培養(yǎng)體系對維持人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞特性及其體外擴(kuò)增效率的影響

1、培養(yǎng)體系對維持人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞特性及其體外擴(kuò)增效率的影響孫亞如，張炳強(qiáng)，王福斌，許胞移襲點(diǎn)實驗室臨床中心，山東省青島市張炳強(qiáng)評，王、二樸，李翠翠青島市立醫(yī)院衛(wèi)生部細(xì) 李翠翠中國組織工程對266000)維持人臍帶究，2017 21(13):2023-2028.:10.3969.2095-4344.2017.13.010: 0000-0002-7756-9487孫亞如)文章快速閱讀：孫亞如，男，19831983 年生, 山東省青島市人，漢族，2002007 7年英國謝菲爾德大 學(xué)畢業(yè)，碩士，主要從事不同培養(yǎng)體系中人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的特性及體外擴(kuò)增效率源胞充其干分化最終喪失干細(xì)胞特薩后,會去治療的

2、能最大，最終持干細(xì)細(xì)特特及，擴(kuò)增效率的療養(yǎng)體 無血清培養(yǎng)體系：是一種無任何血清成最，通過像雞尾酒式的HBfc無任-過式 不培之體系作為臨體。盤到胞嘶的需求。然增 干細(xì)胞干細(xì)多量胞然間要質(zhì)度年。干細(xì)胞相關(guān)技術(shù)的研究。并列第一作者： 張炳強(qiáng)，男，19791979 年生，山東省青 島市人，漢族，碩士，主 要從事干細(xì)胞研究。通訊作者：孫亞如，青島 市立醫(yī)院衛(wèi)生部細(xì)胞移植 重點(diǎn)實驗室臨床中心，山東省青島市266000266000中圖分類號394.2文獻(xiàn)標(biāo)識碼文章編號：2095-4344(2017)13-02023-06稿件接受：2016-12-16血細(xì)可血臍帶體干細(xì)胞|培|體面有較大提升。盡管如血的異源

3、性容易顯著分化，難以維持干無的特性養(yǎng)體系中隨傳遞增擴(kuò),QingdaoMuni cipal Hospital, Qin gdao266000, Sha ndong Provinee, Chi naU系對人臍帶充質(zhì)-干細(xì)一定性,法 :將養(yǎng)體份人臍帶標(biāo)本分另U接種于.6種培養(yǎng)體系 、板裂解液(A W)、基中質(zhì)加細(xì)2%原代培養(yǎng)2%人血小一 一完全培養(yǎng)基10%人*較各培養(yǎng)體代細(xì)胞扁培養(yǎng)1培果分、更液培地維 度維持人臍帶間充質(zhì)細(xì)細(xì)特特性及擴(kuò)增效 擴(kuò)行臍 培血紳、6-種培養(yǎng)體系分另為全 全培養(yǎng)基-!増養(yǎng)完全培(C組)、 數(shù)，1。%胎牛血清大傳1面標(biāo)記細(xì)長梭大且小不小較均一、F組第B14 d.后,Qin gd

4、aoMuni cipal Hospital, Qin gdao266000, Sha ndong Provinee,Chi na,Qin gdaoMuni cipal Hospital, Qin gdao266000, Sha ndong Provinee, Chi na組小不土代細(xì)胞形態(tài)及大小較胞形態(tài)較無明顯代時細(xì)長，組組第代細(xì)胞趨于態(tài)平第 大小檢均平果無明組區(qū)別代形態(tài)較|數(shù)量小組各代相細(xì)關(guān)明性及鍵，無詞擴(kuò)血增：清效和率人。血小板裂解液相結(jié)主基干題；細(xì)詞胞篩：選；臍形帶臍態(tài)；血表干細(xì)型；胞分；化臍帶；擴(kuò)|間充質(zhì)干細(xì)胞；培養(yǎng)體系；培養(yǎng) 主干題細(xì)詞胞：；臍帶；間質(zhì)干細(xì)胞；組織工程, Qingda

