熒光法測(cè)定醛糖還原酶活性的優(yōu)化

1、熒光法測(cè)定醛糖還原酶活性的優(yōu)化                         作者：王俊杰 方會(huì)龍 段小毛 肖和平 谷娟 李玲 歐陽(yáng)冬生【摘要】 目的 找出優(yōu)化NADP生成熒光法測(cè)定紅細(xì)胞醛糖還原酶 (AR) 活性的方案。方法 通過(guò)研究血紅蛋白濃度、激發(fā)熒光水浴時(shí)間以及NADP溶液貯存時(shí)間對(duì)熒光強(qiáng)度的影響，優(yōu)化紅細(xì)胞AR活性測(cè)定的NADP生成法；以此方法測(cè)

2、定正常及糖尿病大鼠AR活性。結(jié)果 NADP生成法的精確度受血紅蛋白影響，在終止反應(yīng)后的NADP溶液中加入250 l 6高氯酸沉淀血紅蛋白可消除此影響；水浴激發(fā)熒光時(shí)間5、30、60 min，熒光值變異系數(shù)無(wú)差異；在激發(fā)熒光前將反應(yīng)體系生成的NADP溶液貯存于-20的條件下至少可以穩(wěn)定保存4 w。糖尿病大鼠AR活性明顯高于正常對(duì)照組(P<0.05)。 結(jié)論 優(yōu)化的NADP生成法可以更準(zhǔn)確測(cè)定紅細(xì)胞AR活性。 【關(guān)鍵詞】 糖尿?。蝗┨沁€原酶；熒光；活性 【Abstract】Objective To optimize the the NADPgenerating fluorimetric me

3、thod for aldose reductase (AR) activity. Methods The effect of haemoglobin，the time of aqueous bath arousing fluorescence and storage time of NADP solution on the fluorescent value was observed. It was optimized that the NADPgenerating fluorimetry assayed erythrocytes AR activity. AR activity of nor

4、mal and diabetic mellitus rat were examined.Results The accuracy of this assay was influenced by hemoglobin concentration which could be eliminated by adding 250 l 6 perchloric acid to precipitate hemoglobin as the reaction was terminated. It had no difference for the variation coefficient of fluore

5、scence value when the time that the fluorescence was provocated through waterbath was 5,30,60 min. NADP solution could be stored in the condition of -20 for 4 weeks at least. AR activity was higher in diabetic rats than that of normal rats(P0.05). Conclusions Optimized NADPgenerating fluorimetry can

6、 measure activity of erythrocyte AR accurately. 【Key words】Diabetes; Aldose reductase; Fluorescence；Activity醛糖還原酶(Aldose Reductase，AR)是葡萄糖代謝多元醇通路的限速酶，高血糖可激活A(yù)R，使葡萄糖經(jīng)多元醇通路的代謝增強(qiáng)，造成山梨醇在細(xì)胞內(nèi)的蓄積和還原劑如還原型輔酶 (NADPH) 的缺失，導(dǎo)致細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)和功能受損而干擾細(xì)胞的正常代謝。動(dòng)物和臨床實(shí)驗(yàn)均提示，高血糖激活A(yù)R是糖尿病并發(fā)癥的主要發(fā)病機(jī)制之一1。最新研究發(fā)現(xiàn)AR還在心肌缺血2及內(nèi)毒素引起的休克反應(yīng)3中發(fā)揮

7、著重要作用。因此，測(cè)定紅細(xì)胞AR活性，對(duì)研究AR與相關(guān)疾病發(fā)病機(jī)制的關(guān)系具有重要意義。目前測(cè)定AR活性有熒光法和比色法。紅細(xì)胞AR活性測(cè)定多采用熒光法4，其原理為NADP與強(qiáng)堿作用產(chǎn)生熒光信號(hào)，其強(qiáng)度與NADP的濃度成正比，咪唑可保護(hù)熒光的穩(wěn)定性，當(dāng)定量且過(guò)量的NADPH存在時(shí)，以DL甘油醛為底物，可通過(guò)測(cè)定NADP的生成或NADPH的減少來(lái)反映AR活性。新近有研究顯示NADP生成法靈敏度和重復(fù)性更好5，為此，我們對(duì)該方法進(jìn)行了優(yōu)化。1 材料與方法1.1 動(dòng)物及分組雄性10周齡SD大鼠20只，由中南大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，隨機(jī)分成2組：對(duì)照組和糖尿病組。1.2 方法NADPH(純度>98，

8、ROTH公司)，NADP(純度>90，ROTH公司)，DL甘油醛(Wako公司)，鏈脲佐菌素(STZ，Sigma公司)，其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。熒光分光光度計(jì)(日本產(chǎn)島津RF5000)，京都血糖儀(日本第一科學(xué)株式會(huì)社)。                             大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d，禁食12 h

