液質(zhì)聯(lián)用(LCMS)原理簡析

1、液質(zhì)聯(lián)用（LCMS）原理簡析1.質(zhì)譜法質(zhì)譜分析是先將物質(zhì)離子化，按離子的質(zhì)荷比分離，然后測量各種離子譜峰的強度而實現(xiàn)分析目的的一種分析方法。質(zhì)譜的樣品一般要汽化，再離子化。不純的樣品要用色譜和質(zhì)譜聯(lián)用儀，是通過色譜進樣。即色譜分離，質(zhì)譜是色譜的檢測器。離子在電場和磁場的綜合作用下，按照其質(zhì)量數(shù)m和電荷數(shù)Z的比值(m/z，質(zhì)荷比)大小依次排列成譜被記錄下來，以檢測器檢測到的離子信號強度為縱坐標，離子質(zhì)荷比為橫坐標所作的條狀圖就是我們常見的質(zhì)譜圖。2.質(zhì)譜儀質(zhì)譜儀由以下幾部分組成 數(shù)據(jù)及供電系統(tǒng) 進樣系統(tǒng) 離子源 質(zhì)量分析器 檢測接收器 真空系統(tǒng)質(zhì)譜儀一般由進樣系統(tǒng)、離子源、分析器、檢測器組成。還

2、包括真空系統(tǒng)、電氣系統(tǒng)和數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)等輔助設備。（1）離子源：使樣品產(chǎn)生離子的裝置叫離子源。液質(zhì)的離子源有ESI，APCI，APPI，統(tǒng)稱大氣壓電離(API)源，實驗室常用液質(zhì)的離子源為ESI源。電噴霧（ESI）的特點通常小分子得到M+H+ +,M+Na+ 或M-H-單電荷離子，生物大分子產(chǎn)生多電荷離子。電噴霧電離是最軟的電離技術，通常只產(chǎn)生分子離子峰，因此可直接測定混合物，并可測定熱不穩(wěn)定的極性化合物；其易形成多電荷離子的特性可分析蛋白質(zhì)和DNA等生物大分子；通過調(diào)節(jié)離子源電壓控制離子的碎裂（源內(nèi)CID）得到化合物的部分結(jié)構(gòu)。（2）質(zhì)量分析器： 由它將離子源產(chǎn)生的離子按m/z分開。離子通過分

3、析器后,按不同質(zhì)荷比(M/Z)分開,將相同的M/Z離子聚焦在一起,組成質(zhì)譜。質(zhì)量分析器有：磁場和電場、四極桿、離子阱、飛行時間質(zhì)譜、傅立葉變換離子回旋共振等。實驗室目前液質(zhì)的質(zhì)量分析器類型：三重四極桿（QqQ）：離子源第一分析器碰撞室第二分析器接收器MS1 MS2Q1 q2 Q3QqQ儀器可以方便的改變離子的動能，因此掃描速度快，體積小，常作為臺式進入常規(guī)實驗室，缺點是質(zhì)量范圍及分辨率有限，不能進行高分辨測定，只能做到單位質(zhì)量分辨。在液質(zhì)聯(lián)機中使用的碎片化手段，能量都是以碰撞的形式輸送給分子離子，這個能量足以使得處在能量亞穩(wěn)態(tài)分子中的某些化學鍵斷裂并使一些特定的分子發(fā)生結(jié)構(gòu)重排。（3）碰撞誘導

4、解離CID質(zhì)譜：QqQ檢測器中的碰撞反應在CID中進行。選擇一定質(zhì)量的離子作為母體離子，進入碰撞室，室內(nèi)充有靶子反應氣體(本實驗室選擇高純氦) ，發(fā)生離子分子碰撞反應，從而產(chǎn)生子離子，再經(jīng)MS2的分析器及接受器得到子離子質(zhì)譜，一般稱做CID (collision-induced dissociation)譜。（4）檢測器：離子檢測器由收集器和放大器組成。打在收集器上的正離子流產(chǎn)生與離子流豐度成正比的信號。（5）真空系統(tǒng)：質(zhì)譜儀的離子源、質(zhì)量分析器和檢測器必須在高真空狀態(tài)下工作，以減少本底的干擾，避免發(fā)生不必要的離子-分子反應。所以質(zhì)譜反應屬于單分子分解反應。利用這個特點，我們用液質(zhì)聯(lián)用的軟電離

