適用于竹林土壤PCR_DGGE分析用的微生物總DNA提取及純

1、適用于竹林土壤PCR-DGGE分析用的微生物總DNA提取及純化方法摘要：為了獲得完整、高純度的竹林土壤微生物總DNA，采用改良的十二烷基硫酸鈉-高對5種竹林土壤進(jìn)行DNA提取，通過DNA凝膠回收試劑盒純化粗提的DNA，利用細(xì)菌16 SrDNA基因的V3區(qū)引物對純化的DNA進(jìn)行了聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-變性梯度凝膠電泳（PCR-DGGE）驗(yàn)證。結(jié)果表明，該方法所需土壤樣品少，抽提的DNA片段均在23kb以上，完整性好；采用DNA凝膠回收試劑盒純化能夠有效去除粗提DNA中大部分雜質(zhì)，獲得高質(zhì)量的DNA；以此DNA為模板進(jìn)行DGGE檢測所反映的微生物信息量豐富。變性梯度凝膠電泳（denaturing gra

2、dient gel electrophoresis， DGGE）技術(shù)從 1993 年被引入微生物生態(tài)學(xué)以來， 已經(jīng)普遍應(yīng)用于微生物研究， 成為微生物群落遺傳多樣性和動(dòng)態(tài)分析的強(qiáng)有力工具之一1。獲得樣品中所有種類微生物的 DNA 是應(yīng)用 DGGE 技術(shù)的前提和關(guān)鍵。 然而， 來自環(huán)境中的樣品含有非常復(fù)雜的成分， 尤其是土壤中的腐植酸類物質(zhì)很難去除。 另外， 實(shí)際樣品中微生物細(xì)胞壁的堅(jiān)實(shí)度不同， 如不注意就會(huì)選擇性地獲得那些易破細(xì)胞壁的微生物 DNA， 而且有些樣品 DNA 回收率低， 造成重復(fù)性降低2。 因此， 需要摸索適合具體樣品的 DNA 提取方法。 近 30 a 來， 國內(nèi)外在這方面作了大

3、量研究， 如 Porteous 等3使用加熱-酶-異硫氰酸胍裂解細(xì)胞提取總 DNA； Zhou 等4使用蛋白酶 K 和十二烷基 硫酸鈉 （SDS）破 解 細(xì) 胞提取總 DNA。 這些方法提取的土壤微生物DNA 產(chǎn)量高， 但雜質(zhì)也多， 其中以腐植酸污染最為嚴(yán)重， 直接影響后續(xù)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-變性梯度凝膠電泳（PCR-DGGE）實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性。 鑒于此， 人們又嘗試許多方法去除腐植酸的影響， 如He 等5使用磷酸鹽緩沖液預(yù)洗土壤后再提取 DNA， Dong 等6嘗試采用 Al2（SO4）3去除土壤 DNA 中的腐植酸， 獲得良好效果。 目前，針對竹林土壤微生物總 DNA 提取以及利用 PCR-DGG

4、E 分析竹林土壤微生物群落多樣性的研究還未見報(bào)道。 筆者擬在以往研究的基礎(chǔ)上， 通過摸索和改進(jìn)4，7-8， 建立一種適應(yīng)于竹林土壤PCR-DGGE 分析用的 DNA 提取和純化方法， 為進(jìn)一步研究竹林土壤微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性打下良好的基礎(chǔ)。1材料和方法1.1材料實(shí)驗(yàn)土樣于 2007 年 8 月取自浙江林學(xué)院吉永竹園。 分別采集了雷竹 Phyllostachys praecox， 紫竹Phyllostachys nigra， 剛 竹 Phyllostachys sulphurea， 龜 甲 竹 Phyllostachys heterocycla 和 黃 稈 烏 哺 雞Phyllostachys

5、 vivax 等 5 種竹林的土壤， 采樣深度為 0 10 cm， 按五點(diǎn)法采樣， 四分法混勻放入保鮮袋中， 封口后， 帶回實(shí)驗(yàn)室， 4 保存。1.2竹林土壤微生物總DNA提取方法報(bào)道的 SDS 高鹽抽提法（簡稱常規(guī)法）提取了 5 種竹林土壤微生物的總 DNA， 作為對照。 采用的改良 SDS 高鹽抽提法 （簡稱改良法）參照常規(guī)法修訂而成， 即在高鹽提取液中添加石英砂， 以反復(fù)凍融代替水浴破碎細(xì)胞， 并且在氯仿-異戊醇抽提過程增加了 NaCl/CTAB（十六烷基三甲基溴化銨）溶液 2 次抽提的步驟。 具體操作如下： 稱取 1.0 g 土壤樣品， 與 4.5 mL DNA提取緩沖液（Tris-H

