免疫學(xué)實習(xí)指導(dǎo)

1、免疫學(xué)實習(xí)指導(dǎo)序 言本實習(xí)指導(dǎo)內(nèi)容的安排與免疫學(xué)理論課的內(nèi)容相銜接，主要包括免疫學(xué)的經(jīng)典實驗，即吞噬細胞吞噬功能檢測、補體結(jié)合試驗、T淋巴細胞轉(zhuǎn)化試驗、免疫標(biāo)記技術(shù)（膜表面免疫球蛋白的檢測、ELISA）、溶血空斑試驗、沉淀反應(yīng)。細胞凋亡的檢測為新增加的實驗。本指導(dǎo)旨在讓學(xué)生在有限的時間內(nèi)學(xué)到現(xiàn)代免疫學(xué)常用的實驗方法和技術(shù)，并使學(xué)生通過實驗課的學(xué)習(xí)進一步認(rèn)識和鞏固課堂所學(xué)的知識，同時培養(yǎng)學(xué)生的實際操作能力及分析問題、解決問題的科學(xué)思維能力。本指導(dǎo)適用于我校8年制、6年制、5年制的基礎(chǔ)、臨床、預(yù)防、口腔醫(yī)學(xué)及護理、藥學(xué)專業(yè)。不妥之處望指導(dǎo)教師和學(xué)生在使用過程中坦誠指出，并請認(rèn)真填寫本書后的意見反饋

2、表，以利進一步改進。實驗室規(guī)則一、 進入實習(xí)室做實驗要穿白大衣。二、 除實驗中必用的學(xué)習(xí)用品外，其他物品不要放在實驗臺上。書包放桌屜內(nèi)，衣帽掛衣架上。三、 實習(xí)室內(nèi)不允許吃食物或飲料，嚴(yán)禁吸煙。四、 實驗中一定要保持實習(xí)室安靜，彼此討論問題時不要大聲喧嘩、嚴(yán)禁打鬧。五、 實驗過程要按照教師要求進行操作，如有疑問要請教指導(dǎo)教師。六、 愛護實驗器材，如有損壞應(yīng)及時報告教師，需賠償者按規(guī)定辦理。七、 實驗完畢，要清理臺面。需沖洗的物品按要求沖洗，需收回的物品按要求擺放整齊送回教學(xué)準(zhǔn)備室。八、 值日生要做好值日，離開實習(xí)室時，一定要有專人負(fù)責(zé)關(guān)好門窗、水源及照明設(shè)備。目 錄實驗一、免疫器官（示教） （

3、1）實驗二、單向、雙向免疫瓊脂擴散和免疫電泳（示教） （4） 實驗三、吞噬細胞功能檢測 （10）實驗四、直接免疫熒光法檢測B淋巴細胞膜表面免疫球蛋白（12）實驗五、體外抗體形成細胞檢測液相小室法（PFC） （14）實驗六、T淋巴細胞轉(zhuǎn)化試驗（MTT法） （16） 實驗七、酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA） （18）實驗八、細胞凋亡檢測 （21）實驗九、補體介導(dǎo)的細胞毒試驗 （26）實驗十、E玫瑰花環(huán)形成試驗（示教） （28）意見反饋表 （30） 實驗一、免疫器官(Organs of the Immune System)免疫器官包括中樞免疫器官和外周免疫器官。在哺乳類動物，中樞免疫器官包括胸腺和骨髓

4、；在禽類，中樞免疫器官包括胸腺和法氏囊。外周免疫器官有淋巴結(jié)、脾臟等。（本實驗屬于示教內(nèi)容）胸腺（Thymus）胸腺位于胸腔縱隔上部，胸骨后方。人類胸腺在胚胎期及出生后2歲內(nèi)生長很快，體積較大；2歲后到青春期發(fā)育仍很快；但青春期后開始萎縮，逐漸由脂肪組織所代替，它在機體免疫功能的建立上占有重要地位。骨髓內(nèi)有部分淋巴細胞遷移到胸腺內(nèi)，在胸腺素的影響下，增殖分化成為具有免疫功能的T細胞，再經(jīng)血流輸送到淋巴結(jié)和脾等周圍免疫器官發(fā)揮免疫功能。若新生期切除胸腺或胸腺生長腫瘤，可導(dǎo)致細胞免疫功能顯著下降，常因感染而死亡。胸腺的組織結(jié)構(gòu)：胸腺分左右兩葉，表面覆蓋有一層結(jié)締組織被膜，被膜深入實質(zhì)將實質(zhì)分割成若

5、干小葉。胸腺小葉的外層為皮質(zhì)，內(nèi)層為髓質(zhì)。胸腺皮質(zhì)區(qū)分為淺皮質(zhì)區(qū)和深皮質(zhì)區(qū)。皮質(zhì)區(qū)內(nèi)85%-90%的細胞為未成熟的T細胞。髓質(zhì)區(qū)內(nèi)有大量的胸腺上皮細胞和稀疏分散的較成熟的胸腺細胞、單核-巨噬細胞和樹突狀細胞。標(biāo)本：胎兒胸腺、胸腺組織切片圖1.不同年齡期的胸腺示意圖骨髓(Bone marrow)骨髓位于骨髓腔中，分為紅骨髓和黃骨髓。紅骨髓有造血功能，由造血組織和血竇構(gòu)成。造血組織主要由基質(zhì)細胞和造血細胞組成。基質(zhì)細胞包括網(wǎng)狀細胞、成纖維細胞、血管內(nèi)皮細胞、巨噬細胞等。骨髓是各類血細胞和免疫細胞發(fā)生的場所。骨髓又是B細胞分化成熟的場所和體液免疫應(yīng)答發(fā)生的場所。因此骨髓既是中樞免疫器官又是外周免疫器

6、官。標(biāo)本：骨髓組織切片法氏囊（Bursa of Fabricius）在禽類，法氏囊是位于泄殖腔上方的一個囊狀物，內(nèi)充滿著淋巴組織，其中淋巴細胞不斷受囊素的影響，發(fā)育成B淋巴細胞。若新生期切除法氏囊，抗體的形成將受影響，而細胞免疫功能不受影響。對于B淋巴細胞發(fā)育而言，禽類的法氏囊具有哺乳類動物骨髓相似的作用。標(biāo)本：雞法氏囊淋巴結(jié)（Lymphoid node）淋巴結(jié)的實質(zhì)分為皮質(zhì)區(qū)和髓質(zhì)區(qū)兩部分。皮質(zhì)區(qū)分為淺皮質(zhì)區(qū)和深皮質(zhì)區(qū)兩部分。淺皮質(zhì)區(qū)靠近被膜下，是B細胞定居的場所，稱為非胸腺依賴區(qū)（thymus-independent area）。該區(qū)內(nèi)大量B細胞聚集形成淋巴濾泡，或稱淋巴小結(jié)。淺皮質(zhì)區(qū)與髓

