重金屬污染物的免疫學檢測技術(shù)研究進展

1、生態(tài)環(huán)境 2005, 14(4: 590-595 Ecology and Environment E-mail: editor基金項目：廣東省科技攻關(guān)項目（2003C20411）作者簡介：江天久（1964），男，副研究員，主要研究方向為環(huán)境科學。 *通訊聯(lián)系人，tjiangtj 收稿日期：2005-01-31重金屬污染物的免疫學檢測技術(shù)研究進展江天久1, 2 *，牛 濤11. 暨南大學生命科學技術(shù)學院，廣東 廣州 510632；2. 華南師范大學生命科學技術(shù)學院，廣東 廣州 510631摘要：重金屬的免疫學檢測是一種新型的重金屬檢測方法，與傳統(tǒng)檢測方法相比，具有省時、省力、費用低廉、便于攜帶、

2、易于操作等優(yōu)點，能用于重金屬污染物的現(xiàn)場快速檢測和常規(guī)檢測，這對于重金屬污染地區(qū)的補救和恢復(fù)工作具有很大的意義，因而發(fā)展和普及應(yīng)用潛力很大。國外學者通過選擇或合成雙功能鰲合劑鰲合重金屬離子并與載體蛋白偶聯(lián)制備出完全抗原，進一步制備出金屬特異性單抗。目前應(yīng)用免疫學檢測方法檢測環(huán)境中的重金屬離子還處于實驗室的試驗階段，初步實驗結(jié)果表明KinExA 免疫檢測法具有用作重金屬免疫檢測傳感器的能力，并且越來越多的重金屬檢測模型被開發(fā)出來。金屬特異性抗體-抗原的結(jié)合屬性的初步研究表明，影響抗體對抗原識別的主要因素有：金屬離子的半徑、電子和形態(tài)上的并協(xié)性；鰲合劑的結(jié)構(gòu)；金屬離子-鰲合劑復(fù)合物三維結(jié)構(gòu)和價態(tài)結(jié)

3、構(gòu)；抗體中的某些氨基酸殘基能與抗原中金屬離子直接配位以及與抗原中的鰲合劑部分發(fā)生相互作用（疏水作用、氫鍵作用等）。 關(guān)鍵詞：重金屬污染；免疫學檢測；單克隆抗體；鰲合劑中圖分類號：X55 文獻標識碼：A 文章編號：1672-2175（2005）04-0590-06現(xiàn)已知至少20種左右的重金屬有很大的毒性，它們中又有一半以上被大量釋放到環(huán)境中，對人類健康造成嚴重威脅。目前常用的重金屬檢測方法為石墨爐原子吸收光譜法、ICP-AES 、X 射線熒光光譜法等，這些檢測方法雖然能精確測量樣品中單種金屬的總量，但檢測相對費力、費時、費用昂貴, 需要進行大量的樣品預(yù)處理，且樣品的檢測需在大型分析設(shè)備的室內(nèi)進行

4、，不能用于現(xiàn)場檢測。此外，這些檢測方法不能提供重金屬的氧化狀態(tài)或者演變信息。由于上述缺點的限制，檢測的樣品數(shù)一般會少于最佳檢測數(shù)量，導(dǎo)致在隨后進行的重金屬污染程度和風險的評估工作存在較大的不確定性1。重金屬免疫學檢測方法的建立為這類污染物的檢測提供了另一種途徑。該方法具有檢測速度較快、費用低廉、簡單易攜、高度的靈敏度和選擇性的特點14。這種方法理論上能應(yīng)用于能產(chǎn)生合適抗體的任何污染物質(zhì)。自從Reardan 等人首次通過金屬-鰲合劑抗原產(chǎn)生并分離出單克隆抗體以來5，國外越來越多的抗Hg 2+、In 3+、Cd 2+、Pb 2+、U 6+等金屬-鰲合劑復(fù)合物抗體被研制出來1, 612。本文綜述了關(guān)