5、方式可以得到化合物的準分子離子，從而得到分子量。由機械真空泵(前極低真空泵)，擴散泵或分子泵(高真空泵)組成真空機組，抽取離子源和分析器部分的真空。只有在足夠高的真空下，離子才能從離子源到達接收器，真空度不夠則靈敏度低。實驗時要注意觀察質(zhì)譜的真空度狀態(tài)，如有異常，及時向相關老師匯報。3. 質(zhì)譜儀的聯(lián)用技術質(zhì)譜儀可以與其他儀器聯(lián)用，如氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（GC/MS）、高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（HPLC/MS）；也可以質(zhì)譜-質(zhì)譜聯(lián)用（MS-MS）。（1） GC/MS、HPLC/MS儀：基于色譜和質(zhì)譜的儀器靈敏度相當，加之使分離效果好的色譜成為質(zhì)譜的進樣器，而速度快、分離好、應用廣的質(zhì)譜儀作為色譜的鑒

6、定器，使它們成為目前最好的用于分析微量的有機混合物的儀器。（2）液質(zhì)聯(lián)用與氣質(zhì)聯(lián)用的區(qū)別:氣質(zhì)聯(lián)用儀(GC-MS)是最早商品化的聯(lián)用儀器，適宜分析小分子、易揮發(fā)、熱穩(wěn)定、能氣化的化合物；用電子轟擊方式（EI）得到的譜圖，可與標準譜庫對比。液質(zhì)聯(lián)用(LC-MS)主要可解決如下幾方面的問題：不揮發(fā)性化合物分析測定；極性化合物的分析測定；熱不穩(wěn)定化合物的分析測定；大分子量化合物（包括蛋白、多肽、多聚物等）的分析測定；一般沒有商品化的譜庫可對比查詢，只能自己建庫或自己解析譜圖。 所以目前液質(zhì)聯(lián)用在環(huán)境領域主要應用于有標準物質(zhì)參照情況下的定性分析。（3）MS-MS：質(zhì)譜-質(zhì)譜法是70年代后期迅猛發(fā)展起來

7、的。這種方法是指用質(zhì)譜作質(zhì)量分離的質(zhì)譜技術(mass separetion-mass spectracharacterization)。 它可以研究母離子和子離子的關系，讓大的離子進一步裂解，獲得裂解過程及離子組成的信息。它有幾種稱呼，如質(zhì)譜-質(zhì)譜法（MS-MS或MS/MS）,串聯(lián)質(zhì)譜,二維質(zhì)譜法,序貫質(zhì)譜。本實驗室的質(zhì)譜檢測器為三重四極桿檢測器，屬于MS/MS型質(zhì)譜檢測器。（4）有機質(zhì)譜局限性:異構(gòu)體，立體化學方面區(qū)分能力差。重復性稍差，要嚴格控制操作條件。所以不能象低場NMR，IR等自己動手，須專人操作。有離子源產(chǎn)生的記憶效應，污染等問題。價格昂貴，分析成本高，操作復雜。4. 質(zhì)譜儀性能指

8、標(1)質(zhì)量范圍:即儀器測量質(zhì)量數(shù)的范圍。(2)分辨率：即表示儀器分開兩個相鄰質(zhì)量離子的能力，通常用R表示，實驗室內(nèi)的TSQ Quantum分別率為0.7。(3)質(zhì)量測量精度：離子質(zhì)量測定的精度，一般對質(zhì)量幾百的離子，測量誤差應0.003質(zhì)量單位。5.基本術語(1)質(zhì)譜圖:質(zhì)譜圖一般都采用“條圖”，或稱為棒狀圖。在圖中橫軸表示質(zhì)荷比（m/z，因為Z接近于1，故實際上m/z多為離子的質(zhì)量）?？v軸則表示峰的相對強度(RA,相對豐度)。(2)質(zhì)荷比: 離子質(zhì)量(以相對原子量單位計)與它所帶電荷(以電子電量為單位計)的比值,寫作m/Z。(3)峰: 質(zhì)譜圖中的離子信號通常稱為離子峰或簡稱峰。(4)離子豐