7、質(zhì)之間的深皮質(zhì)區(qū)是副皮質(zhì)區(qū)，是T細胞定居的場所，稱為胸腺依賴區(qū)（thymus-dependent area）。髓質(zhì)區(qū)有髓索和髓竇組成，髓索由致密聚集的淋巴細胞組成，主要為B細胞和漿細胞。標(biāo)本：人淋巴結(jié)切片圖2.淋巴結(jié)脾（Spleen）脾實質(zhì)可分為白髓和紅髓。白髓為密集的淋巴組織，為T細胞區(qū)。白髓與紅髓交界的狹窄區(qū)域為邊緣區(qū)，內(nèi)含T細胞、B細胞和較多M。紅髓有髓索和髓竇組成。髓索為索條狀組織，主要含B細胞、漿細胞、M和DC.標(biāo)本：人脾組織切片圖3.脾臟實驗二、單向、雙向免疫瓊脂擴散和免疫電泳（Single Immunodiffusion and Double Immunodiffusion）可溶

8、性抗原與相應(yīng)抗體以合適的比例發(fā)生特異反應(yīng)時，在一定溫度和電解質(zhì)存在的條件下，經(jīng)過一定的時間，形成肉眼可見的沉淀物，稱為沉淀反應(yīng)。沉淀反應(yīng)的抗原可以是多糖、蛋白質(zhì)、脂類等。根據(jù)抗原與抗體的不同條件及其它因素，沉淀反應(yīng)可以分為以下三種主要形式。即：環(huán)狀沉淀反應(yīng)(ring precipitation reaction)，凝膠中沉淀反應(yīng)(precipitation reaction in gel)，如單向擴散、雙向擴散、對流電泳、免疫電泳以及微生物學(xué)實驗中的絮狀沉淀反應(yīng)(flocculation precipitation reaction)，如梅毒血清檢驗中的康氏（Kahn）及克萊氏（Kline）試

9、驗以及檢測白喉桿菌毒力的體外試驗-Elek氏試驗，檢測毒素或類毒素的絮狀沉淀單位測定等。本實驗主要介紹凝膠中的沉淀反應(yīng)。 （一） 單向免疫擴散(Single immunodiffusion)人群血清IgG正常值測定一、基本原理在含有特異抗體的瓊脂板中打孔，并在孔中加入定量的抗原，當(dāng)抗原向周圍擴散后與瓊脂中抗體相結(jié)合，即形成白色沉淀環(huán)，其直徑或面積與抗原濃度呈正相關(guān)。同時用標(biāo)準(zhǔn)抗原或國際參考蛋白制成標(biāo)準(zhǔn)曲線，即可用以定量檢測未知標(biāo)本的抗原濃度(mg/ml 或U/ml)。應(yīng)用這一實驗方法可檢測正常人群或患者血清中IgG、IgA 及IgM的水平。二、實驗材料2%離子瓊脂或生理鹽水瓊脂（采用0.9%的

10、生理鹽水, 內(nèi)含0.1% NaN3）。標(biāo)準(zhǔn)馬抗人IgG血清（抗體）（北京生物制品研究所生產(chǎn)）工作標(biāo)準(zhǔn)參考蛋白（北京生物制品研究所生產(chǎn)）PBS （pH7.2，0.01M）.打孔器（孔徑3mm）及打孔模板微量加樣器濕盒（容器內(nèi)加濕紗布或泡沫塑料）已制備好的含有1%馬抗人IgG抗體的瓊脂板稀釋的單人份待檢血清標(biāo)本（濃度分別為1/30、1/40和1/50）三、實驗方法（一）標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備：示教1按照玻片的大小，準(zhǔn)備制做瓊脂板所需要的1%離子瓊脂。首先分裝其1/2量的2%鹽水瓊脂，例如，用普通載玻片制做時需1%離子瓊脂4ml，在分裝2%鹽水瓊脂時即為2ml。溶化后置56°C60°C水

11、浴中平衡溫度備用。2稀釋抗體，用pH7.2的PBS稀釋標(biāo)準(zhǔn)抗人IgG抗體，終濃度為抗體效價的一倍。例如，血清效價為1/140，原濃血清即應(yīng)按1/70稀釋。并分裝試管，其分裝量應(yīng)與2%鹽水瓊脂量相等。3制備瓊脂板：將已稀釋的抗人IgG抗體于56°C水浴中預(yù)熱約半分鐘，再傾注于已溶化并維持56°C60°C的2%鹽水瓊脂管中，用拇指將管口堵緊。翻轉(zhuǎn)試管1-2次，將抗體與瓊脂混合均勻（注意：抗體與瓊脂混合時切勿產(chǎn)生氣泡），即刻傾注于玻片上，待凝固后即可。4打孔：將瓊脂板置于模板上，在同一直線上用打孔器打孔5個，孔距10mm。5稀釋不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)參考蛋白（工作標(biāo)準(zhǔn)）：應(yīng)根據(jù)

12、制品說明進行稀釋，例如：工作標(biāo)準(zhǔn)中免疫球蛋白含量，IgG為100單位/ml，80.4微克/單位，其稀釋范圍為1/10、1/20、1/40、1/80及1/160。6加樣：將已稀釋的不同濃度的工作標(biāo)準(zhǔn)蛋白依次用微量加樣器每孔加入10ul。（注意：每一稀釋度均應(yīng)更換塑料吸頭）。7將加樣的瓊脂板放濕盒中，置37°C溫箱，24小時后觀察結(jié)果。8用量角規(guī)測量并記錄沉淀環(huán)直徑，然后以沉淀環(huán)直徑為縱座標(biāo)，以標(biāo)準(zhǔn)參考蛋白量（單位/ml）為橫座標(biāo)，繪制成標(biāo)準(zhǔn)曲線。（二）人血清中IgG正常值的測定：1將已制備好的抗體瓊脂板置打孔模板上，每一瓊脂板可打孔4個（孔徑3mm，孔距10mm）。2將單位正常人血清用