5、于金屬特異性單克隆抗體的制備、免疫學檢測方法的建立以及抗體-抗原的結(jié)合屬性的研究進展。1 重金屬抗原及其特異性單抗的制備制備重金屬特異性單抗的關(guān)鍵點在于金屬抗原的制備。重金屬離子自身不能作為有效的抗體識別目標，因為它們帶有電荷，趨向于與生物分子發(fā)生強烈的不可逆的反應(yīng)（這也是重金屬的毒性所在），因此用鰲合劑與金屬離子配位使之與生物分子的反應(yīng)能力減弱，這種金屬-鰲合劑復(fù)合物應(yīng)能夠提供一個能被免疫系統(tǒng)識別的有機物外殼 10。應(yīng)用此理論在制備重金屬特異性單抗時發(fā)現(xiàn)重金屬-鰲合劑復(fù)合物是低分子量的半抗原，不足以引起小鼠免疫反應(yīng)的發(fā)生，后來選用結(jié)構(gòu)較復(fù)雜的大分子雙功能鰲合劑，一方面鰲合重金屬，另一方面通過

6、其上的硫氰基團將其偶聯(lián)到載體蛋白（BSA 或KLH ）上，從而制備出完全抗原1, 612。制備金屬特異性單抗可以通過篩選或合成鰲合劑、抗原制備、小鼠免疫、細胞融和、雜交瘤篩選、抗體純化、抗體結(jié)合屬性分析等步驟完成。2 重金屬競爭性免疫檢測方法2.1 重金屬間接競爭ELISA 免疫檢測法重金屬間接競爭ELISA 免疫檢測法是通過樣品中的重金屬離子與過量鰲合劑形成溶解性的金屬-鰲合劑復(fù)合物抗原（溶解性抗原）與已經(jīng)包被在酶標板上的金屬-鰲合劑-蛋白質(zhì)復(fù)合物抗原（固化抗原）競爭抗體的抗原結(jié)合位點，添加酶標二抗和顯色物質(zhì)產(chǎn)生熒光信號，與標準曲線對照得出樣品中的重金屬離子濃度1, 3, 10。2.2 重金

7、屬KinExA 免疫檢測方法KinExA 是一種計算機控制的流式熒光計，用來進行自由抗體、自由抗原和抗體-抗原復(fù)合物的快速分離和定量檢測13。KinExA 由毛細管流/觀察單元組成并配有多微孔篩，各種被測液能在負壓下通過篩孔。統(tǒng)一大小的小珠堆積在篩子上形成了一個填充床，其表面包被固化抗原。與間接競爭ELISA 法一樣，樣品中的重金屬離子先與過量鰲合劑鰲合形成溶解性抗原，加入抗體并使抗體和溶解性抗原之間的結(jié)合達到平衡，然后這種溶液快速流過包被有固化抗原的小珠，這時還具有抗原結(jié)合位點抗體被小珠捕獲，用緩沖液沖洗，加入酶標二抗和顯色劑顯色，通過PC 界面來檢測和記錄熒光信號，與標準曲線對照得出金屬離

8、子濃度14, 15。Blake 等人分別用KinExA 法和間接競爭ELISA 法對樣品中的Cd 2、Co 2、U 6+、Pb 2離子進行檢測1。結(jié)果顯示KinExA 法檢測這些金屬的靈敏度和精度都遠遠優(yōu)于間接競爭ELISA 法。其原因可能在于1, 10：（1）包被固化抗原的小珠具有較大的表面積；（2）檢測液以較高的流速通過小珠，這樣能降低其在反應(yīng)界面的擴散；（3）抗體與固化抗原接觸時間有限（250400 ms ），這樣能減少抗體重復(fù)結(jié)合到固化抗原上；（4）抗體對溶解性抗原和固化抗原的結(jié)合力不同。初步試驗表明KinExA 3000具有用作環(huán)境樣品重金屬離子免疫檢測傳感器的能力，后來Blake

9、等人用它研制出檢測Cd 2+離子的免疫傳感器模型，它能精確地測量適度復(fù)雜樣品矩陣，達到與ICP-AES 可比的檢測水平1。目前應(yīng)用KinExA 儀器對重金屬離子進行檢測只是在實驗室中進行，Blake 等人正與Sapidyne 儀器公司和KinExA 制造商進行合作使這種儀器小型化并能應(yīng)用于現(xiàn)場檢測3。2.3 一步競爭性重金屬免疫檢測法在間接ELISA 法檢測的基礎(chǔ)上，Darwish 等人采用一步競爭性免疫檢測法（直接競爭ELISA 法）對水樣中的Cd 2+離子進行檢測4。其基本原理是把檢測抗體包被在酶標板內(nèi)，樣品中的金屬離子先與過量鰲合劑混合形成金屬離子-鰲合劑復(fù)合物，并與已知濃度的金屬離子-