5、o Municipal Hospital, Qingdao:, , , P, , .2017;21(13):2023-2028.0引言間充質(zhì)干細(xì)胞是一群具有自我 更新及多向分化潛能的成體干細(xì)胞， 因其具有免疫調(diào)控、細(xì)胞因子分泌、 組織器官定植等特點(diǎn)而成為細(xì)胞治 療的理想種子細(xì)胞1。目前，間充質(zhì) 干細(xì)胞已被廣泛用于臨床試驗研究，在移植治療移植物抗宿主病、 急性心 肌梗死、糖尿病、脊髓損傷、軟骨和 骨損傷、克羅恩病等方面均顯示出良好的效果2-11。臍帶是連于胎兒臍部與胎盤間 的條索狀結(jié)構(gòu)。從臍帶組織華通氏膠 中分離出的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞，拓展 了間充質(zhì)干細(xì)胞的來源途徑。與其他 來源的間充質(zhì)干細(xì)胞相比

6、，臍帶間充 質(zhì)干細(xì)胞具有取材方便、免疫原性低、原始豐度高且|殖能力強(qiáng)等優(yōu) 點(diǎn)，成為更為理想的間充質(zhì)干細(xì)胞來r _* r d Q d Cl盡管臍帶來源間充質(zhì)干細(xì)胞的 原始豐度高于骨髓、骨膜、胎盤來源 間充質(zhì)干細(xì)胞，其數(shù)量依然需要經(jīng)過 體外數(shù)代擴(kuò)|才能達(dá)到臨床應(yīng)用的 需求。然而，臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞并非 永生化的干細(xì)胞，在多次傳代后，會 隨擴(kuò)|的數(shù)量|多而逐漸分化，最終 喪失干細(xì)胞特性，進(jìn)而失去治療功能16。因此選擇能最大限度維持干細(xì)胞 特性及高擴(kuò)|效率的培養(yǎng)體系至關(guān) 重要。實驗前期數(shù)據(jù)顯示，應(yīng)用人血小 板裂解液培養(yǎng)體系對人臍帶間充質(zhì) 干細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)時，較無血清培 養(yǎng)體系能更好地維持干細(xì)胞特性，而

7、 無血清培養(yǎng)體系相較于人血小板裂 解液培養(yǎng)體系能一定程度上提高間充質(zhì)干細(xì)胞的體外|殖能力。結(jié)合人 血小板裂解液培養(yǎng)體系和無血清培 養(yǎng)體系的優(yōu)勢，實驗研究在胎牛血清a( C),3A B.5AA B.( D,),D,C,10%53 .(3C3).( E),2%10%( A)(,F).3 E F,3 . D,53 5 F.A B E F,B D.2%CED.量基顯能著較低好于地培維養(yǎng)l=r結(jié)合266(000；,，China)(培養(yǎng)體系、人血小板裂解液培養(yǎng)體系 和無血清培養(yǎng)體系的基礎(chǔ)上，加入無 血清和人血小板裂解液相結(jié)合的培 養(yǎng)體系，對人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行 體外連續(xù)傳代培養(yǎng)，比較各培養(yǎng)體系 對臍帶間

8、充質(zhì)干細(xì)胞的細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞表面標(biāo)記物、 細(xì)胞分化及增殖能力 的影響，為兼具干細(xì)胞特性維持和高 擴(kuò)增效率的臨床級臍帶間充質(zhì)干細(xì) 胞培養(yǎng)體系的篩選提供數(shù)據(jù)支持。1材料和方法1.1設(shè)計體外細(xì)胞學(xué)觀察實驗。1.2時間及地點(diǎn)實驗于2016年3至5月在青島市立醫(yī)院衛(wèi)生部細(xì)胞移植 重點(diǎn)實驗室臨床中心完成。1.3材料 選用血液微生物檢測合 格的6份臍帶樣本，新生兒男女各半， 采自青島市立醫(yī)院產(chǎn)科，產(chǎn)婦均簽署 實驗知情同意書。主要試劑與儀器：無血清完全培 養(yǎng)基()；無血清完全培養(yǎng)基、間充 質(zhì)干細(xì)胞成脂誘導(dǎo)試劑盒、間充質(zhì)干 細(xì)胞成骨誘導(dǎo)試劑盒()；胎牛血清(); 低糖圖 2 第 5 代人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)記物