13、PBS分別作1/50稀釋。3用微量加樣器分別取1/50稀釋的單人份血清標(biāo)本10µl加入孔中，每份標(biāo)本應(yīng)各加兩孔。2 作好標(biāo)記放濕盒中，置37°C溫箱，24小時后觀察結(jié)果。四、實驗結(jié)果測量各份標(biāo)本的沉淀環(huán)直徑并記錄結(jié)果，然后用標(biāo)準(zhǔn)曲線測出每份標(biāo)本所含IgG的量（U/ml，），并換算為mg/ml。統(tǒng)計全實驗室實驗結(jié)果并計算出均值，寫出較完整的實驗報單向免疫擴散示意圖五、注意事項1 在制做標(biāo)準(zhǔn)曲線時，為盡量減少誤差，至少應(yīng)做兩份以上標(biāo)準(zhǔn)板。2. 加樣時，吸取每份標(biāo)本均應(yīng)更換塑料吸頭。（二） 雙向免疫擴散 (Double immunodiffusion)抗原分析一、基本原理雙向免疫

14、擴散是指可溶性抗原與相應(yīng)抗體在瓊脂介質(zhì)中相互擴散,彼此相遇后形成一定類型的特異性沉淀線。沉淀線的特征與位置不僅取決于抗原抗體的特異性及相互間比例，而且與其分子大小及擴散速度相關(guān)。當(dāng)抗原、抗體存在多個系統(tǒng)時，可呈現(xiàn)多條沉淀線乃至交叉反應(yīng)。依據(jù)沉淀線的形態(tài)、條數(shù)、清晰度及位置可了解抗原或抗體的若干性質(zhì)，如濃度、特異性等。二、實驗材料1%瓊脂（生理鹽水配制）管，每管約4ml載玻片打孔器及打孔模板微量加樣器及塑料吸頭抗原：0.5µg/ml牛血清白蛋白（BSA）、0.5µg/ml人血清白蛋白（HSA）抗體：兔抗人血清白蛋白加兔抗牛血清白蛋白濕盒三、實驗方法1將已溶化的1%鹽水瓊脂管放

15、58°C -60°C水浴箱中平衡溫度備用。2將載玻片置于水平桌面上，傾注已溶化瓊脂3.5-4ml，使成厚度約1.5mm瓊脂板（注意：傾注速度不要過快，以免瓊脂溢出載玻片；傾注過程要連續(xù)以保證瓊脂板均勻、平滑）。3瓊脂凝固后，將打孔模板置于瓊脂板下，然后用打孔器打孔，根據(jù)不同需要可制成三角型、方陣型或梅花型。本次試驗采用三角型（如圖），即每三個孔組成一個三角型。（因本次實驗所制備的瓊脂板均以載玻片為底板，故根據(jù)其大小只能采用三角型且每一瓊脂板也只能打孔兩組。否則，如采用方陣型或梅花型則因瓊脂板邊緣瓊脂厚度不夠而使周邊各孔所加抗原或抗體量不足或溢出，而制成三角型三組，因各孔相距

16、過近，抗原、抗體相互滲透擴散將影響結(jié)果的判斷）。4如圖2所示，用微量加樣器加10µl抗體于各組一孔中，每組所余兩孔各按抗原1、2為一組，3、4為二組，5、6為三組，分別各加入10µl。注意每加一樣品均需更換吸頭，以防止交叉污染，影響實驗結(jié)果。5作好標(biāo)記，放濕盒中，置37°C溫箱，24小時后觀察結(jié)果。四、實驗結(jié)果1融合性沉淀孤，說明兩孔中抗原相同，為同一性反應(yīng)（圖2-1）。2兩沉淀線獨自形成并形成交叉，說明兩孔中的抗原完全不同，為非同一性反應(yīng)（圖2-2）。3. 融合性沉淀弧出現(xiàn)支線，或同時有另一條或兩條沉淀線，說明兩孔中抗原有相同成分又有不同成分，此為部分同一性反應(yīng)

17、（圖2-3）。雙向免疫擴散沉淀線（圖2）（三） 免疫電泳(Immunoelectrophoresis)-示教一、基本原理免疫電泳法是將凝膠電泳與雙向免疫擴散兩種技術(shù)相結(jié)合的一種實驗方法。在電場作用下標(biāo)本中各組分因電泳遷移率不同而分成區(qū)帶，然后沿電泳平行方向?qū)⒛z挖一溝槽，將抗體加入溝槽內(nèi)，使抗原與抗體相互擴散而形成沉淀線。根據(jù)沉淀線的數(shù)量、位置及形狀，分析標(biāo)本中所含各組分的性質(zhì)，本實驗常用于抗原分析及免疫性疾病的診斷。二、實驗材料1%離子瓊脂（pH8.6巴比妥緩沖液加入等量蒸餾水，再加入1%瓊脂。溶解后用脫脂棉過濾，分裝，實驗前加熱溶解置56-60水浴箱中平衡溫度備用）。免疫電泳用玻片待檢血清

18、人IgG(1mg/ml)抗人全血清抗體（購自北京中山公司）微量加樣器及塑料吸頭尖吸管及橡皮吸頭打孔器、解剖刀、尺、打孔模板、濕盒等。電泳儀：將pH8.6巴比妥緩沖液注入電泳槽內(nèi)（注意正負(fù)極各槽內(nèi)所加入的量應(yīng)在同一水平）。并將濾紙裁至適當(dāng)長度和寬度以備搭橋使用。三、實驗方法1將溶化的1%離子瓊脂傾注于玻片上制成瓊脂板。2瓊脂板冷卻凝固后，按照模板于挖槽線上下兩側(cè)各打一個孔，并分別用微量加樣器加入待檢血清及人IgG各15ul。3將瓊脂板置于電泳槽內(nèi)，注意電泳標(biāo)本應(yīng)放負(fù)極“”一側(cè)。并將已浸透緩沖液的濾紙一端覆蓋于瓊脂板兩側(cè)各約0.5cm,另一端浸于電泳液中。4接通電源，電壓、電流及電泳時間應(yīng)視儀器性

19、能而定。一般電勢梯度6 V/cm，電流每板20mA，泳動時間1-2小時。5電泳完畢，關(guān)閉電源，取出瓊脂板，按模板位置用解剖力挖橫槽。用特制尖吸管加入抗人全血清抗體。6將瓊脂板置于濕盒中，于37溫箱中擴散24小時。四、實驗結(jié)果根據(jù)沉淀弧的位置及形狀，參照免疫球蛋白遷移范圍示意圖，識別主要Ig。實驗三、吞噬細胞吞噬功能檢測（Assay of the Phagocytic Function of Phagocyte）一、基本原理吞噬細胞具有對異物(細菌、綿羊紅細胞、雞紅細胞等)吞噬和消化的功能，在機體固有免疫中發(fā)揮重要作用。小鼠腹腔內(nèi)注射硫代乙醇酸鈉，可刺激巨噬細胞的聚集。四日后小鼠腹腔內(nèi)注入羊紅細