10、鰲合劑-酶復(fù)合物混合，二者在包被有抗體的微孔中競爭抗體的抗原結(jié)合位點，沖洗后加底物顯色，與標準曲線對照得出金屬離子濃度。這種方法與間接競爭ELISA 法不同之處在于：（1）包被在微孔板內(nèi)的前者是抗體，后者為金屬-鰲合劑-蛋白質(zhì)復(fù)合物抗原；（2）樣品中的金屬離子形成金屬-鰲合劑復(fù)合物后，前者是與金屬-鰲合劑-酶復(fù)合物競爭檢測抗體結(jié)合位點，從而不需要添加酶標二抗（一步競爭法由此得出），后者是與金屬-鰲合劑-蛋白質(zhì)復(fù)合物競爭。Darwish 等人研究表明，一步競爭性重金屬免疫檢測法比兩步法（間接競爭ELISA 法）靈敏、簡便，并且其pH 值在7.07.6范圍內(nèi)不產(chǎn)生抑制，優(yōu)于兩步法的PH 值范圍（7

11、.07.2），這種相對較寬的pH 工作范圍減少了對檢測樣品的pH 值限制，它對Cd 2+離子的檢測限能達到0.3×10-9，如此高的靈敏度能夠?qū)θ祟愌逯蠧d 2+離子進行檢測。隨后Darwish 等人用此法實現(xiàn)了對人類血清中的Cd 2+離子進行檢測，檢測范圍在0.24100 g/L（變異系數(shù)10%），其檢測結(jié)果與石墨爐原子吸收光譜法有較高的相關(guān)度（r 0.984）16。 2.4 熒光偏振重金屬免疫檢測熒光偏振重金屬免疫檢測法（FPIA ）是不同于ELISA 法的熒光標記免疫檢測方法，其原理為樣品中的金屬離子與過量鰲合劑形成金屬-鰲合劑復(fù)合物后，與固定濃度的金屬-鰲合劑熒光復(fù)合物競爭

12、檢測抗體上的結(jié)合位點，然后進入熒光偏振分析儀進行分析，通過與標準曲線對照得出金屬離子的濃度。Elbaum 等人用酶間接熒光偏振法檢測Zn 2+離子，并提出這種方法用在現(xiàn)場測試時非常有效17。Johnson 等人用FPIA 法對土壤、固體廢物滲濾液、空氣塵埃、飲用水中的Pb 2+離子進行檢測，試驗結(jié)果表明土壤樣品的檢測結(jié)果與ICP-ACE 的檢測結(jié)果的相關(guān)系數(shù)（r 2）高達0.96，其檢測限可達1×10-9左右9。后來Johnson 又用此法對環(huán)境中的Pb 2+和Cd 2+離子進行檢測，二者的檢測限分別為20×10-12和低于100×10-12 10。3 金屬特異性

13、抗體-抗原結(jié)合屬性初步研究金屬離子-鰲合劑復(fù)合物能提供一個獨特的、能被抗體識別的結(jié)構(gòu)，改變、更換金屬離子或者鰲合劑都能使該結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，但金屬離子的更換使該結(jié)構(gòu)的改變較小，而鰲合劑的改變或更換則可使之有較大的改變11，從而影響抗體對金屬離子-鰲合劑復(fù)合物的親合力和識別能力。另外，金屬特異性抗體中的部分氨基酸在識別抗原中起了非常重要的作用。3.1 金屬離子-鰲合劑復(fù)合物中的金屬離子對抗體親合力的影響B(tài)oden 等人對mAb734（抗DTPA-In 3+復(fù)合物抗體）的結(jié)合屬性的研究發(fā)現(xiàn)：此抗體對DTPA-Fe 3+、-Fe 2+、-Cu 2+、-Mg 2+、-Ca 2+、-Zn 2+的親合力比DT

14、PA-In 3+少了兩個數(shù)量級，他們對這些金屬在元素周期表中的位置和它們的電子軌道進行比較，認為mAb734對其他金屬親合力減少的原因可能是這些金屬離子的電子的和形態(tài)的并協(xié)性（complementarity ）的不同引起的18。另外，Blake 等人對CHA255抗體和2A81G5抗體的結(jié)合屬性進行比較分析得出，CHA255抗體的K D 值不與金屬離子半徑或者金屬離子-鰲合劑的穩(wěn)定常數(shù)相關(guān)，而2A81G5抗體對金屬離子特異性和結(jié)合力與二價金屬原子大小有較好的相關(guān)性（Hg 2+和Mg 2+除外）8。 3.2 鰲合劑的結(jié)構(gòu)在抗體識別抗原中的作用 3.2.1 鰲合劑一級化學結(jié)構(gòu)對抗體親合力的影響Kh

