分子生物學研究方法課件

1、第十二章第十二章 分子生物學研究方法分子生物學研究方法 2SNPSNP概述概述單核苷酸多態(tài)性單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism, (single nucleotide polymorphism, SNP)SNP)：單個核苷酸的突變而引起的多態(tài)性。：單個核苷酸的突變而引起的多態(tài)性。單體型單體型(Haplotype)(Haplotype)：染色體上某一區(qū)域的一組相關聯(lián)：染色體上某一區(qū)域的一組相關聯(lián)的的SNPSNP等位位點被稱作單體型。相鄰等位位點被稱作單體型。相鄰SNPsSNPs的等位位點傾的等位位點傾向于以一個整體信息傳遞給后代。向于以一個整體信息傳遞給

2、后代。 3SNPSNP分類：分類：基因編碼區(qū)基因編碼區(qū)SNP(cSNP)SNP(cSNP)：同義同義cSNPcSNP：SNPSNP導致的編碼序列改變并不影響蛋白質的導致的編碼序列改變并不影響蛋白質的氨基酸序列，突變堿基和未突變堿基含義相同。氨基酸序列，突變堿基和未突變堿基含義相同。非同義非同義cSNPcSNP：堿基改變使蛋白質序列發(fā)生變化，從而影：堿基改變使蛋白質序列發(fā)生變化，從而影響蛋白質的功能。常是生物性狀發(fā)生改變的直接原因。響蛋白質的功能。常是生物性狀發(fā)生改變的直接原因?；蛘{(diào)控區(qū)基因調(diào)控區(qū)SNP(pSNP)SNP(pSNP)：影響基因表達量的多少。：影響基因表達量的多少?；蜷g隨機非編

3、碼區(qū)基因間隨機非編碼區(qū)(rSNP)(rSNP)：cSNPcSNP、pSNPpSNP在功能和疾病發(fā)生、發(fā)展方面具有更重要的在功能和疾病發(fā)生、發(fā)展方面具有更重要的意義。意義。 4SNPSNP檢測技術檢測技術基因芯片、基因芯片、TaqmanTaqman技術、分子信標、焦磷酸測序。技術、分子信標、焦磷酸測序。TaqmanTaqman技術原理：技術原理：探針設計上，利用熒光共振能量轉換探針設計上，利用熒光共振能量轉換(FRET)(FRET)技術，探針技術，探針55和和33端分別用特殊的染料標記，稱為端分別用特殊的染料標記，稱為供體供體- -受體受體染料染料對或引爆對或引爆- -猝滅染料對。猝滅染料對。正

4、常情況下，由于探針正常情況下，由于探針55端熒光基團和端熒光基團和33端猝滅基團緊端猝滅基團緊鄰在一起，供體所發(fā)熒光由于其光譜在空間上接近受體鄰在一起，供體所發(fā)熒光由于其光譜在空間上接近受體染料而被猝滅，只有當兩者分離時才能檢測到供體所發(fā)染料而被猝滅，只有當兩者分離時才能檢測到供體所發(fā)出的熒光。出的熒光。 5 6TaqmanTaqman技術的基本原理是利用技術的基本原理是利用TaqTaq酶的酶的55核酸外核酸外切酶活性，切酶活性，PCRPCR反應中除了兩個傳統(tǒng)的反應中除了兩個傳統(tǒng)的PCRPCR引物引物P1P1、P2P2外，還有第三個引物外，還有第三個引物P3(P3(等位特異性等位特異性Taqm

5、anTaqman探探針針) )，含有待檢測的，含有待檢測的SNPSNP位點，特異結合在位點，特異結合在P1P1結合結合位點的下游。位點的下游。P3P3探針的探針的55端和端和33端分別標有熒光端分別標有熒光基團和猝滅基團，因基團和猝滅基團，因P3P3的的33端被猝滅基團封阻而端被猝滅基團封阻而不能以自身為引物進行擴增。不能以自身為引物進行擴增。 7PCRPCR反應中，反應中，TaqTaq酶以酶以P1P1為引物合成新的為引物合成新的DNADNA鏈，鏈，隨著反應的進行，隨著反應的進行，TaqTaq酶接觸到酶接觸到P3P3并激發(fā)其并激發(fā)其5353外切酶活性，使外切酶活性，使P3P3從從5 5端開始降