20、胞懸液，一小時后解剖收集腹腔吞嗜細胞，染色、鏡檢可觀察對羊紅細胞的吞嗜現(xiàn)象。通過計算吞嗜百分比或吞噬指數(shù)可測定吞噬細胞的吞嗜功能。二、材料1. ICR品系小鼠（北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實驗動物中心提供）2. PBS緩沖液3. 3硫代乙醇酸鈉4.羊紅細胞（1懸液，北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實驗動物中心提供）5. 解剖器材、注射器、尖吸管、橡皮吸頭、小試管及載玻片、6. 瑞氏染液、甲醇三、實驗方法1. 實驗準(zhǔn)備：用無菌注射器吸取3硫代乙醇酸鈉3ml，注射于小鼠腹腔內(nèi)。2. 四日后，注射羊紅細胞（1懸液）1ml于小鼠腹腔內(nèi)。3. 注射1小時后，將小鼠用頸椎脫臼法處死，解剖暴露腹腔，于腹腔靠上部位，用鑷子輕輕夾起腹膜，將腹

21、膜剪一小口，用尖吸管注入5ml預(yù)溫的PBS，同時用手反復(fù)揉搓腹腔約12分鐘，以便盡可能多地沖洗出小鼠腹腔的吞噬細胞。4. 用尖吸管吸取腹腔液，置一潔凈試管內(nèi)。5. 用尖吸管將腹腔液吹打均勻(盡量避免產(chǎn)生氣泡)，吸取一滴滴于載玻片上，加蓋玻片鏡檢。6. 觀察結(jié)果，也可以將腹腔液涂片，平放于濕盤內(nèi)，37，孵育30分鐘。取出涂片，用預(yù)溫的PBS沖洗3次，然后用甲醇固定1分鐘，以瑞氏染液1份加pH6.4的PBS 2份混勻后，滴于涂片上染色5-10分鐘，以蒸餾水沖洗（切勿先將染液傾去）后，待干，鏡檢。四、實驗結(jié)果觀察小鼠腹腔巨噬細胞和中性粒細胞對羊紅細胞的吞噬現(xiàn)象，計算吞噬百分比，即每100個吞噬細胞中

22、吞噬有羊紅細胞的細胞數(shù)。也可用吞噬指數(shù)表示，即將100個吞噬細胞中所吞噬羊紅細胞的總數(shù)除以100。吞噬百分比和吞噬指數(shù)一般是平行的。五、注意事項（1） 充分揉搓腹腔，盡可能將吞噬細胞沖洗下來。（2） 用尖吸管吸取腹腔液時，盡量避開腹腔臟器，避免損傷血管引起出血，影響實驗結(jié)果。（3） 用瑞氏染液染色時，切勿先將染液傾去后再沖洗，以免染液中細小顆粒附著于玻片上影響標(biāo)本的清晰度。實驗四、 直接免疫熒光法鑒別B淋巴細胞膜表面免疫球蛋白（SmIg） (Direct Immumofluorescent Assay of B-lymphocyte Surface Membrane Immunoglobuli

23、n) 一、實驗原理SmIg是B細胞的抗原識別受體，也是B細胞特異的表面標(biāo)志，用直接免疫熒光法可檢查出SmIg鑒定B淋巴細胞。用熒光素標(biāo)記的抗Ig抗體，在一定條件下與淋巴細胞混合，熒光素標(biāo)記的抗Ig抗體可以與B細胞表面的Ig結(jié)合，在熒光顯微鏡下觀察可見B細胞膜上出現(xiàn)熒光。二、實驗材料1. ICR小鼠（北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實驗動物中心提供）2. 異硫氰酸熒光素（FITC）標(biāo)記的兔抗小鼠Ig抗體（購自BD公司）3. Hank's液：pH7.4(內(nèi)含0.1%NaN3)4. 臺式離心機5. 離心管、吸管、移液管等三、實驗方法1采用頸椎脫臼法處死小鼠，解剖取出脾臟放入盛有6ml Hank's液的

24、平皿中，用100目鋼網(wǎng)研磨，混勻。從中吸取1ml細胞懸液放入一試管中，加滿Hank's液，離心1000rpm，10分鐘，洗滌細胞一遍。傾去上清，沉積的細胞恢復(fù)1ml容積，即為約1×107/ml的細胞懸液。另取一支試管，吸取1×107/ml的細胞懸液0.4ml加Hank's液3.6ml，即為1×106/ml的細胞懸液。2取2ml離心管兩只，各加入1×106/ml的細胞懸液1ml，用臺式離心機離心2000rpm，3分鐘，棄去上清液。一支加入熒光素標(biāo)記的兔抗鼠Ig抗體100l，另一支不加抗體作對照，置4冰箱30分鐘。3取出離心管，用Hank&#

25、39;s液洗滌細胞兩次，以去除游離的抗體，最后一次離心后棄去上清液，留少許回流液，混勻，滴片，用熒光顯微鏡觀察。四、實驗結(jié)果熒光顯微鏡觀察，落射激發(fā)光下SmIg陽性細胞可見環(huán)狀或斑點狀熒光。用鎢絲燈光源透射光照明計數(shù)同一視野內(nèi)淋巴細胞總數(shù)，共計數(shù)200300個淋巴細胞，算出其中SmIg陽性細胞的百分?jǐn)?shù)。五、注意事項 在滴片前要徹底去除游離的抗體，以避免假陽性結(jié)果。圖1 B淋巴細胞膜表面免疫球蛋白分子模式圖實驗五、 體外抗體形成細胞檢測液相小室法(In vivtro detection of antibody forming cellsTest of Plague Forming Cell)一、

26、基本原理 溶血空斑試驗，又稱空斑形成細胞（Plague Forming Cell, PFC）試驗，是一種體外檢測抗體形成細胞的方法。將一定量洗滌過的綿羊紅細胞注射入小鼠腹腔，四天后將小鼠殺死，取脾臟制成脾細胞懸液，內(nèi)含抗體形成細胞。然后將脾細胞、綿羊紅細胞，補體混合孵育。由于PFC所分泌的抗體和綿羊紅血球結(jié)合形成抗原抗體復(fù)合物，在補體作用下可使紅細胞溶解，于特制的小室內(nèi)形成肉眼可見的溶血空斑。一個空斑即代表一個抗體形成細胞。二、實驗材料1. 解剖器械、試管、1ml吸量管2. 載玻片、石蠟盤、酒精燈、微量加樣器3. ICR小鼠（北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實驗動物中心提供）4. 5和10綿羊紅血球（SRBC）