15、osraviani 等人對鰲合劑DTPA 、EDTA 及其衍生物與2C12抗體的結(jié)合屬性進行研究發(fā)現(xiàn)：2C12抗體對DTPA 和EDTA 親合力最低，增加一個p -硝基苯基到二者上可使其與抗體的親和力分別增加30倍和5.7倍；增加一個環(huán)己基效果更加顯著：抗體對CHXDTPA 和CHXEDTA 的親合力分別為DTPA 和EDTA 的9100倍和160倍19。鰲合劑的結(jié)構(gòu)不但影響抗體與鰲合劑的親合力，而且影響抗體與金屬-鰲合劑復(fù)合物的親合力。Blake 等人用抗體2A81G5、2C12、15B4、8A11研究鰲合劑結(jié)構(gòu)對抗體與金屬-鰲合劑復(fù)合物結(jié)合力的影響1。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：由于制備2A81G5、2C1

16、2、15B4抗體的原抗原中的金屬-鰲合劑部分都通過硫脲基-L-苯基與蛋白質(zhì)KLH 聯(lián)接，造成這些抗體偏向于結(jié)合含苯基、硫脲基-L-苯基的鰲合劑-金屬復(fù)合物。例如，2A81G5抗體與Cd 2+-EDTA 復(fù)合物的K d 值為21 nM，當在EDTA 上增加一個p -硝基苯基則其K d 值降為5.6×10-10 M，當Cd 2+-EDTA-苯分子通過硫脲基偶聯(lián)到BSA 上時其K d 值降低到了7.2×10-11 M 8。2C12抗體結(jié)合Pb 2+-DTPA-硫脲基-L-苯基-BSA 的親合力比Pb 2+-DTPA 復(fù)合物增加了300倍，當用CHXDTPA 替代Pb 2+-DTP

17、A 復(fù)合物中的DTPA 后，2C12抗體對其親合力增加了將近1000倍19。抗體15B4也有類似的性能1。CHA255抗體對p -硝基苯-EDTA-In 3+的親合力比EDTA- In3+大了10倍左右5, 20。而抗體8A11的原抗原為KLH-硫脲基-DCP-U 6+，這種抗原中的鰲合劑并沒有通過一個體積較大的苯基使其與蛋白質(zhì)偶聯(lián)在一起，這樣蛋白質(zhì)-硫脲基-DCP-U 6+復(fù)合物抗原與溶解性的DCP-U 6+復(fù)合物抗原在結(jié)構(gòu)上比較類似，使抗體8A11對二者親合力的差別比起上述抗體要小的多3。Jones 等人用Cd 2+-EDTA-KLH 復(fù)合物抗原制備出A4和E5抗體，在研究它們與抗原結(jié)合屬

18、性時發(fā)現(xiàn)這兩種抗體對EDTA 的親合力幾乎可以忽略，但當將EDTA 替換為CDTA 后，抗體A4對CDTA 有較低的親合力（K D 值為0.527 mM），而抗體E5對其有較高的親合力（K D 值為22.7 nM ）11?？贵wA4對金屬離子-CDTA 復(fù)合物的親合力要低于相應(yīng)的金屬-EDTA 復(fù)合物，而抗體E5對金屬離子-CDTA 復(fù)合物的親合力要高于相應(yīng)的金屬離子-EDTA 復(fù)合物。Blake 等人對2A81G5抗體、2C12抗體和15B4抗體等3種抗體對金屬-鰲合劑復(fù)合物的識別屬性的比較分析后得出：抗體對鰲合劑的親合力越高，它對金屬離子的特異性就越強2。3.2.2 金屬離子-鰲合劑復(fù)合物三