6、解，最后端開始降解，最后DNADNA鏈得以延伸，而鏈得以延伸，而P3P3探針上的熒光基團和猝探針上的熒光基團和猝滅基團由于不再在一個分子上，熒光基團釋滅基團由于不再在一個分子上，熒光基團釋放而發(fā)出熒光信號。放而發(fā)出熒光信號。 8焦磷酸測序法：焦磷酸測序法：核心：由四種酶催化的同一反應體系中的酶級聯(lián)反應。核心：由四種酶催化的同一反應體系中的酶級聯(lián)反應。四種酶：四種酶：DNADNA聚合酶聚合酶(DNA poly merase)(DNA poly merase)、ATPATP硫酸化酶硫酸化酶(ATP sulfurylase)(ATP sulfurylase)、熒光素酶、熒光素酶(luciferase

7、)(luciferase)、雙磷酸、雙磷酸酶酶(apyrase)(apyrase)。底物：底物：5-5-磷酰硫酸磷酰硫酸(adenosine 5-phosphosulfate, (adenosine 5-phosphosulfate, APS)APS)、熒光素、熒光素(luciferin)(luciferin)。 9每輪測序反應中，只加入每輪測序反應中，只加入一一種種dNTPdNTP，如果該，如果該dNTPdNTP與模板與模板配對，聚合酶就可以將其摻配對，聚合酶就可以將其摻入到引物鏈中并釋放出等摩入到引物鏈中并釋放出等摩爾數(shù)的爾數(shù)的焦磷酸焦磷酸基團基團(PPi)(PPi)，PPiPPi可最終轉

8、化為可見光信號，可最終轉化為可見光信號，并由并由PyrogramPyrogramTMTM轉化為一個峰轉化為一個峰值，每個峰值的高度與反應值，每個峰值的高度與反應中摻入的核苷酸數(shù)目成正比，中摻入的核苷酸數(shù)目成正比，然后加入下一種然后加入下一種dNTPdNTP，繼續(xù)，繼續(xù)DNADNA鏈的合成。鏈的合成。 10第一步：第一步：1 1個特異性的測序個特異性的測序引物和單鏈引物和單鏈DNADNA模板結合，模板結合，然后加入酶混合物然后加入酶混合物(DNA (DNA PolymerasePolymerase、ATPATP硫酸化酶、硫酸化酶、熒光素酶和雙磷酸酶熒光素酶和雙磷酸酶) )和底和底物混合物物混合物

9、(5-(5-磷酰硫酸磷酰硫酸APSAPS和熒光素和熒光素Luciferin)Luciferin)。 11第二步：向反應體系中加入第二步：向反應體系中加入1 1種種dNTPdNTP，如果它剛好能和，如果它剛好能和DNADNA模板的下一個堿基配對，模板的下一個堿基配對，則會在則會在DNADNA聚合酶的作用下，聚合酶的作用下，添加到測序引物的添加到測序引物的33末端，末端，同時釋放出一個分子的焦磷同時釋放出一個分子的焦磷酸酸(PPi)(PPi)。 12第三步：在第三步：在ATPATP硫酸化酶作用下，硫酸化酶作用下，生成的生成的PPiPPi與與APSAPS結合形成結合形成ATPATP。在熒光素酶催化下

10、，生成的在熒光素酶催化下，生成的ATPATP又與熒光素結合形成又與熒光素結合形成氧化熒光氧化熒光素素，同時產(chǎn)生可見光。通過，同時產(chǎn)生可見光。通過CCDCCD光學系統(tǒng)即可獲得一個特異的光學系統(tǒng)即可獲得一個特異的檢測峰，峰值的高低則和相匹檢測峰，峰值的高低則和相匹配的堿基數(shù)成正比。配的堿基數(shù)成正比。 13第四步：反應體系中第四步：反應體系中剩余的剩余的dNTPdNTP和殘留的和殘留的少量少量ATPATP在雙磷酸酶在雙磷酸酶的作用下發(fā)生降解。的作用下發(fā)生降解。 14第五步：加入另一種第五步：加入另一種dNTPdNTP，使第，使第2 24 4步反應重復進行，步反應重復進行，根據(jù)獲得的峰值圖即可讀取準確

