關(guān)此技術(shù)的一些問題：PCR技術(shù)能把某一DNA片段進(jìn)行擴(kuò)增，依據(jù)的原理是： 在實(shí)驗(yàn)條件下，DN

24、A分子進(jìn)行擴(kuò)增，除了所要擴(kuò)增的DNA片段處，還需要 、和 、 等條件。某DNA片段有160個(gè)堿基，其中有腺嘌呤35個(gè)，若讓該DNA分子擴(kuò)增三次（即復(fù)制三次）至少需要腺嘌呤脫氧核苷酸和鳥嘌呤脫氧核苷酸的數(shù)目分別是 和 個(gè)。答案：DNA分子具有雙螺旋結(jié)構(gòu)和DNA分子中堿基的互補(bǔ)配對四種脫氧核苷酸、能量、酶 245、3152將大腸桿菌置于含15N的培養(yǎng)基上培養(yǎng)。這樣，后代大腸桿菌細(xì)胞中的DNA雙鏈均被15N標(biāo)記。然后將被15N標(biāo)記的大腸桿菌作為親代轉(zhuǎn)到普通培養(yǎng)基中，繁殖兩代。親代、第一代、第二代大腸桿菌DNA的狀況如圖所示。第一代大腸桿菌DNA貯存的遺傳信息與親代大腸桿菌DNA貯存的遺傳信息完全相同

25、的原因是 。如果將第二代大腸桿菌的DNA分子總量作為整體1，其中，帶有15N的第二代大腸桿菌DNA分子約占總量的 %。如果將第二代大腸桿菌的DNA含量作為整體1，其中含15N標(biāo)記的第二代大腸桿菌的DNA含量（脫氧核苷酸單鏈）約占總量的 %答案：它們均是以親代15N標(biāo)記的DNA雙鏈的每條鏈為模板，通過堿基互補(bǔ)配對原則合成的50 25課題3 血紅蛋白的提取和分離導(dǎo)學(xué)誘思1凝膠色譜法凝膠色譜法也稱做 ，是根據(jù) 分離蛋白質(zhì)的有效方法。凝膠實(shí)際上是一些由 構(gòu)成的多孔球體，在小球體內(nèi)部有許多貫穿的通道，相對分子質(zhì)量不同的蛋白質(zhì)分子通過凝膠時(shí)速度不同，相對分子質(zhì)量較小的蛋白質(zhì) 進(jìn)入凝膠內(nèi)部的通道，路程 ，移

26、動(dòng)速度 ；而相對分子質(zhì)量 的蛋白質(zhì)無法進(jìn)入凝膠內(nèi)部的通道，只能在 移動(dòng)，路程 ，移動(dòng)速度 。相對分子質(zhì)量不同的蛋白質(zhì)分子因此得以分離。2緩沖溶液緩沖溶液的作用是 。緩沖溶液通常由 溶解于水中配制而成的。生物體內(nèi)進(jìn)行的各種生物化學(xué)反應(yīng)都是在一定的pH下進(jìn)行的，例如：血漿的pH是 ，要在實(shí)驗(yàn)條件下準(zhǔn)確模擬生物體內(nèi)的過程，必須保持體外的pH與體內(nèi)的基本一致。3電泳電泳是指 。許多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有可解離的基團(tuán)，在一定的pH下，這些基團(tuán)會帶上 。在電場的作用下，這些帶電分子會向著與其所帶電荷 的電極移動(dòng)。電泳利用了待分離樣品中各分子 以及分子本身的 、 的不同，使帶電分子產(chǎn)生不同的

27、 ，從而實(shí)現(xiàn)樣品中各種分子的分離。兩種常用的電泳方法是 和 ，在測定蛋白質(zhì)分子量時(shí)通常使用 。蛋白質(zhì)在聚丙烯酰胺凝膠中的遷移率取決于 以及 等因素。4蛋白質(zhì)的提取和分離蛋白質(zhì)的提取和分離一般分為四步： 、 、 和 。5樣品處理血液由 和 組成，其中紅細(xì)胞最多。紅細(xì)胞具有 的特點(diǎn)。紅細(xì)胞中有一種非常重要的蛋白質(zhì) ，其作用是 ，血紅蛋白有 個(gè)肽鏈組成，包括 ，其中每條肽鏈環(huán)繞一個(gè) ，磁基團(tuán)可攜帶 。血紅蛋白因含有 呈現(xiàn)紅色。紅細(xì)胞的洗滌 洗滌紅細(xì)胞的目的是 ，采集的血樣要及時(shí)采用 分離紅細(xì)胞，然后用膠頭吸管吸出上層透明的 ，將下層暗紅色的 倒入燒杯，再加入 ，緩慢攪拌 ，低速短時(shí)間離心，如此重復(fù)洗