19、維結(jié)構(gòu)的差異對抗體識別能力的影響Jones 等人采用距離矩陣（DMs ）法比較不同金屬-鰲合劑復(fù)合物分子三維結(jié)構(gòu)的差異。他們分別用與抗體A4和E5結(jié)合力最高的Hg 2+-EDTA 復(fù)合物和Cd 2+-EDTA 復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)作為標準，其他四種金屬離子-EDTA 復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)與之比較，發(fā)現(xiàn)這些金屬離子-鰲合劑復(fù)合物三維結(jié)構(gòu)的差異（DDMs ）與抗體A4對它們的親合力（log K d ）具有較好的相關(guān)性（r 20.97），而抗體E5的這種相關(guān)性稍微差了一點（r 20.84）11。當鰲合劑與金屬離子結(jié)合時，鰲合劑構(gòu)型發(fā)生改變這是抗體識別的一個重要因子，DDM 研究發(fā)現(xiàn)不同金屬離子-鰲合劑半抗原

20、之間較大的區(qū)別在于環(huán)繞金屬離子鰲合劑鍵的不同，這種觀點通過研究抗體CHA255分別結(jié)合In 3+和Fe 3+-EDTA 復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)得到證實，當鰲合劑復(fù)合物中In 3+被Fe 3+取代后，環(huán)繞金屬離子的鰲合劑臂的構(gòu)型變化，堵塞了抗體通過組氨酸對金屬離子的調(diào)節(jié)，因而降低其與抗體的親合力21。從CHA255抗體獲得的晶體學數(shù)據(jù)指出這些小差別的累積效果很可能改變抗體的親合力，進一步的研究還發(fā)現(xiàn)如果金屬離子-鰲合劑復(fù)合物能較快的轉(zhuǎn)變到抗體能識別的構(gòu)型，那么抗體就能夠提高結(jié)合速率，所以抗體-抗原的結(jié)合常數(shù)能提供金屬-鰲合劑是否適合抗體結(jié)合點的信息。Jones 等人認為用DM 比較金屬離子-鰲合劑復(fù)合

21、物的三維結(jié)構(gòu)的差異比單獨比較金屬離子半徑優(yōu)越。3.2.3 金屬離子-鰲合劑復(fù)合物的價態(tài)對抗體識別抗原的影響Khosraviani 等人發(fā)現(xiàn)2C12抗體對DTPA 的結(jié)合性能優(yōu)于EDTA 19，其原因可能是金屬離子與不同鰲合劑結(jié)合后，鰲合劑將呈現(xiàn)不同的特征：EDTA 與大多數(shù)金屬離子形成六價態(tài)（hexacoodinate ）復(fù)合物，而DTPA 和CHXDPTA 卻呈現(xiàn)八價態(tài)（octacoordinate ）復(fù)合物22, 23?？贵w對不同鰲合劑復(fù)合物親合力的不同可能反映了抗體傾向于結(jié)合那些具有八價態(tài)結(jié)構(gòu)的金屬離子-鰲合劑復(fù)合物。目前因缺乏Pb 2+-DTPA 或者Pb 2+-CHXDTPA 的晶體

22、結(jié)構(gòu)或者NMR 數(shù)據(jù)，因此還不能完全肯定金屬離子-鰲合劑復(fù)合物的價態(tài)影響了2C12抗體對金屬離子-鰲合劑復(fù)合物與游離鰲合劑的親合力。此外，Blake 等人發(fā)現(xiàn)2A81G5抗體對金屬離子特異性和結(jié)合力與二價金屬原子大小具有較好的相關(guān)性，而Mg 2+離子與抗體的結(jié)合力小于按照它的原子大小得出的預(yù)測值，其原因是Mg 2+離子與EDTA 和H 2O 形成七價復(fù)合物，而不是象其他金屬離子與EDTA 形成六價復(fù)合物，七價復(fù)合物被認為可以結(jié)合不同的抗體位點8；3.3 氨基酸殘基在抗體識別抗原中的作用研究Robert 等人對抗體CHA255的分子結(jié)構(gòu)研究表明，抗體CHA255對In 3+離子抗原結(jié)合力最強，而

23、當抗原中的In 3+被其他金屬離子替代后，抗體CHA255對替代后的復(fù)合物的結(jié)合力減少了2420000倍21。他們對結(jié)合有In 3+和Fe 3+-EOTUBE （EOTUBE 為硫脲基-L-苯基-EDTA 復(fù)合物的簡稱）復(fù)合物的抗體-抗原結(jié)合片段進行X 射線晶體結(jié)構(gòu)分析，結(jié)果顯示抗體-In 3+-EDTA 復(fù)合物具有一個明顯的特征：抗體重鏈CDR3中的一個His 殘基能補充調(diào)節(jié)In 3+離子，鄰近此His 的一個Arg 能與復(fù)合物中的一個羧酸鍵形成離子對，當Fe 3+離子替換In 3+離子后，由于抗體-In 3+-EOTUBE 復(fù)合物中的Gly 鍵的構(gòu)象發(fā)生變化，導(dǎo)致CDRH3中的這個His