11、的根據(jù)獲得的峰值圖即可讀取準確的DNADNA序列信息。序列信息。 15 16SNPSNP應用應用人類基因單體型圖的繪制。人類基因單體型圖的繪制。SNPSNP與疾病易感基因的相關性分析。與疾病易感基因的相關性分析。指導用藥與藥物設計。指導用藥與藥物設計。 17cDNAcDNA差示分析法克隆基因差示分析法克隆基因RDARDA代表性差異分析代表性差異分析(representational difference (representational difference analysis, RDA)analysis, RDA)：RDARDA充分發(fā)揮了充分發(fā)揮了PCRPCR以以指數(shù)形式擴增雙鏈指數(shù)形式擴增

12、雙鏈DNADNA模板模板而以而以線性形式擴增單鏈線性形式擴增單鏈模板的特性，通過降低模板的特性，通過降低cDNAcDNA群體復雜性和更換群體復雜性和更換cDNAcDNA兩端接頭等方法，特兩端接頭等方法，特異擴增目的基因片段。異擴增目的基因片段。 18因試驗對象因試驗對象(Tester)(Tester)和供試探針和供試探針(Driver)(Driver)在在接受差示分析前均經(jīng)一個接受差示分析前均經(jīng)一個4 4堿基切割酶處理，堿基切割酶處理，形成平均長度形成平均長度256bp256bp的代表群的代表群(representation)(representation)，保證絕大部分遺傳信息，保證絕大部分

13、遺傳信息能被擴增。每次能被擴增。每次T T減減D D反應中兩者物質的量比反應中兩者物質的量比要求達到要求達到1:1001:100或更高，經(jīng)或更高，經(jīng)2-32-3次重復，次重復，T T群體群體非特異性序列幾乎沒有偶然逃脫的可能性。非特異性序列幾乎沒有偶然逃脫的可能性。 19 20使用使用GatewayGateway技術進行克隆和表達一切皆有可能技術進行克隆和表達一切皆有可能 21通過通過TOPOTOPO反應反應將目的基因將目的基因PCRPCR產(chǎn)物連接到產(chǎn)物連接到EntryEntry載載體中。體中。 22LRLR反應反應可將目的片段從可將目的片段從EntryEntry載體載體重組重組到表達載到表達

14、載體中。體中。EntryEntry載體上基因載體上基因兩端具有兩端具有attL1attL1和和attL2attL2位位點，目的載體中含有點，目的載體中含有attR1attR1和和attR2attR2位點，通過位點，通過重組形成新的位點重組形成新的位點attB1attB1和和attB2attB2，從而將目的基，從而將目的基因亞克隆到表達載體中。因亞克隆到表達載體中。 23 雙向電泳雙向電泳等電聚焦：蛋白質在含有載體兩性電解質形等電聚焦：蛋白質在含有載體兩性電解質形成的一個連續(xù)而穩(wěn)定的成的一個連續(xù)而穩(wěn)定的線性線性pHpH梯度梯度中電泳。中電泳。蛋白質分子在偏離其等電點的蛋白質分子在偏離其等電點的p

15、HpH條件下帶有條件下帶有電荷，因此可以在電場中移動，當?shù)鞍踪|遷電荷，因此可以在電場中移動，當?shù)鞍踪|遷移至其移至其等電點等電點位置時，其凈電荷數(shù)為零，在位置時，其凈電荷數(shù)為零，在電場中不移動，據(jù)此將蛋白質分離。電場中不移動，據(jù)此將蛋白質分離。SDS-SDS-聚丙烯酰胺：分子質量聚丙烯酰胺：分子質量 24 25 26 27 28 29 30 31生物學問題生物學問題的提出的提出實驗模型實驗模型的設計的設計實驗組和對照組實驗組和對照組樣品的制備樣品的制備蛋白樣品的蛋白樣品的IEF和和PAGE電泳分離電泳分離圖像掃描和初步分析圖像掃描和初步分析感興趣感興趣蛋白點蛋白點的切取的切取胰酶對脫色后蛋白質的

