-淀粉酶的提取要點說課材料

1、知識是人類進步的階梯也-淀粉酶的提取、別離及測定生化試驗小組-2005.4試驗全程安排:第一天樣品的粗處理及粗別離,包括：1樣品處理2離子交換色譜別離3紫外檢測紫外測定蛋白,繪出色譜圖4收集樣品第二天對各峰收集樣品進行分析,包括：1精確測定蛋白含量Folin-酚2測定酶活3比活U算第三天對活性峰及原液進行分析及鑒定,包括：1SD& PAG盼析分子量分析2純化倍數(shù)計算等試驗一、色譜別離淀粉酶1.1試劑及設備 離子交換樹脂 -20 C冰箱樣品管5-10ml試管1.5ml離心管紫外分光光度計a-淀粉酶樣品秒表膠頭吸管進樣用平衡緩沖液pH8.0 , 0.01M磷酸鹽緩沖液洗脫緩沖液平衡緩沖液 +0.1

2、M , 0.3M , 0.5M , 1.0M的氯化鈉 試劑瓶1.2離子交換色譜原理與方法色譜chromatography是一種別離的技術,隨著現(xiàn)代化學技術的開展應運而生。20世紀初在俄國的波蘭植物化學家茨維特Twseet首先將植物提取物放入裝有碳酸鈣的玻璃管中,植物提取液由于在碳酸鈣中的流速不同分布不同因此在玻璃管中呈現(xiàn)出不同的顏色,這樣就可以對各種不同的植物提取液進行有效的成分別離。到1907年茨維特的論文用俄文公開發(fā)表,他把這種方法命名為chromatography,即中文的色譜,這就是現(xiàn)代色譜這一名詞的來源。但由于茨維特當時沒有知名度,而且能看懂俄文的人也不多,加之很快爆發(fā)了第一次世界大

3、戰(zhàn),茨維特的別離方法一直被束之高閣。20世紀20年代,許多植物化學家開始采用色譜方法對植物提取物進行別離,色譜方法才被廣泛地應用。自20世紀40年代以來以Martin為首的化學家建立了一整套色譜的根底理論使色譜分析方法從傳統(tǒng)的經驗方法總結歸納為一種理 論方法,馬丁等人還建立了氣相色譜儀器使色譜技術從別離方法轉化為分析方法。20世紀50年代以后由于戰(zhàn)后重建和經濟開展的需要,化學工業(yè)特別是石油化工得到廣泛的開展, 亟需建立快速方便有效的石化成分分析。而石化成分十分復雜, 結構十分相似,且多數(shù)成分熔點又比擬低,氣相色譜正好吻合石化成分分析的要求,效果十清楚顯、有效。同樣,石化 工業(yè)的開展也使色譜技術

4、特別是氣相色譜得到廣泛的應用。氣相色譜的儀器也不斷得到改良和完善,氣相色譜逐漸成為一種工業(yè)分析必不可少的手段和工具。20世紀80年代以后我國也大規(guī)模采用氣相色譜和高效液相色譜。隨著環(huán)境科學的開展,不僅需要對大量有機物質進行別離和檢測,而且也要求對大量無機離子進行別離和分析。 1975年美國Dow化學公司的H.Small等人首先提出了離子交換別離抑制電導檢測分析思維 即提出了離子色譜這一概念離子。色譜概念一經提出便立即被商品化產業(yè)化由Dow公司組建的Dionex公司最早生產離子色譜并申請了專利。我國從 20世紀80年代開始引進離子色譜儀 器,在我國八五、九五科技攻關工程中均列有離子色譜國產化的工

5、程,對其進行了重點技術攻關。色譜的分類 色譜的分類有多種,主要按兩相的狀態(tài)及應用領域的不同可分為兩大類1. 按應用領域不同分類制備色譜半制備色譜2. 以流動相和固定相的狀態(tài)分類氣相色譜、氣固色譜、氣液色譜、液相色譜、液固色譜、液液色譜、超臨界色譜、毛細管電泳離子交換色譜子子色譜別離主要是應用離子交換的原理,采用低交換容量的離子交換樹脂來別離離 子。它在離子色譜中應用最廣泛,其主要填料類型為有機離子交換樹脂,以苯乙烯二乙烯苯共聚體為骨架在苯環(huán)上引入磺酸基形成強酸型陽離子交換樹脂,引入叔胺基而成季胺型強堿性陰離子交換樹脂,此交換樹脂具有大孔或薄殼型或多孔外表層型的物理結構以便于快速 到達交換平衡。