24、殘基不再對Fe 3+離子進行調(diào)節(jié)，使抗體對Fe 3+-EOTUBE 復(fù)合物的親合力減少了20多倍。Blake 等人以CHA255的分子模型作為模板，對2A81G5抗體進行分子模型分析8。他們提出在抗體重鏈CDR3區(qū)域的His-96殘基在結(jié)合Cd 2+-EDTA 復(fù)合物中起到了非常重要的作用，并且重鏈中的Trp 52可能與抗原中的苯分子之間存在著相互作用，致使抗體對p -硝基苯-EDTA-復(fù)合物的親合力比Cd 2+-EDTA 復(fù)合物高37倍左右；其他建模研究提出了另外一種分子構(gòu)象，這種構(gòu)象中的另一個His （特別是組氨酸L27D ）非常接近金屬陽離子，它可能參與抗原-抗體的結(jié)合。Khosravi

25、ani 等人對2C12抗體的克隆和測序表明在抗體重鏈CDR3中沒有His 殘基，這表明除了His 以外的氨基酸側(cè)鏈必定參與了Pb 2+-鰲合劑復(fù)合物的識別，另外他們發(fā)現(xiàn)在2C12抗體的輕鏈和重鏈的CDRs 中都富含Ser 、Thr 和Tyr ，很可能一些含有羥基的配位基團參與了抗原的識別19。Roberts 等人對具有催化作用的金屬抗體的結(jié)構(gòu)研究已經(jīng)證實在抗體的輕鏈CDRs 中特定的殘基（L32，L34，L89和L91）處在與金屬離子結(jié)合的合適方位，經(jīng)過直接的位點突變，在這些殘基中插入His ，使抗體對Zn 2+離子的親合力增加24。Delehanty 等人通過價態(tài)改變（Covalent mo

26、d-ifition ）和位點突變（site-directed mutagenesis ）的方法來證實抗體中的某些殘基在抗原識別中的重要性15。他們在E5抗體的結(jié)合位點分子模型中發(fā)現(xiàn)，抗體的CDR H3中的His 96側(cè)鏈朝向結(jié)合團的中央，當His 96被突變?yōu)長eu （H96L ），E5抗體識別Cd 2+-鰲合劑復(fù)合物的能力全部消失，這表明抗體E5中的His 96能直接結(jié)合Cd 2+離子。對E5抗體和5B2抗體的抗原結(jié)合位點的其他氨基酸的突變分析表明這些氨基酸參與穩(wěn)定抗體與金屬離子-鰲合劑復(fù)合物中的鰲合部分的相互作用15。這種作用已經(jīng)在CHA255抗體和2A81G5抗體中表現(xiàn)出來：在CHA25

27、5的晶體結(jié)構(gòu)中，Arg 、Thr 和Trp 側(cè)鏈能與EDTA 中的羧酸鍵形成離子對和氫鍵作用，在2A81G5模型中，Trp 的吲哚環(huán)被認為參與穩(wěn)定抗體與抗原中的苯分子的疏水作用8。對抗體E5重鏈中的Trp 52和輕鏈中的Arg 96的突變分析表明二者起了穩(wěn)定作用，因為對這些位點的突變將導(dǎo)致抗體與Cd 2+-EDTA 結(jié)合能力的減少，而不像對His 96突變造成對總的結(jié)合能力產(chǎn)生抑制；將Trp 52突變?yōu)锳la （W52A ），抗體結(jié)合抗原的能力僅僅只有4倍的減少，這表明突變?nèi)コ丝贵w和鰲合劑之間的相對較弱的疏水作用，將Arg 96突變?yōu)長ys （保留它的陽性電荷和其側(cè)鏈的龐大體積），這導(dǎo)致其親

