提高里氏木霉生產(chǎn)纖維素酶產(chǎn)量的研究進(jìn)展

1、提高里氏木霉生產(chǎn)纖維素酶產(chǎn)量的研究進(jìn)展摘 要：纖維素酶是纖維素類物質(zhì)的主要水解用酶，由于目前纖維素酶的產(chǎn)量較低，活性較差，導(dǎo)致其無法在多種工業(yè)上大量使用。里氏木霉作為優(yōu)良的纖維素酶生產(chǎn)菌株，使用化學(xué)方法或生物方法對其進(jìn)行改良，以期提高纖維素酶產(chǎn)量和酶活性。關(guān)鍵詞：里氏木霉；纖維素酶；產(chǎn)量；活性纖維素類物質(zhì)是自然界分布最廣、含量最豐富的碳源物質(zhì)，其作為潛在且普遍的可持續(xù)能源受到了廣泛的矚目，但是在實(shí)際的生產(chǎn)過程中只有少量的纖維素類物質(zhì)能直接生產(chǎn)出具有高附加值的產(chǎn)物，很難生產(chǎn)這些產(chǎn)物的主要原因是纖維素具有比較強(qiáng)的氫鍵作用以及結(jié)晶結(jié)構(gòu)，范德華力與疏水作用也在其中起到了協(xié)同的作用，從而導(dǎo)致了大部分纖維

2、素在水解轉(zhuǎn)化成為它們的單體或者可發(fā)酵性糖的過程中出現(xiàn)生產(chǎn)效率低的現(xiàn)象1。在纖維素水解過程中一般使用酸性化學(xué)試劑和酶試劑與其進(jìn)行反應(yīng)，其中酶水解常常使用纖維素酶。纖維素酶是能降解纖維素的復(fù)合酶類，主要產(chǎn)生于細(xì)菌、真菌、放線菌、植物、原生動(dòng)物及部分無脊椎動(dòng)物等生物體中，由于微生物之外的生物不能大規(guī)模培養(yǎng)而不具有實(shí)際的應(yīng)用意義，此外，細(xì)菌產(chǎn)的纖維素酶活力較低，且只有少部分能分泌到胞外，而真菌剛好與細(xì)菌相反，產(chǎn)生酶的組分也較為適當(dāng)，具有較好的協(xié)同作用，因此真菌是目前研究最廣泛的纖維素酶產(chǎn)生菌。絲狀真菌中木霉屬被認(rèn)為是生產(chǎn)纖維素酶最優(yōu)秀的菌種，其中以里氏木霉更為突出2-4。1 前言里氏木霉為絲狀的多細(xì)胞

3、真核微生物，其工業(yè)用菌株常用于生產(chǎn)可以分解不同纖維素類物質(zhì)的酶類，并且適用于蛋白的生產(chǎn)，擁有良好的合成蛋白和分泌蛋白的能力。里氏木霉生產(chǎn)的纖維素酶為多水解酶所組成的復(fù)雜酶系，其中主要包括纖維二糖水解酶（cellobiohydrolase，CBH）、內(nèi)切-葡聚糖酶(endo-1,4-D-glucanase，EG）以及-葡萄糖苷酶（-1,4-D-glucosidase，EC）。其中纖維二糖水解酶分為纖維二糖水解酶（CBH）和纖維二糖水解酶（CBH），它們均可以作用于纖維素多糖鏈的末端，水解-1,4-糖苷鍵，產(chǎn)生纖維二糖；內(nèi)切-葡聚糖酶水解-1,4-糖苷鍵，主要作用于纖維素內(nèi)部結(jié)構(gòu)中的無定型區(qū)域，產(chǎn)

4、生的小分子纖維素帶有非還原性末端；而-葡萄糖苷酶則可以將纖維二糖水解成為兩分子的葡萄糖5-7?；诶w維素酶具有的多種優(yōu)秀的性能，例如在纖維素酶對纖維素水解的過程中，相較于使用化學(xué)試劑對纖維素的水解，其對反應(yīng)條的要求較低，不需要高溫高壓，并且具有原料糖轉(zhuǎn)化效率高，轉(zhuǎn)化速度快，在水解過程中無污染產(chǎn)生等優(yōu)點(diǎn)，故其應(yīng)用價(jià)值也隨之受到了更多地重視。目前，纖維素酶的使用已在紡織行業(yè)中得到了大規(guī)模的推廣，纖維織物經(jīng)纖維素酶處理后，其外觀和手感都得到較大改善，還可通過纖維素酶對織物的表面纖維進(jìn)行剝蝕，使織物表面受到磨損，染料被剝離出來，產(chǎn)生水洗樣的仿舊外觀；或者利用纖維素酶對織物進(jìn)行拋光處理，在纖維素酶對纖維