6、Cl 100 mmol·L1， EDTA 100 mmol·L1， Na3PO4100 mmol·L1， NaCl 1.5 mol·L1， 10.0g·kg1CTAB， pH 8.0） 混合， 加少許石英砂， 于 230 r·min1搖床上 37 搖動(dòng) 30 min； 隨后加入 0.5mL 200 g·kg1SDS， 混合物于 65 水浴 20 min （每隔 1015 min 輕輕上下顛倒幾次）， 80 冷凍 15min， 反復(fù)凍融 2 次。 室溫 6 000 r·min-1離心 10 min， 收集上清， 加入

7、 1/10 體積 65 預(yù)熱的 NaCl/CTAB 溶液 （100 g·kg1CTAB， 0.7 mol·L1NaCl）和等體積的氯仿-戊醇， 輕搖混勻， 室溫下 10 000r·min-1離心 6 min， 吸取上層水相。 重復(fù)抽提 12 次， 吸取水相轉(zhuǎn)移至新離心管中， 加入 0.6 倍體積的異丙醇， 室溫沉淀 15 min， 10 000 r·min-1離心 10 min 收集核酸沉淀。 用體積分?jǐn)?shù)為 70%乙醇洗滌 2次， 室溫風(fēng)干， 用 200 L TE 緩沖液（10 mmol·L1Tris-HCl， 1 mmol·L1ED

8、TA， pH 8.0）溶解沉淀， 4保存。1.3土壤DNA的質(zhì)量檢測， 變性劑梯度為 35% 55%（100 %變性劑濃度為 7mol·L1的尿素和 400 g·kg1的去離子甲酰胺的混合物）， 在每個(gè)加樣孔加入上述 PCR 樣品 200 300ng。 電泳條件： 1 × TAE 電泳緩沖液， 60 ， 65 V， 13 h。 電泳結(jié)束后， 按快速銀染法染色9： 凝膠在固定液（75.0 g·kg 1的冰乙酸）固定 15 min， 加 入2 g·kg1的硝酸銀染色 15 min， 然后在顯色液 （30.0 g·kg 1氫氧化鈉， 5.0

9、 g·kg1甲醛）中顯色 5 min， 最后加固定液終止反應(yīng)。 每一步均用去離子水沖洗膠面 2 3 遍， 在 Bio-Rad 公司凝膠成像系統(tǒng) Gel Doc2000 中成像。2結(jié)果與分析2.1不同竹林土壤中微生物基因組DNA提取分別用常規(guī)法和改良法提取了 5 種竹林土壤微生物總 DNA。 從瓊脂糖電泳圖上可以看出（圖 1），改良法從 5 種竹林土壤中都提取出了 DNA， 且 DNA 帶型清晰完整， 其片段大于 23 kb， 無明顯降解。常規(guī)法提取的 1 號和 2 號樣品 DNA 沒有明顯電泳條帶， 3 號、 4 號和 5 號樣品 DNA 也只有較弱的電泳條帶， 說明 DNA 提取量

10、低。 因?yàn)樘崛?DNA 所用的土壤都是 4 保存的鮮土， 所以所得 DNA 產(chǎn)量為所測 DNA 質(zhì)量/鮮土質(zhì)量。 腐植酸和蛋白質(zhì)分別在 230 nm 和 280 nm 處有吸收峰10 ， 可以通過測定A260/ A230（DNA/腐植酸）和 A260/ A280（DNA/蛋白質(zhì)）的比值來評價(jià) DNA 的純度： A260/ A230比值越大，腐植酸污染越少， DNA 越純； 一般認(rèn)為， A260/ A280比值大于 1.8 時(shí)， DNA 較純， 否則有蛋白質(zhì)污染11。 本實(shí)驗(yàn)中 ， 改良法提取的 DNA 產(chǎn)率在 10.53 23.71 g·g1， 3 號土樣 DNA 提取率最高 ， 達(dá)

11、23.71 g·g1， 4 號土樣的提取率相對較低， 但是都獲得了較高的提取率， 而常規(guī)法提取的 DNA 產(chǎn)率非常低， 得率最高的僅 4.44 g·g1。 A260/ A280和 A260/ A230的比值顯示， 2 種方法提取的 DNA 均存在一定程度的腐植酸和蛋白質(zhì)等雜質(zhì)污染， 但改良法的比值明顯優(yōu)于常規(guī)法， 特別是 A260/ A230的比值遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于常規(guī)法（表 1）。表1用2種方法粗提的5種竹林土壤樣品中DNA產(chǎn)量和純度比較2.2土壤基因組DNA的純化和PCR-DGGE檢測在上述 DNA 提取過程中雖然除去了部分污染物， 但所提 DNA 中仍然有不同程度的腐植酸等雜質(zhì)