27、5. 補體(豚鼠血清，經(jīng)SRBC吸收，臨用時稀釋成合適濃度)三、實驗方法1. 小鼠免疫及脾細胞懸液的制備：將5SRBC (0.4ml)注射于小鼠腹腔，4天后拉脫頸椎處死，取出脾臟放在已加入6ml Hank's液的平皿中。在100目不銹鋼網(wǎng)上研磨，過濾混勻，從中吸取lml加入試管中，加滿Hank's液混勻，離心1000rpm，10分鐘。將沉淀的脾細胞恢復(fù)lml容積，即為約107ml濃度的細胞懸液。2制作小室： 取無脂載玻片（75mm×25mm）, 平置桌面上。用雙面膠帶在載玻片兩端和中間各粘一條，然后再覆蓋上同樣的載玻片，即形成兩個小室。將此雙層玻片的一側(cè)長邊浸入融化的

28、石臘池中以封閉小室的一邊（無需浸入過深，以能封閉小室邊緣為準(zhǔn)）。2. 小室灌注細胞懸液：取107ml脾細胞懸液100ml 10SRBC 200ml 補體 200ml Hank's液 1m1 混勻后，用尖吸管灌注小室、蠟封、標(biāo)記、平放于玻片盤內(nèi)，置37孵箱3045分鐘。四、實驗結(jié)果觀察小室內(nèi)的透明空斑，一個空斑即代表一個空斑形成細胞（PFC），即B細胞。五、注意事項（1） 小室注入液體時不要留有氣泡。（2） 小室邊緣需用石蠟封嚴(yán)。（3） 37孵箱孵育時，必須放平，不可傾斜。（4） 觀察結(jié)果時，應(yīng)注意辨別空斑與氣泡的區(qū)別，避免將氣泡誤認(rèn)為溶血空斑。實驗六、 T淋巴細胞轉(zhuǎn)化試驗（T Lymp

29、hocyte Transformation Test）一、 基本原理 T細胞在體外培養(yǎng)時，受到有絲分裂原（如PHA、ConA）刺激后，可出現(xiàn)細胞體積增大，代謝旺盛，蛋白和核酸合成增加,即向淋巴母細胞轉(zhuǎn)化和增殖。淋巴細胞轉(zhuǎn)化率的高低可以反映機體的細胞免疫水平，因此可作為測定機體免疫功能的指標(biāo)之一。淋巴細胞轉(zhuǎn)化試驗結(jié)果的讀取可以有形態(tài)計數(shù)法、MTT法和同位素法三種。 MTT法即四甲基偶氮唑鹽微量酶反應(yīng)比色法。MTT是一種噻唑鹽，化學(xué)名3-（4，5-二甲基-2-噻唑）-2，5-二苯基溴化四唑，水溶液為黃橙色。小鼠脾細胞受到ConA作用后發(fā)生增殖活化，其胞內(nèi)線粒體琥珀酸脫氫酶活性相應(yīng)升高，MTT作為其

30、底物參與反應(yīng)，形成藍色的甲臜（Formazan）顆粒沉積于細胞內(nèi)或細胞周圍，經(jīng)鹽酸異丙醇溶解后為藍色溶液，可用酶標(biāo)測定儀測定細胞培養(yǎng)物的OD值，測定波長570nm。根據(jù)OD值的大小計算反應(yīng)體系中細胞增殖程度。 3H-TdR 摻入法：細胞增殖的基本條件或前提為細胞質(zhì)和細胞核的復(fù)制，這是正常細胞增殖過程缺一不可的前提。一般來說，一個細胞周期可大致分為四期，即G1期、S期、G2期和M期。其中S期為DNA合成期，主要功能活動為DNA合成。3H-TdR即（甲基-3H）胸腺嘧啶核苷（3H-methylthymidine），是DNA合成的前體。加入細胞培養(yǎng)液中后被細胞攝取作為DNA合成的原料。細胞合成的DN

31、A越多，則所摻入的3H-TdR就越多，因此，檢測所摻入的3H-TdR就可反映細胞增殖的程度。該方法與MTT比較，具有靈敏度高、準(zhǔn)確性好的特點，但由于該方法有同位素污染問題，因此，從安全角度考慮，我們實習(xí)中仍用MTT法。二、 實驗材料1. ICR小鼠（北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實驗動物中心提供）2. RPMI1640培養(yǎng)液, Hank's液3. 刀豆蛋白A（Concanvalin A, ConA），用RPMI1640液配成1mg/ml，分裝小瓶，冷凍保存4. MTT (1mg/ml, 溶于Ph7.2的PBS中)5. 2.5%碘酒、75%酒精6. 無菌尖吸管和刻度吸量管7. 無菌解剖器械8. 96孔平

32、底培養(yǎng)板9. 5%CO2培養(yǎng)箱（美國NAPCO公司產(chǎn)品）10. 酶標(biāo)測定儀 （美國BioRad公司產(chǎn)品）三、 實驗方法1. 小鼠脾細胞懸液的制備：取一個滅菌的平皿，加入5ml Hank's液。頸椎脫臼法處死小鼠，取脾臟，放入平皿中，在鋼網(wǎng)上研磨并過篩，制成細胞懸液。取出100ml用于計數(shù)。將其余細胞懸液移入一離心管中，離心1500rpm，7min，（或1000rpm，10min）棄去上清，用RPMI1640培養(yǎng)液稀釋，制成2.5×106 / ml的脾細胞懸液，然后加入ConA使每孔最終濃度為2mg/ml，同時做不加ConA的陰性對照孔。2. 將上述細胞懸液加入96孔平底培養(yǎng)板

33、中，每孔0.1ml。3. 將培養(yǎng)板放入含有5%CO2的37培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48-72小時，在培養(yǎng)結(jié)束前4-6小時，于培養(yǎng)板各孔內(nèi)加入1mg/ml MTT液，10ml/孔。370C培養(yǎng)6小時。4. 各孔內(nèi)加入0.01M鹽酸異丙醇110ml，30分鐘內(nèi)（或加2%SDS 100ul/孔，過夜）用酶標(biāo)測定儀測OD值，測定波長570nm。四、 實驗結(jié)果將實驗組和對照組三個復(fù)孔的OD值平均。轉(zhuǎn)化值=實驗組的平均OD值-對照組的平均OD值。五、注意事項（1）由于本實驗需要培養(yǎng)3天，才能觀察結(jié)果。因此，在操作時應(yīng)注意無菌操作，避免細菌污染，導(dǎo)致實驗的失敗。（2）細胞操作要輕柔、迅速，以免細胞損傷影響實驗結(jié)果。圖1