5、素水解的基礎(chǔ)上，再配合機(jī)械攪拌的沖擊作用可以去除織物表面的小絨毛。食品釀造行業(yè)利用纖維素酶對酒類、醬油、食醋的釀造均可提高產(chǎn)物的產(chǎn)量，在酒類釀造方面還可以使酒香更加醇厚，酒類色澤更加純凈，提高色素提取量等。此外，纖維素酶在洗滌劑行業(yè)、飼料行業(yè)、造紙等行業(yè)都有較好的利用前景2,8,9。但是纖維素酶的應(yīng)用雖然受到了人們的關(guān)注，卻很難進(jìn)行廣泛的利用，這是因?yàn)椴煌晟a(chǎn)的纖維素酶組分的含量差異較大，且通常纖維素酶的產(chǎn)量不高，活性低，故難以大規(guī)模的生產(chǎn)使用。如何提高纖維素酶的產(chǎn)量與活性是纖維素酶研究中重要的課題，目前所選育出來的產(chǎn)纖維素酶菌種雖然具有一定的產(chǎn)酶能力，但真正高效產(chǎn)酶的菌種不多，且性能也不

6、穩(wěn)定，本文將通過化學(xué)方法和生物方法討論如何提高里氏木霉產(chǎn)纖維素酶的產(chǎn)量，以期獲得數(shù)量較多、性能良好、活性較高的纖維素酶。2 采用化學(xué)方法提高纖維素酶產(chǎn)量在對里氏木霉產(chǎn)纖維素酶的研究中，通過改變里氏木霉的生產(chǎn)條件或添加化學(xué)試劑來對其控制是較為常見的手段。酸堿性在里氏木霉的纖維素酶合成的過程中起著一個(gè)非常重要的作用10，Li等11,12便對此進(jìn)行了探討，通過調(diào)節(jié)里氏木霉生產(chǎn)中的pH值，改進(jìn)纖維素酶的發(fā)酵工藝，主要對三種纖維素酶組分（內(nèi)切-葡聚糖酶，外切葡聚糖酶，-葡萄糖苷酶）的生產(chǎn)效率和生產(chǎn)速率的影響，以及對菌絲體的形態(tài)的影響進(jìn)行了研究。首先得知，在不同pH的條件下，三種纖維素酶組分的產(chǎn)量是各有差

7、異的，根據(jù)蛋白質(zhì)的生產(chǎn)數(shù)量和生產(chǎn)速率與濾紙酶活對纖維素酶系的酶活力水平的測定共同推斷出里氏木霉對纖維素酶生產(chǎn)的最佳pH值約為4.5-5.0左右。以此為基礎(chǔ)，聯(lián)系實(shí)際的工業(yè)生產(chǎn)，改善傳統(tǒng)的分批發(fā)酵方式，而采用控制pH的補(bǔ)料分批發(fā)酵方式對纖維素酶進(jìn)行生產(chǎn)，具有節(jié)約原料，提高產(chǎn)酶效率等多種優(yōu)點(diǎn)。此外，采用補(bǔ)料分批發(fā)酵方法，根據(jù)具體生產(chǎn)所需的酶，選擇使用適合的具有先進(jìn)的控制功能的生物反應(yīng)器改變里氏木霉的培養(yǎng)條件，能選擇性提高纖維素酶的生產(chǎn)4,13。此外Callow等14則在選擇適合pH值得基礎(chǔ)上，采用添加表面活性劑的方法，促使里氏木霉Rut C30的表面顆粒生長，此形態(tài)能使纖維素酶易于分離，從而提高纖

8、維素酶的生產(chǎn)。相同培養(yǎng)條件下，在培養(yǎng)基中添加不同種類的表面活性劑，經(jīng)過形態(tài)分析篩選，Triton X-100與鼠李糖脂的促生長能力最佳。再通過濾紙酶活測定表面活性劑的最佳添加濃度，同時(shí)要對表面活性劑所造成的生長滯后性、倍增時(shí)間等影響因素進(jìn)行全面的檢測，以期在獲得最大纖維素酶活的條件下，將負(fù)面影響也減小到最低程度。3 采用生物方法提高纖維素酶產(chǎn)量目前，通過生物學(xué)手段從分子層面提高纖維素酶產(chǎn)量是纖維素酶研究的重點(diǎn)。通過隨機(jī)誘變產(chǎn)生的里氏木霉突變體中，有部分突變體表現(xiàn)出了令人影響深刻的性能增強(qiáng)，在此條件下通過系統(tǒng)生物學(xué)工具，如基因組合轉(zhuǎn)錄組測序，可以揭示纖維素酶的生產(chǎn)機(jī)制，并對突變獲得的較高生產(chǎn)性能

9、和較低生產(chǎn)性能的生產(chǎn)菌株進(jìn)行比較分析15。通過實(shí)驗(yàn)分析表明在里氏木霉生產(chǎn)的纖維素酶系中纖維二糖水解酶的含量最高，在纖維素的降解過程中占主導(dǎo)地位。這是因?yàn)镃BH基因的啟動(dòng)子是強(qiáng)啟動(dòng)子，可用于其他基因的超量表達(dá)研究，而CBH對整個(gè)纖維素酶系的表達(dá)起著重要的調(diào)控作用，CBH酶的特異性強(qiáng)，酶活明顯高于CBH，降解微晶纖維素的能力比CBH高2倍，但其濃度卻遠(yuǎn)低于CBH。因此研究克隆CBH基因，提高其表達(dá)活性，可以增強(qiáng)纖維素酶整體活力16,17。Fang等16,18通過重組里氏木霉ZU-02，提高活性纖維素酶生產(chǎn)，增強(qiáng)纖維二糖水解酶的生產(chǎn)。實(shí)驗(yàn)中，F(xiàn)ang等采用CBH基因的啟動(dòng)子構(gòu)建重組質(zhì)粒pCAMBIA