28、滌三次，直至 ，表明紅細(xì)胞已洗滌干凈。血紅蛋白的釋放 在 和 作用下，紅細(xì)胞破裂釋放出血紅蛋白。分離血紅蛋白溶液 將攪拌好的混合溶液離心后，試管中的溶液分為4層。第一層為無色透明的 ，第2層為白色薄層固體，是 ，第3層是紅色透明液體，這是 ，第4層是其他雜質(zhì)的暗紅色沉淀物。將試管中的液體用濾紙過濾，除去之溶性沉淀層，于分液漏斗中靜置片刻后，分出下層的紅色透明液體。透析 取1mL的血紅蛋白溶液裝入 中，將透析袋放入盛有300mL的物質(zhì)的量的濃度為20mmol/L的 中，透析12h。透析可以去除樣品中 的雜質(zhì)，或用于更換樣品的 。6凝膠色譜操作第一步要制作 ，第二步要 ，因?yàn)?，所以裝柱前需要根據(jù)

29、色譜柱的內(nèi)體積計(jì)算所需要的凝膠量。在裝填凝膠柱時(shí)，不得有 存在。因?yàn)闅馀輹?，降低分離效果。第三步是 。疑難點(diǎn)撥1凝膠色譜法分離蛋白質(zhì)的原理凝膠色譜法也稱為分配色譜法，它是根據(jù)分子量的大小分離蛋白質(zhì)的方法之一。所用的凝膠實(shí)際上是一些微小的多孔球體，這些小球體大多數(shù)是由多糖類化合物構(gòu)成，小球體內(nèi)部有許多貫穿的通道，當(dāng)一個(gè)含有各種分子的樣品溶液緩慢流經(jīng)時(shí)，各分子在色譜柱內(nèi)進(jìn)行兩種不同的運(yùn)動(dòng)，即垂直向下的運(yùn)動(dòng)和無規(guī)則的擴(kuò)散運(yùn)動(dòng)，相對分子質(zhì)量較大的蛋白質(zhì)分子不能進(jìn)入凝膠顆粒內(nèi)部，只能分布在顆粒之間，通過的路程較短，移動(dòng)速度較快；相對分子質(zhì)量較小的蛋白質(zhì)分子比較容易進(jìn)入凝膠內(nèi)的通道，通過的路程較長，移動(dòng)

30、速度較慢。因此，樣品中相對分子質(zhì)量較大的蛋白質(zhì)先流出，相對分子質(zhì)量中等的分子后流出，相對分子質(zhì)量最小的分子最后流出，這種現(xiàn)象又叫分子篩現(xiàn)象。此外，凝膠本身具有三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，相對分子質(zhì)量大的分子通過這種網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)上的空襲時(shí)阻力大，而相對分子質(zhì)量小的分子通過時(shí)阻力小，因此不同分子量的蛋白質(zhì)分子可以獲得分離。2與其他真核細(xì)胞相比，紅細(xì)胞的特點(diǎn)及這一特點(diǎn)對進(jìn)行蛋白質(zhì)的分離的意義哺乳動(dòng)物及人的成熟的紅細(xì)胞是雙面凹圓餅狀，沒有細(xì)胞核和細(xì)胞器。其含有的血紅蛋白是有色蛋白，因此在凝膠色譜分離時(shí)可以通過觀察顏色來判斷什么時(shí)候應(yīng)該收集脫液。這使血紅蛋白的分離過程非常直觀，大大簡化了實(shí)驗(yàn)操作。3電泳的作用及其原理電泳

31、是指帶電粒子在電場的作用下發(fā)生遷移的過程。許多重要的生物大分子，如氨基酸、多肽、蛋白質(zhì)、核苷酸、核酸等都具有可解離基團(tuán)，它們在某個(gè)特定的pH下會帶上正電或負(fù)電；在電場的作用下，這些帶電分子會向著與其所帶電荷相反的電極方向移動(dòng)。電泳技術(shù)就是在電場的作用下，利用待分離樣品中各種分子帶電性質(zhì)以及分子本身大小、形狀等性質(zhì)的差異，使帶電分子產(chǎn)生不同的遷移速度，從而達(dá)到對樣品進(jìn)行分離、鑒定或提純的目的。典例解析用凝膠色譜法分離蛋白質(zhì)時(shí)，分子量大的蛋白質(zhì)（ D ）A路程較長，移動(dòng)速度較慢 B路程較長，移動(dòng)速度較快C路程較短，移動(dòng)速度較慢 D路程較短，移動(dòng)速度較快解析：在小球體內(nèi)部有許多貫穿的通道，當(dāng)相對分子