34、 淋巴細胞母轉(zhuǎn)化過程示意圖實驗七、 酶聯(lián)免疫吸附試驗（Enzyme-Linked Immunoabsorbent Assay, ELISA）一、實驗原理：利用標(biāo)記技術(shù)將酶標(biāo)記到抗體（抗原）上，使待檢物中相應(yīng)的抗原（抗體）與酶標(biāo)記抗體（抗原）發(fā)生特異性反應(yīng)。在遇到相應(yīng)的酶底物時，酶能高效、專一催化、分解底物，生成有顏色的產(chǎn)物。根據(jù)顏色的深、淺、可以判斷待檢物中有無特異的抗原（抗體）以及量的大小。該方法可對待檢樣品進行定性和定量分析；同時具有微量、特異、高效、經(jīng)濟、簡便等優(yōu)點，因此是一種廣泛應(yīng)用于生物和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的微量測定技術(shù)。目前使用的酶聯(lián)免疫檢測方法很多，其種類按檢測目的可分為：間接法用于測定抗

35、體雙抗體夾心法主要用于測定大分子抗原競爭抑制法主要用于測定小分子抗原本實驗以血清IgE的檢測為例學(xué)習(xí)雙抗體夾心法。ELISA的原理圖血清lgE的檢測二、實驗材料酶標(biāo)板（聚苯乙烯微量板）馬抗人IgE抗體IgG（購自北京中山公司）辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的馬抗人IgE抗體IgG待檢血清包被緩沖液： 0.05mol/L碳酸鈉-碳酸氫鈉洗滌液(pH9.6)封閉液：1%BSA溶液反應(yīng)終止液：5N H2SO4三、實驗方法包被酶標(biāo)反應(yīng)板：加1:500馬抗人IgE抗體（IgG），0.2ml/孔 37 孵育2小時后洗滌3次，1分鐘/次 封閉：加入1%BSA ，0.3ml/孔，4過夜 取出，洗滌同上 待檢血清

36、：加入不同稀釋度的待撿血清，0.1ml/孔37孵育40min后，洗滌同上酶標(biāo)記抗體：加入適當(dāng)稀釋度的酶標(biāo)抗體，0.1ml/孔 37孵育40min后， 洗滌同上底物：加入OPD（鄰苯二胺）溶液，0.15ml/孔室溫30分鐘終止液：加入5N H2SO4 ，0.1ml/孔 于20min內(nèi)，用酶標(biāo)儀測定各孔OD值，測定波長495nm五、 實驗結(jié)果用待測標(biāo)本孔的吸收值與一組陰性標(biāo)本測定孔平均吸收值的比值（P/N）表示，當(dāng)P/N大于某一數(shù)值時（如2.1）判斷為陽性，數(shù)值的大小依具體檢測要求而定。五、注意事項1實驗時應(yīng)分別設(shè)陽性對照與陰性對照孔，每一待檢樣品應(yīng)平行作兩份，以保證實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性。2實驗時，用

37、羊血清、兔血清或BSA封閉以防止非特異性反應(yīng)的發(fā)生。實驗八、 細胞凋亡檢測(Annexin-V-FITC 單染法)(Assay of Cell Apoptosis)一、實驗原理細胞凋亡或稱程序性細胞死亡（Programmed Cell Death）是細胞的生命現(xiàn)象之一，它在機體的胚胎發(fā)育、組織修復(fù)及自身反應(yīng)性T淋巴細胞的清除等方面起著十分重要的作用。細胞凋亡調(diào)節(jié)的失控可導(dǎo)致臨床各種疾病的發(fā)生。如老年性癡呆與神經(jīng)細胞凋亡過度有關(guān)，自身免疫性疾病和腫瘤與細胞凋亡的抑制有關(guān)。細胞凋亡有別于細胞壞死，它有一系列的細胞形態(tài)學(xué)和生物化學(xué)的改變，包括出現(xiàn)染色質(zhì)濃縮、DNA降解、凋亡小體形成等。在正常的活細胞

38、，磷脂酰絲氨酸（phosphotidylserine， PS）位于細胞膜的內(nèi)側(cè)，但在凋亡的細胞，PS 從細胞膜的內(nèi)側(cè)翻轉(zhuǎn)到細胞膜的表面，暴露在細胞外環(huán)境中。Annexin-（膜聯(lián)蛋白-V）是一種分子量為35-36KD的Ca2+ 依賴性磷脂結(jié)合蛋白，能與PS高親和力結(jié)合。因此將Annexin-進行熒光素（如FITC、PE）或生物素（Biotin）標(biāo)記，以標(biāo)記了的Annexin-作為探針，利用流式細胞儀或熒光顯微鏡可檢測細胞凋亡的發(fā)生。二、實驗儀器和材料Annexin V-FITC（膜聯(lián)蛋白-V-FITC）20g/ml 標(biāo)記緩沖液（Binding Buffe）20 mlPBS（1×）30

39、 ml 量程分別為20l , 200l 和1000l的移液器及吸頭微量離心管可調(diào)速離心機載玻片（用于熒光顯微鏡觀察），蓋玻片（用于熒光顯微鏡觀察）去離子水，冰塊流式細胞儀或熒光顯微鏡三、實驗方法1凋亡細胞的制備：小鼠腹腔注射地塞米松25mg/kg體重，10h后解剖取胸腺，分離胸腺細胞。用PBS洗兩遍，調(diào)整待測細胞的濃度為2 ×106/ml，備用。2 200l細胞懸液加入1ml冷PBS，輕輕震蕩使細胞懸浮，1000rpm 4離心10分鐘，棄上清。3 重復(fù)步驟2兩次。4 將細胞重懸于200l 標(biāo)記緩沖液。5 加入10l Annexin V-FITC，輕輕混勻，避光室溫反應(yīng)15分鐘或4反應(yīng)

40、30分鐘。6 加入300l標(biāo)記緩沖液，立即上機（流式細胞儀）或熒光顯微鏡觀察檢測。四、 實驗結(jié)果用熒光顯微鏡觀察，凋亡細胞細胞膜上可見黃綠色光環(huán)。PS轉(zhuǎn)移到細胞膜外不是調(diào)亡所特有的，也可發(fā)生在細胞壞死中。以FITC標(biāo)記的Annexin V, 可以同時結(jié)合使用PI(碘化丙啶)拒染法，用流式細胞儀分析可檢測凋亡細胞的百分率。五、注意事項1整個操作過程動作要盡量輕柔，切勿用力吹打細胞，盡量在4下操作。3反應(yīng)完畢后要盡快檢測，因為細胞凋亡是一個動態(tài)的過程，反應(yīng)一小時后熒光強度就開始衰變。4 Annexin V-FITC是光敏物質(zhì)，在操作時要注意避光。圖1 細胞凋亡過程中磷脂酰絲氨酸（PS）外翻示意圖