9、度: 檢測器檢測到的離子信號強度。峰越高表示形成的離子越多，也就是說，譜線的強度是與離子的多少成正比的。(5)基準峰：在質(zhì)譜圖中，指定質(zhì)荷比范圍內(nèi)強度最大的離子峰稱作基峰，其離子峰的峰高作為100%,而以對它的百分比來表示其他離子峰的強度。(6)總離子流圖:在選定的質(zhì)量范圍內(nèi)，所有離子強度的總和對時間或掃描次數(shù)所作的圖,也稱TIC圖.(7)質(zhì)量色譜圖:指定某一質(zhì)量(或質(zhì)荷比)的離子其強度對時間所作的圖。利用質(zhì)量色譜圖來確定特征離子，在復雜混合物分析及痕量分析時是LC/MS測定中最有用的方式。當樣品濃度很低時LC/MS的TIC上往往看不到峰，此時，根據(jù)得到的分子量信息，輸入M+1或M+23等數(shù)值

10、，觀察提取離子的質(zhì)量色譜圖，檢驗直接進樣得到的信息是否在LC/MS上都能反映出來，確定LC條件是否合適，以后進行SRM等其他掃描方式的測定時可作為參考。10090807060504030201002.03.04.01009080706050403020102.03.04.05.06.06. 影響離子豐度的主要因素：峰的強度反映出該碎片離子的多少，峰強表示該種離子多，峰弱表示該種離子少。影響離子豐度的主要因素：1.鍵的相對強度：2.產(chǎn)物離子的穩(wěn)定性：這是影響產(chǎn)物離子豐度的最重要因素。3原子或基團相對的空間排列（空間效應）：空間因素影響競爭性的單分子反應途徑，也影響產(chǎn)物的穩(wěn)定性。4. Steven

11、son 規(guī)則：5.最大烷基的丟失等。7質(zhì)譜中離子的類型質(zhì)譜中的離子有多種類型，最基本的有：（1）分子離子指與分子存在簡單關系的離子，通過它可以確定分子量。液質(zhì)中最常見的準分子離子峰是M+H+ 或M-H-。在ESI中, 有時會生成質(zhì)量大于分子量的離子如M+1, M+23, M+39, M+18.稱準分子離子,表示為:M+H+,M+Na+等。分子離子有時又叫母離子，是一切碎片離子的母離子，即一切碎片離子是通過分子離子再進一步裂解得到的。寫質(zhì)譜裂解反應要從分子離子寫起。（2）碎片離子：準分子離子經(jīng)過一級或多級裂解生成的產(chǎn)物離子。碎片峰的種類、數(shù)目及其豐度則與分子結(jié)構(gòu)、儀器類型、分析條件等因素有關,數(shù)

12、目多表示該分子較容易斷裂,豐度高的碎片峰表示該離子較穩(wěn)定,也表示分子比較容易斷裂生成該離子。（3）多電荷離子：指帶有2個或更多電荷的離子,常見于蛋白質(zhì)或多肽等離子.有機質(zhì)譜中,單電荷離子是絕大多數(shù),只有那些不容易碎裂的基團或分子結(jié)構(gòu)-如共軛體系結(jié)構(gòu)-才會形成多電荷離子。它的存在說明樣品是較穩(wěn)定的。（4）同位素離子由元素的重同位素構(gòu)成的離子稱為同位素離子.各種元素的同位素,基本上按照其在自然界的豐度比出現(xiàn)在質(zhì)譜中,這對于利用質(zhì)譜確定化合物及碎片的元素組成有很大方便, 還可利用穩(wěn)定同位素合成標記化合物,如:氘等標記化合物,再用質(zhì)譜法檢出這些化合物,在質(zhì)譜圖外貌上無變化,只是質(zhì)量數(shù)的位移,從而說明化

13、合物結(jié)構(gòu),反應歷程等。8.掃描模式的選擇（1）正負離子模式:一般的商品儀器中,ESI和APCI接口都有正負離子測定模式可供選擇。一般不要選擇兩種模式同時進行。正、負離子模式建議根據(jù)文獻選擇。選擇的一般原則為：正離子模式：適合于堿性樣品，可用乙酸或甲酸對樣品加以酸化。樣品中含有仲氨或叔氨時可優(yōu)先考慮使用正離子模式。 負離子模式：適合于酸性樣品，可用氨水或三乙胺對樣品進行堿化。樣品中含有較多的強伏電性基團，如含氯、含溴和多個羥基時可嘗試使用負離子模式。（2） 全掃描方式（Q1掃描）全掃描數(shù)據(jù)采集可以得到化合物的準分子離子，從而可判斷出化合物的分子量，用于鑒別是否有未知物，并確認一些判斷不清的化合物