9、的表達(dá)率圖 1 各培養(yǎng)體系中人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的形態(tài)對比(相差顯微鏡，X100)1(, TOO)圖注： 圖中 a 為第 3 代臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞， b 為第 5 代臍帶間充質(zhì)干細(xì) 胞。A 為無血清完全培養(yǎng)基中添加 2%人血小板裂解液培養(yǎng)體系，B 為 無血清完全培養(yǎng)基中添加 2%人血小板裂解液培養(yǎng)體系，C 為無血清完 全培養(yǎng)基培養(yǎng)體系，D 為無血清完全培養(yǎng)基培養(yǎng)體系，E 為低糖中添加 體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清培養(yǎng)體系，F(xiàn) 為低糖中添加 10%人血小板裂解液 培養(yǎng)體系。a b圖 3 各培養(yǎng)體系中第 5 代人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞分化能力的比較(400)35( 400)圖注：圖中 a 為成脂誘導(dǎo)，b 為成骨誘

10、導(dǎo)。A 為無血清完全培養(yǎng)基中添 加2%人血小板裂解液培養(yǎng)體系，B 為無血清完全培養(yǎng)基中添加 2% 人血小板裂解液培養(yǎng)體系，C 為無血清完全培養(yǎng)基培養(yǎng)體系，D 為無 血清完全培養(yǎng)基培養(yǎng)體系，E 為低糖中添加體積分?jǐn)?shù) 10%胎牛血清培 養(yǎng)體系，F(xiàn) 為低糖中添加 10%人血小板裂解液培養(yǎng)體系。- -F I*L LnbnbL LS S_L_L didi忙.%T&%T& CD01 FTTCCtHSHIC二 I A 組B 組二 C 組D 組 U E 組 =F 組15 -110圖 4 各培養(yǎng)體系中人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞擴(kuò)增能力的比較4圖注： A 組各細(xì)胞代次細(xì)胞擴(kuò)增數(shù)量顯著高于 C 相組對應(yīng)的細(xì)胞代次 （P 0

11、.001） ，B 組各細(xì)胞代次細(xì)胞擴(kuò)增數(shù)量顯著高于 D 組相對應(yīng)細(xì)胞代次 （P 0.001） ; E、F 組擴(kuò)增數(shù)量顯著低于 A、B 組（P 0.001）。A 為無血清完全培養(yǎng)基中添加 2%人血小板裂解液培養(yǎng)體系，B 為無血清完全培 養(yǎng)基中添加 2%人血小板裂解液培養(yǎng)體系， C 為無血清完全培養(yǎng)基培養(yǎng)體系， D 為無血清完全培養(yǎng)基培養(yǎng)體系， E 為低糖中添加體積分?jǐn)?shù) 10% 胎牛血清培養(yǎng)體系， F 為低糖中添加 10%人血小板裂解液培養(yǎng)體系。（）；人血小板裂解物（捐獻(xiàn)者自體血 漿）；34、45、105、44、14、31、90、 流式細(xì)胞儀（）。1.4實驗方法 人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的原代分離及擴(kuò)增

12、培養(yǎng) ：6份臍帶樣本均于采 集后的24 h內(nèi)送到青島市立醫(yī)院衛(wèi)生 部細(xì)胞移植重點(diǎn)實驗室臨床中心，進(jìn) 行臍帶的血管剝離及臍帶組織處理。將每份處理后的臍帶組織塊分 別接種于6種培養(yǎng)體系進(jìn)行細(xì)胞原代 培養(yǎng)，分別為無血清完全培養(yǎng)基中添 加2%人血小板裂解液（A組）、無血清 完全培養(yǎng)基中添加2%人血小板裂解 液（B組）、無血清完全培養(yǎng)基（C組）、無 血清完全培養(yǎng)基（D組）、低糖中添加體 積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清（E組）、低糖中添 加10%人血小板裂解液（F組）。14 d后 進(jìn)行消化傳代培養(yǎng)。將消化獲得的臍 帶間充質(zhì)干細(xì)胞以1X1042的密度接 種于直徑100的無菌培養(yǎng)皿中，行體 外連續(xù)傳代培養(yǎng)。1.5主要觀