41、圖2 凋亡細胞的Annexin V染色 凋亡細胞周圍可見綠色熒光。附：凋亡的其它檢測方法一、細胞凋亡的形態(tài)學(xué)檢測 根據(jù)凋亡細胞固有的形態(tài)特征，人們已經(jīng)設(shè)計了許多不同的細胞凋亡形態(tài)學(xué)檢測方法。1 光學(xué)顯微鏡和倒置顯微鏡（1） 未染色細胞：凋亡細胞的體積變小、變形，細胞膜完整但出現(xiàn)發(fā)泡現(xiàn)象，細胞凋亡晚期可見凋亡小體。貼壁細胞出現(xiàn)皺縮、變圓、脫落。（2） 染色細胞：常用姬姆薩染色、瑞氏染色等。凋亡細胞的染色質(zhì)濃縮、邊緣化，核膜裂解、染色質(zhì)分割成塊狀和凋亡小體等典型的凋亡形態(tài)。2 熒光顯微鏡和共聚焦激光掃描顯微鏡一般以細胞核染色質(zhì)的形態(tài)學(xué)改變?yōu)橹笜?biāo)來評判細胞凋亡的進展情況。常用的DNA特異性染料有：H

42、O 33342 (Hoechst 33342)，HO 33258 (Hoechst 33258), DAPI。三種染料與DNA的結(jié)合是非嵌入式的，主要結(jié)合在DNA的A-T堿基區(qū)。紫外光激發(fā)時發(fā)射明亮的藍色熒光。Hoechst是與DNA特異結(jié)合的活性染料，儲存液用蒸餾水配成1mg/ml的濃度，使用時用PBS稀釋成終濃度為25mg/ml。DAPI為半通透性，用于常規(guī)固定細胞的染色。儲存液用蒸餾水配成1mg/ml的濃度，使用終濃度一般為0.5 1mg/ml。結(jié)果評判：細胞凋亡過程中細胞核染色質(zhì)的形態(tài)學(xué)改變分為三期：期的細胞核呈波紋狀（rippled）或呈折縫樣（creased），部分染色質(zhì)出現(xiàn)濃縮狀

43、態(tài)；a期細胞核的染色質(zhì)高度凝聚、邊緣化；b期的細胞核裂解為碎塊，產(chǎn)生凋亡小體。 3 透射電子顯微鏡觀察結(jié)果評判：凋亡細胞體積變小，細胞質(zhì)濃縮。凋亡期（pro-apoptosis nuclei）的細胞核內(nèi)染色質(zhì)高度盤繞，出現(xiàn)許多稱為氣穴現(xiàn)象（cavitations）的空泡結(jié)構(gòu)(圖2)；a期細胞核的染色質(zhì)高度凝聚、邊緣化；細胞凋亡的晚期，細胞核裂解為碎塊，產(chǎn)生凋亡小體。二、線粒體膜勢能的檢測 線粒體在細胞凋亡的過程中起著樞紐作用，多種細胞凋亡刺激因子均可誘導(dǎo)不同的細胞發(fā)生凋亡，而線粒體跨膜電位的下降，被認(rèn)為是細胞凋亡級聯(lián)反應(yīng)過程中最早發(fā)生的事件，它發(fā)生在細胞核凋亡特征（染色質(zhì)濃縮、DNA斷裂）出現(xiàn)

44、之前，一旦線粒體DYmt崩潰，則細胞凋亡不可逆轉(zhuǎn)。線粒體跨膜電位的存在，使一些親脂性陽離子熒光染料如Rhodamine 123、3,3-Dihexyloxacarbocyanine iodideDiOC6（3）、Tetrechloro- tetraethylbenzimidazol carbocyanine iodideJC-1、Tetramethyl rhodamine methyl ester(TMRM)等可結(jié)合到線粒體基質(zhì)，其熒光的增強或減弱說明線粒體內(nèi)膜電負(fù)性的增高或降低。方法：將正常培養(yǎng)的細胞和誘導(dǎo)凋亡的細胞加入使用終濃度為Rhodamine 123（1mM）或終濃度為DiOC6（2

45、5nM），JC-1（1mM），TMRM（100nM），37°C平衡30min，流式細胞計檢測細胞的熒光強度。三、DNA片斷化檢測 細胞凋亡時主要的生化特征是其染色質(zhì)發(fā)生濃縮, 染色質(zhì)DNA在核小體單位之間的連接處斷裂, 形成50300kbp長的DNA大片段, 或180200bp整數(shù)倍的寡核苷酸片段, 在凝膠電泳上表現(xiàn)為梯形電泳圖譜(DNA ladder)。細胞經(jīng)處理后，采用常規(guī)方法分離提純DNA，進行瓊脂糖凝膠和溴化乙啶染色，在凋亡細胞群中可觀察到典型的DNA ladder。如果細胞量很少，還可在分離提純DNA后，用32P-ATP和脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶（TdT）使DNA標(biāo)記，然后

46、進行電泳和放射自顯影，觀察凋亡細胞中DNA ladder的形成。1. 大分子染色體DNA片段的測定細胞凋亡的早期,染色體斷裂成為50300kbp長的DNA大片段。所有超過一定分子量大小的雙鏈DNA分子在瓊脂糖凝膠中的遷移速度相同。線性DNA的雙螺旋半徑超過凝膠半徑時，即達到分辨力的極限。此時凝膠不再按分子量的大小來篩分DNA，DNA像通過彎管一樣，以其一端指向電場一極而通過凝膠，這種遷移模式稱之為"爬行"。因此，細胞凋亡早期產(chǎn)生的50300kbp長的DNA大片段不能用普通的瓊脂糖凝膠電泳來分離。通常采用脈沖電泳技術(shù)可圓滿地解決這一問題。這個方法是在凝膠上外加正交的交變脈沖電

47、場。每當(dāng)電場方向改變后，大的DNA分子便滯流在爬行管中，直至新的電場軸向重新定向后，才能繼續(xù)向前移動。DNA分子量越大，這種重排所需要的時間就越長。當(dāng)DNA分子變換方向的時間小于電脈沖周期時，DNA就可以按其分子量大小分開。2 DNA Ladder 測定方法：收獲細胞（1X107）沉淀?細胞裂解液13000rpm5min, 收集上清1%SDS和RnaseA（5mg/ml）56°C，2h。蛋白酶K（2.5mg/ml）37°C，2h，1/10體積3M醋酸鈉和2.5倍體積的冷無水乙醇沉淀DNA，4°C過夜。14000rpm15min最后將沉淀溶解在TE buffer中，