16、消化胰酶對脫色后蛋白質的消化質譜的多肽指紋圖、微測序分析質譜的多肽指紋圖、微測序分析質譜結果的生物信息學分析和比對質譜結果的生物信息學分析和比對新蛋白質的發(fā)現(xiàn)新蛋白質的發(fā)現(xiàn)其它實驗的進一步其它實驗的進一步驗證（驗證（western blot等）等）蛋白信息的蛋白信息的初步獲得初步獲得 32蛋白質的質譜分析技術蛋白質的質譜分析技術基質輔助激光解析電離：飛行質譜儀基質輔助激光解析電離：飛行質譜儀(MALDI-TOF)(MALDI-TOF)。電噴霧質譜電噴霧質譜ESI-MSESI-MS： 33從從2D2D膠中分離得到的或其它來源的膠中分離得到的或其它來源的蛋白質蛋白質，酶解成，酶解成小小肽肽后與基質

17、混合，將樣品混合物點到后與基質混合，將樣品混合物點到金屬靶金屬靶表面上并表面上并使之干燥使之干燥結晶結晶，然后用，然后用激光轟擊激光轟擊，將呈，將呈離子化氣體離子化氣體的的待分析物從靶表面噴射出去。待分析物從靶表面噴射出去。離子化的氣體中每個分子帶有一個或更多的正離子化的氣體中每個分子帶有一個或更多的正電荷電荷，這些氣體肽段在這些氣體肽段在電場電場中被中被加速加速后，后，到達檢測器的時間到達檢測器的時間由肽段的質量和其所帶電荷數(shù)的比值由肽段的質量和其所帶電荷數(shù)的比值( (m/zm/z) )決定。決定。 34 35生物質譜的一般流程：生物質譜的一般流程：蛋白酶解成肽段。蛋白酶解成肽段。肽段分離。

18、肽段分離。離子進入質譜，得到質譜圖。離子進入質譜，得到質譜圖。用計算機軟件將質譜圖與蛋白數(shù)據(jù)庫進行比對，從而鑒用計算機軟件將質譜圖與蛋白數(shù)據(jù)庫進行比對，從而鑒定出蛋白。定出蛋白。 36 37 38基因表達系列分析技術基因表達系列分析技術基因表達系列分析基因表達系列分析(Serial analysis of gene (Serial analysis of gene expression, SAGE)expression, SAGE)是以是以DNADNA序列測定為基礎序列測定為基礎，定定量分析全基因組表達模式量分析全基因組表達模式的技術，能夠直接讀出的技術，能夠直接讀出任何一種細胞類型或組織的基

19、因表達信息。任何一種細胞類型或組織的基因表達信息。Long SAGELong SAGE；Short SAGEShort SAGE。 39在轉錄組水平上，任何長度超過在轉錄組水平上，任何長度超過9-109-10個堿基的核苷個堿基的核苷酸片段都可能代表一種特異性的轉錄產(chǎn)物。酸片段都可能代表一種特異性的轉錄產(chǎn)物。因此，用特定限制性核酸內(nèi)切酶分離轉錄產(chǎn)物中具因此，用特定限制性核酸內(nèi)切酶分離轉錄產(chǎn)物中具有基因特異性的有基因特異性的9-109-10個堿基的核苷酸序列并制成標個堿基的核苷酸序列并制成標簽。簽。將這些序列標簽連接、克隆、測序后，根據(jù)其占總將這些序列標簽連接、克隆、測序后，根據(jù)其占總標簽數(shù)的比例

20、即可分析其對應編碼基因的標簽數(shù)的比例即可分析其對應編碼基因的表達頻率表達頻率。 40 41 42原位雜交技術原位雜交技術(in situ hybridization, ISH)(in situ hybridization, ISH)是用標記的是用標記的核酸探針核酸探針，經(jīng)放射自顯影或非放射檢，經(jīng)放射自顯影或非放射檢測體系，在組織、細胞、間期核及染色體上對測體系，在組織、細胞、間期核及染色體上對核核酸酸進行進行定位定位或或相對定量相對定量研究的一種手段。研究的一種手段。分為分為RNARNA原位雜交和染色體原位雜交。原位雜交和染色體原位雜交。 43RNARNA原位雜交：用放射性或非放射性原位雜交：