13、察指標(biāo)細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察 ：應(yīng)用倒置相差 顯微鏡觀察臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的形 態(tài)，比較各培養(yǎng)體系對臍帶間充質(zhì)干 細(xì)胞形態(tài)學(xué)的影響。細(xì)胞表面標(biāo)志物檢測 ：將各組臍 帶間充質(zhì)干細(xì)胞傳代至第5代，流式 檢測表面標(biāo)記物。方法如下，取5X106細(xì)胞，經(jīng)洗滌、過濾、固定、熒光抗 體標(biāo)記、再洗滌，流式細(xì)胞儀上樣，檢測表面標(biāo)記物105、90、44、34、45、14、31和的表達(dá)率，比較各培養(yǎng)組間 細(xì)胞表面標(biāo)志物表達(dá)的差異，分析各培養(yǎng)體系對細(xì)胞表面標(biāo)志物表達(dá)的 影響。細(xì)胞誘導(dǎo)分化能力檢測：將各 組臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞傳代至第3代， 以1X1042的密度接種24孔板，于細(xì)胞 融合度達(dá)到100%時全量更換成脂誘 導(dǎo)試劑，每三四

14、天半量更換新鮮誘導(dǎo) 劑，14 d后行油紅O染色，比較各培 養(yǎng)體系對臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞成脂誘導(dǎo)分化能力的影響；將各組臍帶間 充質(zhì)干細(xì)胞傳代至第5代，以1X1402的密度接種24孔板，于細(xì)胞融合度達(dá) 到80%左右時全量更換成骨誘導(dǎo)試 劑，每三四天更換新鮮誘導(dǎo)劑，28 d后行茜素紅染色，比較各培養(yǎng)體系對 臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞成骨誘導(dǎo)分化能 力的影響。細(xì)胞增殖能力檢測 ：應(yīng)用6種培 養(yǎng)體系將原代獲得的臍帶間充質(zhì)干 細(xì)胞以1X1042的密度接種于100無 菌培養(yǎng)皿，進(jìn)行傳代培養(yǎng)，每4 d傳 代，每代均以1X1402的密度接種， 傳 至第5代。將每次傳代過程中消化獲 得的細(xì)胞進(jìn)行計數(shù)， 比較各組臍帶間 充質(zhì)干細(xì)

15、胞的擴(kuò)增效率。1.6統(tǒng)計學(xué)分析 采用18.0統(tǒng)計學(xué) 軟件進(jìn)行t檢驗。2結(jié)果2.1培養(yǎng)體系對臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞 形態(tài)學(xué)的影響D組第3代細(xì)胞形態(tài)細(xì)長、大小不均，E、F組第3代細(xì)胞 形態(tài)扁平，其余組第3代細(xì)胞均為長 梭形且大小較均一（圖1a）。將各組細(xì)胞傳代至第5代，結(jié)果顯示A、B組細(xì) 胞形態(tài)及大小較第3代時無明顯變化，C組細(xì)胞形態(tài)較第3代時趨于扁平 且大小不均一，D組細(xì)胞形態(tài)較第3代時細(xì)長，E組細(xì)胞形態(tài)較第3代時 扁平，F(xiàn)組細(xì)胞形態(tài)較第3代時形態(tài)無 明顯變化（圖1b）。2.2培養(yǎng)體系對臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞 表面標(biāo)志物表達(dá)率的影響表面標(biāo)志物流式檢測結(jié)果顯示，各組105、90、44陽性表達(dá)率均大于95%，且

16、組間無 明顯表達(dá)差異；34、45、14、31和陽 性表達(dá)率均小于2%,各組間無明顯差 異（圖2，表1）。表 1 各組培養(yǎng)體系中第 5 代人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)記物的表達(dá)率15(%)組別105904434451431A 組98.4399.7898.610.280.340.220.340.65B 組99.8899.9299.730.260.260.670.320.38C 組98.9699.9899.690.180.460.040.380.39D 組99.6899.7399.840.200.790.270.450.30E 組99.0099.1398.180.110.050.140.060.50F