9、，糖尿病組按5.5 ml/kg體重單次腹腔注射STZ溶液 (STZ用0.1 mol/L pH4.2的檸檬酸緩沖液配成10 mg/ml的溶液)，3 d后尾靜脈采血隨機(jī)測(cè)血糖13.5 mmol/L者為糖尿病大鼠，對(duì)照組注射等量檸檬酸緩沖液。飼養(yǎng)期間所有大鼠自由飲水進(jìn)食。4 w后眼眶采血，血糖儀測(cè)定血糖。4 w后，眼眶采血，取肝素抗凝血1 ml，3 000 r/min×10 min分離紅細(xì)胞，然后加4倍體積4預(yù)冷的生理鹽水，3 000 r/min×10 min×3 次離心洗滌紅細(xì)胞，按照50 l/支分裝 (一支實(shí)驗(yàn)管，其余備用)，-20凍存。取凍存紅細(xì)胞加200 l 1

10、0 mmol/L磷酸鉀緩沖液(pH 6.0)，振蕩溶解10 min，3 000 r/min×10 min，去沉淀。甘油醛，150 mol/L NADPH，5 l紅細(xì)胞溶血液，總體積200 l。實(shí)驗(yàn)管加上述所有試劑，空白管以去離子水代替NADPH。加入DL甘油醛后立即37水浴反應(yīng)。5 min后，將樣本同時(shí)放入冰浴中，加入600 l 0.5 mol/L HCl后60水浴15 min來(lái)終止反應(yīng)并破壞反應(yīng)剩余的NADPH。冰浴冷卻后加入250 l 6高氯酸3 000 r/min×10 min離心沉淀血紅蛋白，吸取上清1 ml，-20凍存。加入2 ml 6 mol/L NaOH (內(nèi)

11、含10 mmol/L咪唑) 37水浴5 min激發(fā)NADP產(chǎn)生熒光，Ex360 nm/Em460 nm測(cè)定熒光強(qiáng)度。用高鐵氰化血紅蛋白法。實(shí)驗(yàn)管加稀釋液3 ml，紅細(xì)胞溶血液12 l，空白管以去離子水代替紅細(xì)胞溶血液，混勻，靜置5 min，以空白管調(diào)零測(cè)實(shí)驗(yàn)管在540 nm的吸光度值，計(jì)算血紅蛋白含量Hb(g/L)OD540×367.7。每份樣品平行做三份取均值。反應(yīng)體系與條件同上，去離子水代替紅細(xì)胞溶血液，NADP(01 000 mol/L) 代替NADPH，以NADP濃度為橫坐標(biāo)，熒光強(qiáng)度為縱坐標(biāo)做標(biāo)準(zhǔn)曲線，求回歸方程。由方程求得NADP生成量，以每分鐘產(chǎn)生1 mol NADP為

12、1個(gè)酶活性單位(U)，計(jì)算AR活性。按照以上實(shí)驗(yàn)方法分別測(cè)定在加入2.5、4、5、6、10 l同一紅細(xì)胞溶血液的情況下激發(fā)的熒光強(qiáng)度；在終止反應(yīng)后的NADP溶液中未加入250 l 6高氯酸沉淀血紅蛋白，然后測(cè)定激發(fā)的熒光強(qiáng)度。以同一溶血液為標(biāo)本，測(cè)定反應(yīng)體系生成的NADP溶液在-20凍存0、4、24 h，1、2、4 w后的NADP激發(fā)的熒光強(qiáng)度。37水浴5 min后測(cè)量NADP產(chǎn)生的熒光值；37水浴30 min后測(cè)量NADP產(chǎn)生的熒光值；37水浴60 min后測(cè)量NADP產(chǎn)生的熒光值。1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果用x±s表示，兩樣本均數(shù)比較用t檢驗(yàn)，多樣本均數(shù)比較(成組設(shè)計(jì))用單因素方

13、差分析。統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS12.0統(tǒng)計(jì)軟件包。2 結(jié) 果2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線與回歸方程N(yùn)ADP標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程：熒光強(qiáng)度=2.828+1.419×NADP濃度，則NADP濃度=(熒光強(qiáng)度-2.828)/1.419。2.2 血紅蛋白對(duì)AR活性測(cè)量值的影響在未去除血紅蛋白的條件下，紅細(xì)胞溶血液在2.510 l的范圍，熒光強(qiáng)度隨紅細(xì)胞血紅蛋白量的增加而降低；在終止反應(yīng)后的NADP溶液中加入250 l 6高氯酸沉淀血紅蛋白，熒光強(qiáng)度隨紅細(xì)胞溶血液的含量升高而升高，提示紅細(xì)胞對(duì)熒光測(cè)量值有較大干擾。紅細(xì)胞溶血液2.5、4、5、6、10 l各組未去除血紅蛋白測(cè)定的熒光值均低于去除血紅蛋白測(cè)定的熒

14、光值(P<0.05)，見(jiàn)表1。表1 紅細(xì)胞溶血液在去除和未去除血紅蛋白條件下激發(fā)的熒光強(qiáng)度(略)                             2.3 樣本的保存周期-20凍存4、24 h，1、2、4 w后的NADP溶液測(cè)定的熒光強(qiáng)度分別是：45.2±1.7，44.2±1.3，45.