21、用放射性或非放射性( (地高辛、地高辛、生物素等生物素等) )標記的特異性探針與被固定的標記的特異性探針與被固定的組織組織切片切片反應，若細胞中存在與探針互補的反應，若細胞中存在與探針互補的mRNAmRNA分子，兩者雜交產(chǎn)生雙鏈分子，兩者雜交產(chǎn)生雙鏈RNARNA，就可通過檢測，就可通過檢測放射性標記或酶促免疫反應顯色，對該基因放射性標記或酶促免疫反應顯色，對該基因的表達產(chǎn)物在細胞水平上做出的表達產(chǎn)物在細胞水平上做出定性定量分析定性定量分析。 44熒光原位雜交熒光原位雜交(fluorescence in situ hybridization, (fluorescence in situ hybr

22、idization, FISH)FISH)：首先對寡核苷酸探針做特殊的修飾和標記，然：首先對寡核苷酸探針做特殊的修飾和標記，然后用原位雜交法與靶染色體或后用原位雜交法與靶染色體或DNADNA上特定的序列結合，上特定的序列結合，再通過與再通過與熒光素熒光素分子相偶聯(lián)的單克隆分子相偶聯(lián)的單克隆抗體抗體來確定該來確定該DNADNA序列在染色體上的位置。序列在染色體上的位置。FISHFISH技術不需要放射性同位素，實驗周期短，檢測靈敏技術不需要放射性同位素，實驗周期短，檢測靈敏度高。度高。 45按標記物不同又可分為按標記物不同又可分為直接標記法直接標記法和和間接標記法間接標記法。用生物素用生物素(bi

23、otin)(biotin)或地高辛配體或地高辛配體(digoxingenin)(digoxingenin)標記稱標記稱為為間接標記間接標記，雜交后需要通過免疫熒光抗體檢測方能看，雜交后需要通過免疫熒光抗體檢測方能看到熒光信號，因而步驟較多、操作麻煩，其到熒光信號，因而步驟較多、操作麻煩，其優(yōu)點優(yōu)點是在信是在信號較弱或較小時可經(jīng)抗原抗體反應號較弱或較小時可經(jīng)抗原抗體反應擴大擴大，需進行染色體，需進行染色體定位的基因片段往往較小，因而間接標記具有其優(yōu)勢。定位的基因片段往往較小，因而間接標記具有其優(yōu)勢。 46直接用熒光素標記直接用熒光素標記DNADNA的方法稱為的方法稱為直接標記直接標記。由于直接。

24、由于直接標記的探針雜交后可馬上觀察到熒光信號，標記的探針雜交后可馬上觀察到熒光信號，省去省去了了繁瑣繁瑣的免疫熒光的免疫熒光反應反應，不再需要購買熒光抗體，也由于近年，不再需要購買熒光抗體，也由于近年來熒光素的亮度和抗淬滅性的不斷改進和提高，直接標來熒光素的亮度和抗淬滅性的不斷改進和提高，直接標記的熒光探針越來越成為首選，其熒光強度和信號大小記的熒光探針越來越成為首選，其熒光強度和信號大小都都易于易于在普通熒光顯微鏡下在普通熒光顯微鏡下觀察觀察，操作過程中也，操作過程中也不需不需要要嚴格嚴格避光避光，使，使FISHFISH過程變得簡便而易于操作。過程變得簡便而易于操作。缺點缺點是信是信號不能放

25、大。號不能放大。 47 48 49 50基因定點突變技術基因定點突變技術重疊延伸介導的定點誘變：重疊延伸介導的定點誘變：大引物誘變法：大引物誘變法：重疊延伸介導的定點誘變：重疊延伸介導的定點誘變：使用帶突變堿基的互補引物對兩段目的基因序列分別進使用帶突變堿基的互補引物對兩段目的基因序列分別進行第一輪行第一輪PCRPCR擴增。擴增。將擴增產(chǎn)物進行重疊退火延伸，獲得帶突變堿基的完整將擴增產(chǎn)物進行重疊退火延伸，獲得帶突變堿基的完整序列。序列。使用該完整序列的兩端引物進行第二輪使用該完整序列的兩端引物進行第二輪PCRPCR擴增。擴增。 51 52大引物誘變法：大引物誘變法：將所使用的引物之一進行定點堿