48、加DNA Loading Buffer 1.2%瓊脂糖凝膠電泳，EB染色并照相。3 凋亡細胞DNA含量的流式細胞計分析方法：收集細胞，70%冷乙醇（in PBS）4°C固定過夜，PBS洗滌，1000rpm10min RNase A（0.5mg/ml）37°C消化30min PI（50mg/ml）染色，室溫避光15min，F(xiàn)ACScan分析DNA亞二倍體的形成及細胞周期的變化。4. ApoAlertTM LM-PCR Ladder Assay (CLONTECH)優(yōu)點：敏感度高，適合于檢測少量樣本，小部分凋亡細胞。如臨床活組織檢測。四、TUNEL法 細胞凋亡中, 染色體DNA

49、雙鏈斷裂或單鏈斷裂而產(chǎn)生大量的粘性3'-OH末端，可在脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶（TdT）的作用下，將脫氧核糖核苷酸和熒光素、過氧化物酶、堿性磷酸酶或生物素形成的衍生物標(biāo)記到DNA的3'-末端，從而可進行凋亡細胞的檢測，這類方法稱為脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記法（terminal -deoxynucleotidyl transferase mediated nick end labeling, TUNEL）。由于正常的或正在增殖的細胞幾乎沒有DNA的斷裂，因而沒有3'-OH形成，很少能夠被染色。TUNEL實際上是分子生物學(xué)與形態(tài)學(xué)相結(jié)合的研究方法，對完整的單

50、個凋亡細胞核或凋亡小體進行原位染色，能準(zhǔn)確地反應(yīng)細胞凋亡典型的生物化學(xué)和形態(tài)特征，可用于石蠟包埋組織切片、冰凍組織切片、培養(yǎng)的細胞和從組織中分離的細胞的細胞形態(tài)測定，并可檢測出極少量的凋亡細胞，因而在細胞凋亡的研究中被廣泛采用。五、Caspase-3活性的檢測 Caspase家族在介導(dǎo)細胞凋亡的過程中起著非常重要的作用，其中caspase-3為關(guān)鍵的執(zhí)行分子，它在凋亡信號傳導(dǎo)的許多途徑中發(fā)揮功能。Caspase-3正常以酶原（32KD）的形式存在于胞漿中，在凋亡的早期階段，它被激活，活化的Caspase-3由兩個大亞基（17KD）和兩個小亞基（12KD）組成，裂解相應(yīng)的胞漿胞核底物，最終導(dǎo)致細

51、胞凋亡。但在細胞凋亡的晚期和死亡細胞，caspase-3的活性明顯下降。1 Western blot 分析Procaspase-3的活化，以及活化的Caspase-3及對底物多聚（ADP-核糖）聚合酶poly（ADP-ribose）polymerase，PARP等的裂解。方法：收集細胞PBS洗滌抽提細胞裂解液蛋白定量SDS-PAGE電泳硝酸纖維素膜或PVDF膜轉(zhuǎn)移5%脫脂奶粉封閉，室溫1.52h或4°C過夜Caspase-3多抗或單抗室溫反應(yīng)12h或4°C過夜TBS-T（含0.05% Tween 20的TBS）洗3次，510min/次HRP-標(biāo)記的羊抗鼠IgG或AP標(biāo)記的羊

52、抗鼠IgG室溫反應(yīng)12h TBS-T洗3次， 510min/次ECL顯影或NBT/BCIP顯色。2 熒光分光光度計分析原理：活化的Caspase-3能夠特異切割D1E2V3D4-X底物，水解D4-X肽鍵。根據(jù)這一特點，設(shè)計出熒光物質(zhì)偶聯(lián)的短肽Ac-DEVD-AMC。在共價偶聯(lián)時，AMC不能被激發(fā)熒光，短肽被水解后釋放出AMC，自由的AMC才能被激發(fā)發(fā)射熒光。根據(jù)釋放的AMC熒光強度的大小，可以測定caspase-3的活性，從而反映Caspase-3被活化的程度。方法：收獲細胞正常或凋亡細胞，PBS洗滌，制備細胞裂解液加Ac-DEVD-AMC（caspase-3四肽熒光底物），37°C

53、反應(yīng)1h，熒光分光光度計（Polarstar）分析熒光強度（激發(fā)光波長380nm，發(fā)射光波長為430-460nm）。3 流式細胞術(shù)分析方法：收獲細胞正常或凋亡細胞，PBS洗滌，加Ac-DEVD-AMC 37°C反應(yīng)1h UV流式細胞計分析caspase-3陽性細胞數(shù)和平均熒光強度。六、Annexin V和PI雙染法在本實驗中，已經(jīng)介紹了將熒光素標(biāo)記的Annexin-V作為熒光探針，利用流式細胞儀或熒光顯微鏡可檢測細胞凋亡的發(fā)生。碘化丙啶(propidine iodide, PI)是一種核酸染料，它不能透過完整的細胞膜，但在凋亡中晚期的細胞和死細胞，PI能夠透過細胞膜而使細胞核紅染。因

54、此將Annexin-V與PI匹配使用，就可以將凋亡早晚期的細胞以及死細胞區(qū)分開來。由于凋亡是二十世紀(jì)細胞生物學(xué)的重要發(fā)現(xiàn)，其在醫(yī)學(xué)生物學(xué)中具有非常重要的意義，因此檢測細胞凋亡的方法也在不斷地更新和發(fā)展中，除了我們以上介紹的方法，還有很多的新的凋亡檢測手段，如凋亡相關(guān)蛋白TFAR19蛋白的表達和細胞定位分析等，同學(xué)們?nèi)绻信d趣可以參考有關(guān)的書籍和資料。實驗九、 補體介導(dǎo)的細胞毒試驗（Complement Mediated Cytotoxicity Test）一、實驗原理 帶有特異抗原的靶細胞（如正常細胞、腫瘤細胞、病毒感染細胞）與相應(yīng)抗體結(jié)合后，在補體的參與下，引起靶細胞膜損傷，導(dǎo)致細胞膜的通透性增加、細胞死亡。染料（例如：伊紅-Y、臺盼藍）可通過細胞膜進入細胞內(nèi)使細胞著色，故可用于指示死細胞或瀕死細胞，而活細胞不著色。此即補體依賴性細胞毒試驗，利用細胞毒試驗可以檢查細胞膜抗原，亦可鑒定抗體的特異性。本實驗中，Thy-1抗原是小鼠胸腺T細胞特異的表面抗原，在體外利用抗小鼠Thy-1的單克隆抗體通過補體的協(xié)同作用，可殺傷95以上的胸腺細胞。二、實驗材料1. 解剖器械(眼科剪、眼科鑷)、平皿、80100目不銹鋼網(wǎng)2. 試管、lml吸量管、尖吸管3.