17、組99.7399.9499.810.370.090.800.140.52表注：A 組為無血清完全培養(yǎng)基中添加2%人血小板裂解液培養(yǎng)體系，B 組為無血清完全培養(yǎng)基中添加2%人血小板裂解液培養(yǎng)體系，C 組為無血清完全培養(yǎng)基培養(yǎng)體系， D 組為無血清完全培養(yǎng)基培養(yǎng)體系，E 組為低糖中添加體積分?jǐn)?shù) 10%胎牛血清培養(yǎng)體系，F(xiàn) 組為低糖中添加 10%人血小板裂解液培養(yǎng)體系。2.3培養(yǎng)體系對臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞 誘導(dǎo)分化能力的影響第5代細(xì)胞成脂誘導(dǎo)結(jié)果顯示，A、B組成脂誘導(dǎo) 率較高，脂滴分布較培養(yǎng)E、F組密集，C、D組誘導(dǎo)率較低（圖3a）。第5代細(xì)胞 成骨誘導(dǎo)結(jié)果顯示，A、B組鈣鹽沉淀 著色較E、F組深，C、

18、D組鈣鹽沉淀 較少（圖3b）。2.4培養(yǎng)體系對臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞 擴(kuò)增效率的影響A組各細(xì)胞代次細(xì)胞擴(kuò)增數(shù)量顯著高于C相組對應(yīng)的細(xì) 胞代次（P 0.001），B組各細(xì)胞代次細(xì) 胞擴(kuò)增數(shù)量顯著高于D組相對應(yīng)細(xì)胞 代次（P0.001）; E、F組擴(kuò)增數(shù)量顯 著低于A、B組（P 0.001），見圖4。3討論目前，干細(xì)胞行業(yè)采用的主流間 充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)體系分為以下幾種： 以胎牛血清為添加物的培養(yǎng)基；以人 血小板裂解物為添加物的培養(yǎng)基；成 分確定的無血清培養(yǎng)基【17-26。其中，胎 牛血清作為培養(yǎng)基添加成分容易帶來 動物源病毒及人畜共患病交叉感染的 風(fēng)險，同時因胎牛血清含有多種熱源 成分且難以去除，因此臨床

19、上一直在 探尋胎牛血清的替代品。人血小板裂解液是將人自體血 漿的血小板進(jìn)行反復(fù)凍融裂解的產(chǎn) 物，其含有來自血小板中的數(shù)量豐富 的血小板衍生生長因子，能促進(jìn)間充 質(zhì)干細(xì)胞的增殖并較好地維持其干 細(xì)胞特性17-19。研究顯示人血小板裂 解液含量為10%時，能最大化提升間 充質(zhì)干細(xì)胞的增殖效率18，并且在安 全性上優(yōu)于胎牛血清20-24，然而此次 實驗數(shù)據(jù)顯示，10%人血小板裂解液 培養(yǎng)體系在連續(xù)傳代后雖然能一定 程度上維持干細(xì)胞特性，但擴(kuò)增效率不及無血清培養(yǎng)體系。再者，由于人 血小板裂解液來源于供者的自體血 漿，其有限的獲取量也使得它難以滿 足間充質(zhì)干細(xì)胞的大規(guī)模傳代擴(kuò)增 需求25。無血清培養(yǎng)體系

20、是一種無任何 血清成分，通過像雞尾酒式的添加營 養(yǎng)成分和生長因子就可以維持間充 質(zhì)干細(xì)胞在體外生長繁殖的培養(yǎng)體 系。它不僅能夠避免異種血清可能對 細(xì)胞帶來的異源性污染，而且較胎牛 血清和人血小板裂解液培養(yǎng)體系在 細(xì)胞增殖效率方面有較大提升26-40。 盡管如此，實驗數(shù)據(jù)顯示單獨(dú)應(yīng)用無 血清培養(yǎng)體系作為臨床級臍帶間充 質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)體系尚有其不足之處：細(xì)胞在無血清培養(yǎng)體系中隨傳代 次數(shù)遞增容易出現(xiàn)分化，難以維持干 細(xì)胞的特性；隨傳代數(shù)次遞增擴(kuò)增效 率顯著下降。由于人血小板裂解液培養(yǎng)體系 維持干細(xì)胞特性的能力優(yōu)于無血清 培養(yǎng)體系，而無血清培養(yǎng)體系的細(xì)胞 增殖能力優(yōu)于人血小板裂解液。因此 實驗結(jié)合兩