26、基突變后，作第一輪將所使用的引物之一進行定點堿基突變后，作第一輪PCRPCR擴增。擴增。將第一輪擴增產(chǎn)物作為第二輪將第一輪擴增產(chǎn)物作為第二輪PCRPCR擴增的引物來使用，擴增的引物來使用，從而使第二輪擴增的產(chǎn)物帶突變的堿基。從而使第二輪擴增的產(chǎn)物帶突變的堿基。 53PCR1PCR1使用正向誘變引物使用正向誘變引物(M)(M)和和反向引物反向引物(R1)(R1)擴增產(chǎn)生雙鏈擴增產(chǎn)生雙鏈大引物，退火與野生型基因大引物，退火與野生型基因復性，第二輪復性，第二輪PCRPCR時第二種退時第二種退火產(chǎn)物可以延伸，再用正向火產(chǎn)物可以延伸，再用正向引物引物(F2)(F2)擴增產(chǎn)生帶有突變擴增產(chǎn)生帶有突變的雙鏈

27、的雙鏈DNADNA，F(xiàn)2F2的退火溫度明的退火溫度明顯高于第一輪顯高于第一輪PCRPCR所使用的引所使用的引物物M M和和R1R1，可以忽略引物，可以忽略引物M M和和R1R1所造成的干擾。所造成的干擾。 54 55酵母單雜交系統(tǒng)酵母單雜交系統(tǒng)(yeast one-hybrid system)(yeast one-hybrid system)是二十世紀是二十世紀9090年代中期發(fā)展起來的技術，常用于研究年代中期發(fā)展起來的技術，常用于研究DNA-DNA-蛋白質之間的相互作用。蛋白質之間的相互作用。其特點是可識別穩(wěn)定其特點是可識別穩(wěn)定結合結合于于DNADNA上的上的蛋白蛋白質，可在酵母質，可在酵母

28、細胞內(nèi)研究真核生物中細胞內(nèi)研究真核生物中DNA-DNA-蛋白質之間的相互作用，并蛋白質之間的相互作用，并通過篩選通過篩選DNADNA文庫直接獲得與靶序列相互作用蛋白的編文庫直接獲得與靶序列相互作用蛋白的編碼基因。碼基因。此外，該體系也是分析鑒定細胞中此外，該體系也是分析鑒定細胞中轉錄調(diào)控因子轉錄調(diào)控因子與順與順式式作用元件作用元件相互作用的有效方法。相互作用的有效方法。 56將已知的特定順式作用元件構建到最基本啟動子將已知的特定順式作用元件構建到最基本啟動子(minimal promoter, Pmin)(minimal promoter, Pmin)上游，把報告基因連接到上游，把報告基因連接

29、到PminPmin下游，然后將編碼待檢測轉錄因子下游，然后將編碼待檢測轉錄因子cDNAcDNA與已知酵母與已知酵母轉錄激活結構域轉錄激活結構域(AD)(AD)融合表達載體導入酵母細胞，該基融合表達載體導入酵母細胞，該基因產(chǎn)物如果能夠與順式作用元件相結合，就能激活因產(chǎn)物如果能夠與順式作用元件相結合，就能激活PminPmin啟動子，使報告基因得到表達。啟動子，使報告基因得到表達。 57 58酵母雙雜交系統(tǒng)酵母雙雜交系統(tǒng)(Yeast two-hybrid system)(Yeast two-hybrid system)原理：原理：真核生物的轉錄因子大多是由兩個結構上分開、功能上真核生物的轉錄因子大多