6、離子交換樹脂耐酸堿, 可在任何pH范圍內使用,易再生處理,使用壽命長。 缺點是機械強度差,易溶脹,易受有機物污染。離子色譜根本流程圖如下列圖所示:離子交換的分類及常見種類一分類離子交換劑分為兩大類,即陽離子交換劑和陰離子交換劑。各類交換劑根據其解離性大小, 還可分為強、弱兩種,即強酸劑陽離子交換劑弱酸劑 強磴型陰離子交換劑弱磴型。1. 陽離子交換劑陽離子交換劑中的可解離基因是磺酸 -SO3H、磷酸-PO3H2 、 短酸COOH和 酚羥基-OH等酸性基。某些交換劑在交換時反響如下：強酸性：R-SO3 -H+ + Na+ R-SO3- Na+H+弱酸性：R-COOH + Na+ R-COONa +

7、 H+國產樹脂中強酸 1×7 上海樹脂# 732和國外產品 Dowex 50、Zerolit 225等都于強 酸型離子交換劑。2. 陰離子交換劑陰離子交換劑中的可解離基因是伯胺、-NH2 、仲胺-NHCH3 、叔胺N- CH3 2和季胺-N CH3 2等磴性基團。某些交換反響如下：強磴性：R-N+ CH3 2 H·OH- + Cl R-N+ CH3 2 Cl + OH- 弱磴性：R-N+ CH3 2 H·OH- + Cl R-N+ CH3 2 HCl + OH-強檢性# 201號國產樹脂和國外 Dowex1、Dowex2、ZerolitFF等都屬于強磴型

8、陰離子交換劑。二種類1. 纖維素離子交換劑：陽離子交換劑有羥甲基纖維素CM-纖維素,陰離子交換劑有氯代 三乙胺纖維紗DESE-纖維素。2. 交聯(lián)葡聚糖離子交換劑：是將交換基因連接到交聯(lián)葡聚糖上制成的一類交換劑,因而既具有離子交換作用,又具有分子篩效應,是一類廣泛應用的色譜別離物質。常用的Sephadex離子交換劑也有陰離子和陽離子交換劑兩類。陰離子交換劑有DEAE-Sephadex A-25 , A-50和 QAE- Sephadex A25 , A50 ; 陽離子交換劑有 CM-Sephaetx C-50 , C-50 和 Sephadex C-25 , C-50o陰離子交換劑用英文字頭 A

9、,陽離子交換劑的英文字頭是 Co英文字后面的數(shù) 字表示Sephadex型號。3. 瓊脂糖離子離交換劑：是將DESE-或CM-基團附著在Sepharose CL-6B上形成,DEAE-Sephades 陰離子和 CM-Sepharose 陽離子,具有硬度大,性質穩(wěn)定,凝膠后的流速好,別離水平強等優(yōu)點。交換劑的處理,再生與轉型新出廠的樹脂是干樹脂,要用水浸透使之充分吸水膨脹。因其含有政績一些雜質,所要要用水、酸、磴洗滌。一般手續(xù)如下：1. 新出廠干樹脂用水浸泡 2小時后減抽壓去氣泡,傾去水,再用大量無離子水洗至澄清, 去水2. 加4倍量0.1-2N HCl攪抖4小時,除去酸液,水洗到中性3. 再加