32、質(zhì)量不同的蛋白質(zhì)通過凝膠時(shí)，相對分子質(zhì)量較小的蛋白質(zhì)容易進(jìn)入凝膠內(nèi)部的通道，路程較長，移動(dòng)速度較慢；而相對分子質(zhì)量較大的蛋白質(zhì)無法進(jìn)入凝膠內(nèi)部的通道，只能在凝膠外部移動(dòng)，路程較短，移動(dòng)速度較快。課堂演練一 選擇題1凝膠色譜法是根據(jù)（ B ）分離蛋白質(zhì)的有效方法。A分子的大小 B相對分子質(zhì)量的大小 C帶電荷的多少 D溶解度2緩沖液的作用是：在一定范圍內(nèi)，抵制外界的影響來維持（ B ）基本不變。A溫度 B pH C滲透壓 D氧氣濃度3電泳是指帶電粒子在電場的作用下向著與其所帶電荷（ B ）的電極移動(dòng)。A相同 B相反 C相對 D相向4.哺乳動(dòng)物和人的成熟的紅細(xì)胞中的（ A ）與氧氣的運(yùn)輸有關(guān)。A血紅

33、蛋白 B肌紅蛋白 C肌動(dòng)蛋白 D肌球蛋白5血液由血漿和各種血細(xì)胞組成，其中（ C ）的含量最多。A白細(xì)胞 B血小板 C紅細(xì)胞 D淋巴細(xì)胞6為防止血液凝固，在采血容器中要預(yù)先加入抗凝血?jiǎng)?D ）。A. NaCl B.甲苯 C.蒸餾水 D.檸檬酸鈉7將攪拌好的混合液轉(zhuǎn)移到離心管中，離心后，可以明顯看到試管中的溶液分為4層，其中第3層是（ C ）A無色透明的甲苯層 B脂溶性物質(zhì)的沉淀層 C血紅蛋白的水溶液 D其他雜質(zhì)的暗紅色沉淀物二 非選擇題1電泳利用了待分離樣品中各種分子 以及 、 的不同，使帶電分子產(chǎn)生不同的遷移速率，從而實(shí)現(xiàn)樣品中各種分子的分離。答案：帶電性質(zhì)的差異；分子本身的大??；形狀的不

34、同2你能描述血紅蛋白分離的完整過程嗎？答案：血紅蛋白提取和分離的程序可分為四大步。包括：樣品處理、粗分離、純化和純度鑒定。首先通過洗滌紅細(xì)胞、血紅蛋白的釋放、離心等操作收集到血紅蛋白溶液，即樣品的處理；在經(jīng)過透析去除分子量較小的雜質(zhì)，即樣品的粗分離；然后通過凝膠色譜法將相對分子質(zhì)量大的雜質(zhì)蛋白除去，即樣品的純化；最后經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行純度鑒定。專題知識歸納基礎(chǔ)知識：提取DNA的方法 實(shí)驗(yàn)材料的選取 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 破碎細(xì)胞，獲取含DNA的濾液 去除濾液中的雜質(zhì)DNA的粗提取 DNA的析出與鑒定與鑒定 以血液為材料要防止血液凝固DNA和蛋白質(zhì)技術(shù) 操作提示 加入洗滌劑后，動(dòng)作要輕緩；加入酒精和用