21、者優(yōu)勢，加入人血小板裂 解液與無血清相結(jié)合的培養(yǎng)體系進(jìn)行對比，結(jié)果顯示，雖然人血小板裂 解液與無血清相結(jié)合的培養(yǎng)體系同 樣像無血清培養(yǎng)體系一樣，隨細(xì)胞傳 代次數(shù)遞增擴(kuò)增效率有所下降， 但增 殖能力顯著高于無血清培養(yǎng)體系， 且 在維持干細(xì)胞特性方面優(yōu)于人血小 板裂解液培養(yǎng)體系和無血清培養(yǎng)體 系。更重要的，采用2%人血小板裂 解液與無血清相結(jié)合的培養(yǎng)體系較10%人血小板裂解液培養(yǎng)體系能夠 很好地解決自體人血小板裂解液獲 取量有限的問題。后續(xù)實驗研究將采 用不同濃度人血小板裂解液和無血 清相結(jié)合的方式對人臍帶間充質(zhì)干 細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，對其干細(xì)胞特性的維 持和擴(kuò)增效率進(jìn)行進(jìn)一步評估， 從而 優(yōu)選最佳的人

22、血小板裂解液添加濃 度，并對這種培養(yǎng)體系傳代后細(xì)胞的 染色體及基因穩(wěn)定性進(jìn)行測定， 篩選 出既安全又適合大規(guī)模生產(chǎn)的臨床 級臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)體系。實驗設(shè)作計者，貢實獻(xiàn)驗：實孫施亞為如孫、亞張如炳、強(qiáng)王進(jìn)二行王炳樸福、強(qiáng)李斌，資、翠料許翠評，收集實，驗成為文孫評估亞為如為孫亞孫、張亞如、炳如強(qiáng)、張、張炳王炳強(qiáng)福，審斌校、資為許料孫收評，集亞為成如。文孫亞為孫如亞、如張、炳張強(qiáng)炳、章無相利關(guān)益利沖益突沖：突所。有作者共同認(rèn)可文輯章合同修意無相。改相關(guān)倫研倫后關(guān)理究文理利問章學(xué)用益題要沖遵人：突求體守臍，。組了帶文織國供的際章者的醫(yī)實對學(xué)驗撰實期方寫驗案刊與知符編情輯修改后文章遵守了國際醫(yī)學(xué)期刊

23、會編查輯重與學(xué)：術(shù)發(fā)文表研章的究出推實版薦驗前與規(guī)已范報經(jīng)過反 旨審專。家雙檢盲外測審系審：，統(tǒng)文符進(jìn)章行合經(jīng)本國刊3內(nèi)發(fā)次小稿查同宗重行。外任寫旨。的論論作文文者中中聲涉出明及現(xiàn)：的的通原不訊端始作圖行者片為對承、研擔(dān)究數(shù)責(zé)和據(jù)撰（包任。論文中涉及的原始圖片、數(shù)據(jù)（包 括任有計。關(guān)規(guī)算論機(jī)定文數(shù)保中據(jù)存涉、庫及分的）享原記始和錄銷圖及毀片樣、，本可已數(shù)接按據(jù)受照（包核查。全體作文者章授版權(quán)權(quán)人：簽文署章了出版版權(quán)前相雜關(guān)志協(xié)已與議。開放獲取聲明：這是一篇開放獲者取知文授章識權(quán)人共，簽享文許章署了出可版協(xié)版議權(quán)前雜相志關(guān)“協(xié)已署與議名全。-體根商據(jù)作業(yè)性用的同-相的基時同于允情方許原況式下任文共內(nèi)何，享允容用編許戶3.輯閱他0”人、讀條以調(diào)、款非整下，載和商在、業(yè)擴(kuò)合獻(xiàn)、入數(shù)，傳據(jù)并遞為或、其打之建它印任立、何索檢引索合法、，用超用級作途鏈軟接件 參考文獻(xiàn).2010;12:87-117.2016;25(8):957-972., , .2016;7(1):84-95.2 :a .2011;5(1):94-100.2016;11(5):702-705.2016;8(11):3:76-383.B, .2017;115:40-52. . .2017