12、， 而低量的腐植酸也會(huì)干擾下一步的操作， 如 PCR 擴(kuò)增、 雜交等。 在實(shí)驗(yàn)中， 我們試圖以粗提的DNA 為模板直接進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增， 但部分土樣擴(kuò)增效果欠佳（電泳圖未給出）。 為了獲得理想的擴(kuò)增效果， 保證后續(xù)實(shí)驗(yàn)的可靠性和擴(kuò)大該方法的適用性， 本實(shí)驗(yàn)采用 DNA 凝膠回收試劑盒直接純化粗提的土壤微生物總 DNA。 圖 2 中顯示， 所有以改良法總 DNA 純化產(chǎn)物為模板的 PCR 反應(yīng)都獲得特異性擴(kuò)增片段， 常規(guī)法 3 號、 4 號和 5 號樣品 DNA 有較弱的擴(kuò)增條帶。 將各個(gè)樣品擴(kuò)增產(chǎn)物作為變性梯度凝膠電泳（DGGE）的樣品， 所得微生物信息圖譜如圖 3 所示。 在相同的電泳條件

13、下， 改良法所提的土壤樣品微生物總 DNA 經(jīng)過DGGE 都可以分離出數(shù)目不等的電泳條帶， 各樣品之間表現(xiàn)出了不同竹種竹林微生物群體差異。 常規(guī)法的 5 號樣品分離出少量微弱的條帶， 其他樣品則沒有檢測到條帶。 PCR 和 DGGE 的電泳圖上第 11 泳道為以無菌水為模板的陰性對照， 沒有檢測到微生物信息， 表明實(shí)驗(yàn)過程無微生物污染干擾。3討論從土壤中充分裂解微生物， 獲得總微生物 DNA 是研究土壤微生物的關(guān)鍵。 微生物細(xì)胞與土壤粘附較牢， 不易分開， 導(dǎo)致靶微生物丟失較多。 Zhou 等4認(rèn)為， 從砂質(zhì)土壤中釋放微生物要比黏性土壤容易。 常用機(jī)械破碎方法如玻璃珠振蕩法12、 超聲波法3、

14、 液氮研磨法13， 或是幾種方法的組合來破碎細(xì)胞14 ， 但過度劇烈的機(jī)械破碎法易導(dǎo)致 DNA 片段的斷裂， 而在分子生態(tài)學(xué)研究中， 大片段的DNA 是用于進(jìn)一步的分子生物學(xué)操作的保證。 改良法中采用振蕩的方法結(jié)合反復(fù)凍融， 并且加入石英砂， 增加了土壤的砂性， 獲得了良好的細(xì)胞裂解效果， 不僅所得 DNA 產(chǎn)率高， 也有利于提高 DNA的純度。 實(shí)驗(yàn)中避免了超聲波等處理， 所得 DNA 的完整性也很好。在土壤微生物 DNA 抽提中最主要的污染物是腐植酸， 其結(jié)構(gòu)千差萬別，可以螯合 Mg2+或是和 DNA 或蛋白質(zhì)發(fā)生共價(jià)結(jié)合， 從而抑制酶的活性， 影響后續(xù)的實(shí)驗(yàn)操作。 并且， 對于不同的土壤

15、， 腐植酸組成和特點(diǎn)不同。因此， 一種方法處理不同的土壤， 會(huì)有不同的提取效果。 CTAB 可用于細(xì)胞裂解， 還有助于去除腐植酸4。在加入酸類或者高濃度的鹽類物質(zhì)時(shí)可使腐植酸產(chǎn)生凝絮15。 改良法針對竹林土壤， 在提取液和抽提液中都使用 了CTAB， NaCl/CTAB 抽提液還提供了高鹽環(huán)境。 在改良法的抽提過程中， 可以看到水相和有機(jī)相之間有一層絮狀物， 很有可能是絮凝的腐植酸類物質(zhì)。根據(jù)粗提 DNA 紫外掃描的 A260/A280和A260/A230的比值可以看出， 常規(guī)法提取的 DNA 中蛋白質(zhì)和腐植酸污染嚴(yán)重，而改良法粗提的 DNA 中污染物較少， 很可能是上述抽提過程中去除了大部分的腐植酸等雜質(zhì)。 粗提的 DNA 可采用 DNA 凝膠回收試劑盒進(jìn)行過柱純化， 過柱純化時(shí)不需要電泳割膠等繁瑣操作， 且純化后 DNA 的 PCR 擴(kuò)增效果良好， 表明過柱純化可進(jìn)一步有效去除 DNA 中少量的腐植