35、玻璃棒攪拌時(shí)，動(dòng)作要輕緩 二苯胺試劑要現(xiàn)配現(xiàn)用結(jié)果分析與評價(jià)課題延伸PCR原理 基礎(chǔ)知識 PCR的反應(yīng)過程 多聚酶鏈?zhǔn)椒?實(shí)驗(yàn)操作應(yīng)擴(kuò)增DNA 操作提示片段 結(jié)果分析與評價(jià) 課題延伸 凝膠色譜法血紅蛋白的提 基礎(chǔ)知識 緩沖溶液取和分離 電泳 樣品處理實(shí)驗(yàn)操作 凝膠色譜操作 SDS聚丙烯酰凝膠電泳 紅細(xì)胞的洗滌實(shí)驗(yàn)操作 色譜主填料的處理 凝膠色譜柱的裝填 蛋白質(zhì)的分離結(jié)果分析與評價(jià)課題延伸專題知識檢測一、選擇題1DNA的溶解度最低時(shí)，NaCl的物質(zhì)的量濃度為（ C ）2DNA不溶解于（ C ）A.NaCl溶液 B.KCl溶液 C.酒精溶液 D.MgCl2溶液3鑒定DNA的試劑是（ D ）A.斐林

36、試劑 B蘇丹染液 C.雙縮脲試劑 D.二苯胺試劑4在向溶解DNA得NaCl溶液中，不斷加入蒸餾水的目的是（ C ）A.加快溶解DNA的速度 B.加快溶解雜質(zhì)的速度 C.減小DNA的溶解度，加快DNA析出 D.減小雜質(zhì)的溶解度，加快雜質(zhì)的析出5在DNA的粗提取過程中，初步析出DNA和提取較純凈的DNA所用的藥品的濃度及其名稱分別是（ B ）0.1g/ml檸檬酸鈉溶液2mol/LNaCl溶液0.14mol/LNaCl溶液體積分?jǐn)?shù)為95%的酒精溶液0.015mol/LNaCl溶液0.04mol/LNaCl溶液A. B. C. D.6關(guān)于DNA的粗提取與鑒定實(shí)驗(yàn)的表達(dá)哪項(xiàng)是錯(cuò)誤的（C ）A.離心沉淀的

37、血細(xì)胞中加水是為了提取DNAB.NaCl溶液的物質(zhì)的量濃度為2mol/L時(shí)，DNA溶解C.向溶解的DNA燒杯中加蒸餾水是漂洗DNAD.離心后除去血液中的上清液是為了除去雜質(zhì)7 下列關(guān)于實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象的正確描述是（ C ）A.向盛有果糖溶液的試管中加入斐林試劑，產(chǎn)生轉(zhuǎn)紅色沉淀B.紙層析法分離葉綠體中的色素時(shí)，濾紙條上最寬的色素帶呈黃綠色C.DNA的粗提取中，第二次加入蒸餾水并攪拌，能析出含DNA的黏稠物D.同一葉片受SO2危害的順序是先葉柄后葉片8 關(guān)于DNA在NaCl溶液中的溶解度，下面的敘述哪一個(gè)是正確的（ D ）A.隨著NaCl溶液濃度增大，DNA在NaCl溶液中的溶解度也增大B.隨著NaCl溶

38、液濃度的減小，DNA在NaCl溶液中的溶解度也減小C.DNA在NaCl溶液中的溶解度與NaCl溶液的濃度無關(guān)9某DNA分子共有a個(gè)堿基，其中含胞嘧啶m個(gè)，則該DNA分子利用PCR技術(shù)循環(huán)了3次，需要游離的胸腺嘧啶脫氧核苷酸數(shù)為（ C ）A.7（a-m）B.8(a-m) C.7（1/2a-m） D.8（2a-m）10卵原細(xì)胞在進(jìn)行DNA復(fù)制時(shí)，細(xì)胞中不可能出現(xiàn)的是（D ）A.解旋 B.蛋白質(zhì)合成 C.基因突變 D.基因重組 11在一個(gè)密閉的容器中，利用PCR技術(shù)用含有同位素13C的脫氧核苷酸合成一個(gè)DNA分子，然后再加入普通的含12C的脫氧核苷酸，經(jīng)n次循環(huán)后，所得DNA分子中含12C的脫氧核苷酸鏈數(shù)與含13C的脫氧核苷酸鏈數(shù)之比是（ D ）A.2n：1 B.（2n-2）：n C.（2n-2）：2 D.（2n-2）：112在PCR技術(shù)中，能打開DNA雙鏈的酶是（ C ）A.DNA聚合酶 B.RNA聚合酶 C.解旋酶 D.DNA酶13某DNA分子有2000個(gè)脫氧核苷酸，已知它的一條單鏈上堿基A：G：T：C=1：2：3：4，若利用PCR技術(shù)使該分子循環(huán)了一次，則需要腺嘌呤脫氧核苷酸的數(shù)量是（ C ）A.200個(gè) B.300個(gè) C.400個(gè) D.800個(gè)14某些藥物