10、4倍量0.1-2N NaOH攪抖4小時,除檢液,水洗到中性備用。4. 將樹脂帶上所希望的某種離子的操作稱為轉型。如希望陽樹脂帶 Na+,那么用4倍量NaOH攪拌浸泡2小時以上；如希望樹脂帶 H+,可用HCl處理。陰樹脂轉型也同樣,假設希望帶Cl-那么用HCl,希望帶 OH-那么用NaOH。再生：用過的樹脂使其恢復原狀的方法稱為再生。并非每次再一都用酸、磴液洗滌,往往只要轉型處理就行了。樹脂保存方法使用過的樹脂用大量的去離子水洗至中性后,放置于20%酒精中,4C冰箱保存。再次使用時,需先用大量的去離子水洗至中性,再用 0.5N 氫氧化鈉和 0.5N 氯化鈉處理 0.5小時, 洗至中性即可使用。柱

11、上操作交換劑裝柱最簡單的交換層析柱可用磴式滴定管代替。處理過的樹脂放入燒杯,加少量水邊攪拌邊倒入保持垂直的層析管中,使樹脂緩慢沉降。交換劑在柱內必須分布均勻。裝柱前應先在柱內保存 1/3的緩沖液,并排除柱底部氣泡,然后再傾入樹脂。上樣：向層析柱內傾入樣品液洗脫與收集不同樣品選用的洗脫液不同。原那么是用一種比吸著物質更活潑的離子,把吸著物交換出來。由于被吸著的物質往往不是我們所要求的單一物質,因此除了正確選擇洗脫液外還采控制流速和分布收集的方法來獲得所需的單一物質。1.3試驗流程粗酶液的制備4 C 浸泡 12h, 1 x 104r/min , 4 C將一定量的發(fā)酵酶粉溶于醋酸鈉或者磷酸鹽緩沖液中

12、, 離心10分鐘,棄去沉淀,收集上清夜進行別離。備注：這一步驟已完成色譜柱的準備裝柱按標準方法將離子交換樹脂裝填于色譜柱內,用平衡緩沖液平衡。-淀粉酶的別離將一定量的樣品溶液緩慢上入色譜柱內,先后用平衡緩沖液和洗脫緩沖液洗滌,每隔2分鐘收集一次樣品,每個樣品檢測280nm的吸光值,繪出色譜曲線。將每個峰的樣品集中起 來,以備酶活和蛋白質含量的測定。備注：具體操作步驟及上樣量以ppt課件為準試驗二、a -淀粉酶的活性測定及比活計算1.1試劑及設備3,5二硝基水楊酸試劑DNS 葡萄糖標準液10mg/ml 福林試劑淀粉溶液10mg/ml磷酸鹽緩沖液pH6.0 , 0.02M722型或721型分光光度

13、計4 000r/min的離心機 分析天平1.2原理與方法1.2.1 Folin-酚試劑測定蛋白含量Folin-酚試劑法包括兩步反響：第一步是在堿性條件下,蛋白質與銅作用生成蛋白質-銅絡合物；第二步是此絡合物將磷鉗酸-磷鴇酸試劑Folin試劑復原,產生深藍色磷鉗藍和磷鴇藍混合物,顏色深淺與蛋白質含量成正比。此法操作簡便,靈敏度比雙縮脈 法高100倍,定量范圍為5100 g蛋白質。Folin試劑顯色反響由酪氨酸、色氨酸和半胱 氨酸引起,因此樣品中假設含有酚類、檸檬酸和疏基化合物均有干擾作用。此外,不同蛋白 質因酪氨酸、色氨酸含量不同而使顯色強度稍有不同。 淀粉酶活性測定淀粉是植物最主要的貯藏多糖,

14、也是人和動物的重要食物和發(fā)酵工業(yè)的根本原料。淀粉經淀粉酶作用后生成葡萄糖、麥芽糖等小分子物質而被機體利用。淀粉酶主要包括a -55淀粉酶和3 -淀粉酶兩種。a -淀粉酶可隨機地作用于淀粉中的a -1,4-糖昔鍵,生成葡萄糖、麥芽糖、麥芽三糖、糊精等復原糖,同時使淀粉的粘度降低,因此又稱為液化酶。6 -淀粉酶可從淀粉的非復原性末端進行水解,每次水解下一分子麥芽糖,又被稱為糖化酶。淀粉酶催化產生的這些復原糖能使 3,5-二硝基水楊酸復原,生成棕紅色的3-氨基-5-硝基水楊酸,其反應式如下：復原精5-硝基水楊酸黃色COCH+糖酸3-氨基-5-硝基水楊酸棕紅色淀粉酶活力的大小與產生的復原糖的量成正比。