15、4±1.9，44.1±2.1，44.4±2.3與對(duì)照組(44.9±1.2)比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。2.4 激發(fā)熒光的水浴反應(yīng)時(shí)間對(duì)熒光強(qiáng)度的影響生成的NADP溶液加入含咪唑的NaOH后，在37水浴分別放置5、30、60 min激發(fā)熒光值，各組間總體均數(shù)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，各組間變異系數(shù)的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表2。表2 激發(fā)熒光的不同水浴時(shí)間測(cè)量的熒光強(qiáng)度(略)2.5 各組大鼠血糖和紅細(xì)胞AR活性比較糖尿病大鼠造模4 w后血糖為(22.72±3.42) mmol/L與對(duì)照組血糖(6.

16、25±1.04) mmol/L比較顯著升高（P<0.05）。糖尿病大鼠AR活性(5.64±2.28) U/mg較對(duì)照組(1.45±0.98) U/mg顯著升高（P<0.05）。3 討 論 紅細(xì)胞AR活性測(cè)定常采用熒光法，本實(shí)驗(yàn)中采用的是NADP生成熒光法，其測(cè)定步驟為：一定時(shí)間內(nèi)的反應(yīng)，終止反應(yīng)，激發(fā)熒光并測(cè)定熒光值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線、熒光值和蛋白含量計(jì)算AR活性。體外測(cè)定AR活性的原理是，AR使底物DL甘油醛轉(zhuǎn)化為DL甘油酸的同時(shí)，NADPH被氧化成NADP，NADP可進(jìn)一步與強(qiáng)堿作用產(chǎn)生熒光，熒光強(qiáng)度與其濃度成正比，加入咪唑可以在一定時(shí)間內(nèi)防止熒光強(qiáng)度

17、衰減。因此通過(guò)測(cè)定NADP生成可以反映AR的活性。 本研究結(jié)果顯示，紅細(xì)胞溶血液在2.510 l范圍內(nèi)，未去除血紅蛋白測(cè)定的熒光值均低于去除血紅蛋白測(cè)定的熒光值，且隨著紅細(xì)胞溶血液的濃度增大，熒光值的差異也越大，提示血紅蛋白對(duì)熒光值影響較大，推測(cè)可能是由于血紅蛋白上的亞鐵離子與NADP發(fā)生氧化還原反應(yīng)而減弱了熒光。終止反應(yīng)后用6%高氯酸沉淀血紅蛋白可以避免熒光值的消減。 反應(yīng)體系生成的NADP溶液是否能長(zhǎng)期保存目前未見(jiàn)報(bào)道，我們的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，NADP溶液經(jīng)過(guò)4、24 h、1、2、4 w的貯存時(shí)間后激發(fā)熒光強(qiáng)度無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。建議實(shí)驗(yàn)可以分段進(jìn)行，以提高效率，特別適合需要在別處使用熒光分光光度計(jì)

18、的實(shí)驗(yàn)室。 目前測(cè)定紅細(xì)胞AR活性的方法中，激發(fā)熒光的水浴反應(yīng)時(shí)間主要有5、30、60 min。結(jié)果顯示，37水浴5 min 熒光強(qiáng)度已接近最大值，560 min激發(fā)的熒光值逐漸增大。530 min比3060 min AR活性變化的趨勢(shì)緩和，60 min的標(biāo)準(zhǔn)差高于5和30 min，但變異系數(shù)的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。但為提高實(shí)驗(yàn)效率，建議采用37水浴5 min的實(shí)驗(yàn)方案。 AR活性是通過(guò)AR催化底物DL甘油醛反應(yīng)5 min后輔酶的改變來(lái)計(jì)算的。加入底物DL甘油醛開(kāi)始計(jì)時(shí)，37水浴5 min加入HCl終止反應(yīng)后停止計(jì)時(shí)。由于一次有多個(gè)樣本需要終止反應(yīng)。因此建議樣本在37水浴進(jìn)行反應(yīng)后，樣本同時(shí)置于冰

19、浴中再加入HCl終止反應(yīng)，可減小實(shí)驗(yàn)誤差。 由于實(shí)驗(yàn)條件和方案的不一致，AR活性測(cè)量值會(huì)有差異，用優(yōu)化后AR活性測(cè)定的NADP生成法能夠準(zhǔn)確反映糖尿病大鼠紅細(xì)胞AR活性的變化。【參考文獻(xiàn)】 1 YabeNishimura C.Aldose reductase in glucose toxicity：a potential target for the prevention of diabetes complicationsJ.Pharmacol Rev，1998；50(1)：2133.2 Kariserova K，Srivastava S，Hoetker JD.Redox activation of aldose reduc