14、，如合成化合物的質(zhì)量及結(jié)構(gòu)。（3）母離子掃描母離子分析可用來鑒定和確認類型已知的化合物，盡管它們的母離子的質(zhì)量可以不同，但在分裂過程中會生成共同的子離子，這種掃描功能在藥物代謝研究中十分重要。LC-MS中常見的本底離子m/z 50-150, 溶劑離子，(H2O)nH+ ，n= 3-112m/z 102, H+乙腈 +乙酸, C4H7NO2H+,102.0549m/z149, 管路中鄰苯二甲酸酯的酸酐, C8H4O3H+,149.0233 m/z 288, 2mm 離心管的產(chǎn)生的特征離子m/z 279, 管路中鄰苯二甲酸二丁酯 C16H22O4H+, 279.1591 m/z 316, 2mm

15、離心管的產(chǎn)生的特征離子m/z 384, 瓶的光穩(wěn)定劑產(chǎn)生的離子m/z391, 管路中鄰苯二甲酸二辛酯, C24H38O4H+, 391.2843 m/z413, 鄰苯二甲酸二辛酯+鈉, C24H38O4Na+, 413.2668m/z 538, 乙酸+氧 +鐵（噴霧管）, Fe3O(O2CCH3)6, 537.8793（3）選擇離子掃描（SRM模式）也稱為子離子掃描（ MS/MS ），用于結(jié)構(gòu)判斷(得到化合物的二級譜圖即碎片離子)和選擇離子對作多種反應監(jiān)測（SRM）。通過Q1選擇目標物質(zhì)的母離子，在Q2發(fā)生碰撞反應，Q3對目標物質(zhì)豐度最大的子離子進行掃描。子離子質(zhì)譜圖已知只有一種質(zhì)量通過MS1

16、（Q1），因此也已知所有碎片離子都是由我們所選定的母離子所產(chǎn)生的，所以我們更相信由MS/MS產(chǎn)生的譜圖的純度。相對其它掃描模式，SRM模式對于目標物質(zhì)最為靈敏，干擾也最低，一般用于定量分析。Precursor ionfixed Fragmentation (CID) Product ion fixed9.其它事項（1）流動相的選擇常用的流動相為甲醇、乙腈、水和它們不同比例的混合物以及一些易揮發(fā)鹽的緩沖液，如甲酸銨、乙酸銨等，還可以加入易揮發(fā)酸堿如甲酸、乙酸和氨水等調(diào)節(jié)pH值。LCMS接口避免進入不揮發(fā)的緩沖液，避免含磷和氯的緩沖液，含鈉和鉀的成分必須0.5mmol/l。（鹽分太高會抑制離子源的

17、信號和堵塞噴霧針及污染儀器）含甲酸（或乙酸）1。含三氟乙酸0.2。含三乙胺0.5。含醋酸銨2-5mmol/l。 送樣前一定要摸好LC條件，能夠基本分離，緩沖體系符合MS要求。（2）流量和色譜柱的選擇不加熱ESI的最佳流速是150ulmin，應用4.6 mm內(nèi)徑LC柱時要求柱后分流，目前大多采用 l2.1 mm內(nèi)徑的微柱，TIS源最高允許lmlmin，建議使用200400ulminAPCI的最佳流速lmlmin，常規(guī)的直徑4.6mm柱最合適。 為了提高分析效率，常采用 100 mm的短柱（此時UV圖上并不能獲得完全分離，由于質(zhì)譜定量分析時使用MRM的功能，所以不要求各組分沒有完全分離）。這對于大批量定量分析可以節(jié)省大量的時間。（3）輔助氣體流量和溫度的選擇霧化氣（sheath gas）對流出液形成噴霧有影響，輔助氣（Aux gas）影響噴霧去溶劑效果，碰撞氣影響二級質(zhì)譜的產(chǎn)生。