28、合力減少16倍，而將Arg 96突變?yōu)長eu （去除其電荷和側(cè)鏈龐大體積），這使其對抗原結(jié)合力減少64倍，這些結(jié)果表明Arg 96的帶陽性電荷的長側(cè)鏈能與EDTA 鰲合劑形成離子對。 對抗體 5B2分子模型研究表明Lys 58的側(cè)鏈朝向結(jié)合位點的中心，至少存在一個Lys 殘基參與對Pb 2+-鰲合劑復(fù)合物的識別。將Lys 58突變?yōu)镮le （K58I ），去除陽性電荷而保留側(cè)鏈龐大體積，導(dǎo)致抗體對Pb 2+-DTPA 復(fù)合物的親合力減少1.8倍，而將其突變?yōu)锳la （K58A ）將導(dǎo)致其親合力減少3.2倍。這些數(shù)據(jù)表明Lys 58參與作用于金屬離子-鰲合劑復(fù)合物中的一個羧酸?？贵w識別金屬離子-

29、鰲合劑復(fù)合物抗原僅僅通過有限數(shù)量的分子接觸，進行抗體和金屬離子之間、抗體與抗原的鰲合物的直接配位。4 未來前景隨著我國社會經(jīng)濟的迅猛發(fā)展，工業(yè)化、城市化的推進，“三廢”物質(zhì)的大量排放，造成食品、土壤中重金屬的大量殘留，對人類健康構(gòu)成嚴重威脅。我國北方大城市的蔬菜基地和部分商品糧基地存在著不同程度的重金屬污染25。南方以廣東省為例，韶關(guān)、茂名、廣州等地的部分水稻、蔬菜以及珠海市場上的少數(shù)海魚、甲殼類及貝殼類水產(chǎn)品 Pb 、Cd 污染相當嚴重26；珠江三角洲的兩個具有代表性鄉(xiāng)鎮(zhèn)工業(yè)區(qū)石龍和容桂工業(yè)區(qū)土壤沉積物中重金屬的累積與本地區(qū)的工農(nóng)業(yè)發(fā)展階段和發(fā)展水平密切相關(guān)27。隨著人民生活水平的提高、健康

30、和環(huán)保意識的增強，食品安全和環(huán)境中的重金屬殘留問題倍受關(guān)注，因而相關(guān)職能部門對樣品中的重金屬殘留檢測任務(wù)十分繁重。而重金屬免疫學檢測方法因其具有速度較快、費用低廉、簡單易攜、具有高度的靈敏度和選擇性等優(yōu)點，它將成為進出口食品檢驗部門、食品衛(wèi)生部門、水產(chǎn)養(yǎng)殖和漁業(yè)檢測部門等部門的首選方法，重金屬免疫檢測方法的成熟與普及將十分有利于我國食品的可持續(xù)發(fā)展和食品安全保障工作，具有良好的經(jīng)濟價值和社會效益，市場前景十分廣闊。發(fā)展重金屬的免疫檢測方法并不是要取代傳統(tǒng)的重金屬的檢測方法，而是一種輔助的檢測方法，用于重金屬污染樣品的現(xiàn)場檢測和批量樣品的快速掃描，這種檢測儀器的小型化、便攜化能減少定點檢測和補救

31、工作的費用，并且能極大的提高風險評估工作的效率和質(zhì)量。重金屬免疫檢測方法仍有許多的改進途徑和擴展方法，因為任何免疫檢測的靈敏度和特異性都取決于抗體的結(jié)合屬性，其性能的提高將可能來自具有新的結(jié)合特性的抗體的產(chǎn)生。近年來，重組單克隆抗體建構(gòu)技術(shù)和有目的的基因操縱技術(shù)的進步對已經(jīng)開發(fā)出的單克隆抗體的優(yōu)化和調(diào)整提供了新的機遇，為重金屬免疫學檢測技術(shù)的應(yīng)用提供了廣闊的前景。致謝：暨南大學生科院生物工程系抗體工程研究中心唐勇博士審閱本稿，并提出寶貴意見，特此感謝！參考文獻：1 BLAKE D A, JONES R M, BLAKE R C. Antibody-based sensorsfor heavy

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47、學檢測技術(shù)研究進展 23 MAECKE H R, RIESEN A, RITTER W. The monolecular structure of indium-DTPAJ. The Journal of Nuclear Medicine Online, 1989, 30: 1 2351 239. 24 ROBERTS V A, IVERSON B L, IVERSON S A, et al. Antibody remodeling : a general solution to the design of a metal-coordination site in an antibody bi

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