15、用標準濃度的麥芽糖溶液制作標準曲 線,用比色法測定淀粉酶作用于淀粉后生成的復原糖的量,以單位重量樣品在一定時間內生成的麥芽糖的量表示酶活力。淀粉酶存在于幾乎所有植物中,特別是萌發(fā)后的禾谷類種子,淀粉酶活力最強,其中 主要是a -淀粉酶和3 -淀粉酶。兩種淀粉酶特性不同,a -淀粉酶不耐酸,在pH3.6以下迅速鈍化。3 -淀粉酶不耐熱,在70C 15min鈍化。根據它們的這種特性,在測定活力時鈍 化其中之一,就可測出另一種淀粉酶的活力。本實驗采用加熱的方法鈍化3 -淀粉酶,測出a -淀粉酶的活力。在非鈍化條件下測定淀粉酶總活力a -淀粉酶活力+ 3 -淀粉酶活力,再減去a -淀粉酶的活力,就可求

16、出3 -淀粉酶的活力。1.3試驗局部1.3.1 Folin-酚試劑測定蛋白含量按ppt課件為準,以下僅供參考1.3.1.1 標準曲線的制作1 配制標準牛血清白蛋白溶液：在分析夭平上精確稱取0.0250g結晶牛血清白蛋白,倒入小燒杯內,用少量蒸儲水溶解后轉入100mL容量瓶中,燒杯內的殘液用少量蒸儲水沖洗數(shù)次,沖洗液一并倒入容量瓶中,用蒸儲水定容至100mL,那么配成250邱/mL的牛血清白蛋白溶液。2 系列標準牛血清白蛋白溶液的配制：取6支普通試管,按表1參加標準濃度的牛血清白蛋白溶液和蒸儲水,配成一系列不同濃度的牛血清白蛋白溶液。然后各加試劑甲5mL,混合后在室溫下放置10min,再各加0.

17、5試劑乙,立即混合均勻這一步速度要快,否那么會使顯色程度減弱。30min后,以不含蛋白質的1號試管為對照,用722型分光光度計于 500- 650nm波長下測定各試管中溶液的光密度并記錄結果。3標準曲線的繪制：以牛血清白蛋白含量 g為橫坐標,以光密度為縱坐標繪制標準 曲線。表1牛血潔自蜜白標準庶線制作試 制管號123456250ugmL牛血清白蚩白mLl00.20.40.60.1.0蘊餌水tmL*L00 80 60 40.20蛋白質含量KgQSO100150200250樣品測定將各峰收集的樣品經一定稀釋后,按標準曲線的步驟進行測定。以緩沖液作為空白對照。淀粉酶活性測定標準曲線的繪制 分別吸取1

18、.0%葡萄糖標準溶液 1.0, 2.0, 3.0, 4.0, 5.0, 6.0ml于50ml容量瓶中,用蒸儲水制成每毫升含葡萄糖200、400、600、800、1000、1200ug的標準溶液,按表 A1的操作步驟一起反響。以葡萄糖含量為縱坐標0.5ml以上稀釋液葡萄糖含量分別為：100、200、300、400、500、600 g,以吸光值為橫坐標,繪制標準曲線,列出直線回歸方程Y= KX+B 。樣品測定將各峰收集的樣品經一定稀釋后按下表所示步驟操作,在反響過程中,從參加底物開始,向每支管中參加試劑的時間間隔要絕對一致： 表A1反響順序樣品,標準樣品空白標準空白樣品稀釋液ml0.50.5蒸儲水ml0.550 C 預熱 5minVVV依次參加淀粉溶液ml1.51.5 第二步1.5 第二步混合VVV50C 保溫 30minV依次參加DNS試劑ml3.03.0 (第一3.0