10、1300-潮霉素-PSCT，其含有較強(qiáng)的基因表達(dá)框，通過優(yōu)化的農(nóng)桿菌介導(dǎo)構(gòu)建和轉(zhuǎn)化里氏木霉，轉(zhuǎn)化的里氏木霉通過兩步篩選，產(chǎn)生324陽性里氏木霉。經(jīng)檢驗(yàn)，重組里氏木霉最高的濾紙酶活比未經(jīng)重組的里氏木霉高4.3倍，而其生產(chǎn)的纖維二糖水解酶的活性也比原有活性高5.6倍。并且發(fā)現(xiàn)經(jīng)重組后的里氏木霉結(jié)合補(bǔ)料分批發(fā)酵方式進(jìn)行大規(guī)模的纖維素酶生產(chǎn)，可以有效的改善里氏木霉纖維素酶的生產(chǎn)率，得到的纖維素酶類的活性較高，當(dāng)20FPIU/g的纖維素酶，10IU/g纖維二糖水解酶和300U/g的木聚糖酶在堿性條件下對農(nóng)業(yè)廢棄物玉米秸稈進(jìn)行預(yù)處理，其酶解效率高達(dá)93.8%。然而使用CBH啟動(dòng)子還可以提高里氏木霉中外源蛋

11、白的表達(dá)量，Meng等17使用pWEIIF00表達(dá)載體構(gòu)建一個(gè)蛋白質(zhì)表達(dá)系統(tǒng)，此載體是以潮霉素B磷酸轉(zhuǎn)移酶(hph)基因?yàn)檫z傳標(biāo)記的啟動(dòng)子探針型載體，同時(shí)在載體中導(dǎo)入紅色熒光蛋白基因（DsRed2）以便對其表達(dá)進(jìn)行檢測，是用此系統(tǒng)重組突變體Cel5A。在熒光電子顯微鏡和自然光下觀察轉(zhuǎn)化后的里氏木霉基因重組菌絲體和分生孢子的形態(tài)變化，同時(shí)采用CMC酶活對轉(zhuǎn)化體所產(chǎn)生的蛋白酶進(jìn)行測定，相較于野生型菌株，轉(zhuǎn)化體的酶活性提高了31.09%。除了單獨(dú)采取生物學(xué)手段在分子層面對菌株基因進(jìn)行改良，Zhang等19結(jié)合調(diào)控pH值的方法，敲除里氏木霉基因中表達(dá)相對大的胞外堿性蛋白酶的基因SPW，SPW在牛血清白

12、蛋白作為唯一氮源時(shí)，它的轉(zhuǎn)錄水平將大約增加到平時(shí)的136倍。敲除SPW基因后，胞外蛋白酶活性降低，可以觀察到異源的堿性內(nèi)切葡聚糖酶產(chǎn)量的增加及穩(wěn)定性的增強(qiáng)。此外，通過農(nóng)桿菌接到轉(zhuǎn)化，創(chuàng)建T-DNA標(biāo)簽的突變體，進(jìn)行插入誘變，通過進(jìn)行濾紙酶活、蛋白濃度以及相關(guān)酶活性得知纖維素酶的產(chǎn)量得到提高20，或通過RNAi介導(dǎo)基因沉默，有效抑制CBH基因的表達(dá)，CBH的減少可導(dǎo)致里氏木霉生產(chǎn)異源酶的產(chǎn)量增加，使能獲得所需的酶含量增加21。4 展望纖維素是自然界中最豐富的資源之一，進(jìn)行以纖維素為發(fā)酵底物的纖維素酶的生產(chǎn)是目前及將來的研究重點(diǎn)，提高纖維素酶產(chǎn)量及其活性，使纖維素酶可以在多種行業(yè)中展現(xiàn)其本應(yīng)具有的

13、應(yīng)用能力，目前多采用分子生物學(xué)手段提高里氏木霉生產(chǎn)纖維素酶的產(chǎn)量與活性，因?yàn)槠渌眯Ч麅?yōu)于其它方法，且一般不對環(huán)境產(chǎn)生污染。若采用多種方法結(jié)合，彌補(bǔ)彼此不足之處，減少彼此所帶來的負(fù)面影響。改善提高纖維素酶產(chǎn)量的方法，以期在生產(chǎn)過程中減少生產(chǎn)成本，生產(chǎn)時(shí)間，且得到較多的性能優(yōu)良的纖維素酶。參考文獻(xiàn)1Feng Jiang, Qingjun Zhu, Ding Ma, et al. Direct conversion and NMR observation of cellulose to glucose and 5-hydroxymethylfurfural (HMF) catalyzed by t

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