30、是由兩個結構上分開、功能上獨立的結構域組成的，即由獨立的結構域組成的，即由DNADNA結合域結合域(BD)(BD)和轉錄激活和轉錄激活域域(AD)(AD)構成。構成。單獨的單獨的BDBD能與特定基因地啟動區(qū)結合，但不能激活基因能與特定基因地啟動區(qū)結合，但不能激活基因的轉錄，而由不同轉錄因子的的轉錄，而由不同轉錄因子的BDBD和和ADAD所形成的融合蛋白所形成的融合蛋白卻能行使激活轉錄的功能。卻能行使激活轉錄的功能。 59實驗方法：實驗方法：首先利用基因重組技術將編碼已知蛋白的首先利用基因重組技術將編碼已知蛋白的DNADNA序列連接序列連接到帶有酵母轉錄因子到帶有酵母轉錄因子BDBD編碼區(qū)的表達

31、載體上。編碼區(qū)的表達載體上。導入酵母細胞中，使之表達帶有導入酵母細胞中，使之表達帶有BDBD的融合蛋白，與報告的融合蛋白，與報告基因上游的啟動調(diào)控區(qū)相結合，準備作為基因上游的啟動調(diào)控區(qū)相結合，準備作為“誘餌誘餌”捕獲捕獲與已知蛋白相互作用的基因產(chǎn)物。與已知蛋白相互作用的基因產(chǎn)物。將將ADAD的的DNADNA與待篩選的與待篩選的cDNAcDNA文庫中不同插入片段相連接，文庫中不同插入片段相連接，獲得獲得“獵物獵物”載體，轉化含有載體，轉化含有“誘餌誘餌”的酵母細胞。的酵母細胞。 60實驗方法：實驗方法：一旦酵母細胞中表達的一旦酵母細胞中表達的“誘餌誘餌”蛋白與蛋白與“獵物獵物”載體中載體中表達的

32、某個蛋白質發(fā)生相互作用，不同轉錄調(diào)控因子的表達的某個蛋白質發(fā)生相互作用，不同轉錄調(diào)控因子的ADAD和和BDBD結構域就會被牽引靠攏，激活報告基因表達。結構域就會被牽引靠攏，激活報告基因表達。分離有報告基因活性的酵母細胞，得到所需要的分離有報告基因活性的酵母細胞，得到所需要的“獵物獵物”載體，獲得載體，獲得與已知蛋白相互作用與已知蛋白相互作用的新基因。的新基因。 61 62 63 64Far western-Far western-體外蛋白質相互作用技術體外蛋白質相互作用技術 65 66 67CFP(CFP(青色熒光蛋白青色熒光蛋白) )的發(fā)射光譜與的發(fā)射光譜與YFP(YFP(黃色熒光蛋白黃色熒

33、光蛋白) )的的吸收光譜有相當?shù)闹丿B，當它們足夠接近時，用吸收光譜有相當?shù)闹丿B，當它們足夠接近時，用CFPCFP的的吸收波長激發(fā)，吸收波長激發(fā)，CFPCFP的發(fā)色基團將會把能量高效率地共的發(fā)色基團將會把能量高效率地共振轉移至振轉移至YFPYFP的發(fā)色基團上，引起的發(fā)色基團上，引起CFPCFP的發(fā)射熒光將減弱的發(fā)射熒光將減弱或消失，主要發(fā)射將是或消失，主要發(fā)射將是YFPYFP的熒光。的熒光。細胞內(nèi)蛋白質相互作用研究細胞內(nèi)蛋白質相互作用研究- -熒光共振能量轉移法熒光共振能量轉移法(FRET)(FRET) 68用用CFPCFP吸收波長吸收波長440nm440nm作為激發(fā)波長，實驗靈巧設計，使當?shù)鞍?/p>

34、質作為激發(fā)波長，實驗靈巧設計，使當?shù)鞍踪|a a與與b b沒有發(fā)生相互作用時，沒有發(fā)生相互作用時，CFPCFP與與YFPYFP相距很遠不能發(fā)生熒光共振相距很遠不能發(fā)生熒光共振能量轉移，因而檢測到的是能量轉移，因而檢測到的是CFPCFP的發(fā)射波長為的發(fā)射波長為480nm480nm的熒光。的熒光。當?shù)鞍踪|當?shù)鞍踪|a a與與b b發(fā)生相互作用時，由于蛋白質發(fā)生相互作用時，由于蛋白質b b受蛋白質受蛋白質a a作用而發(fā)作用而發(fā)生構象變化，使生構象變化，使CFPCFP與與YFPYFP充分靠近發(fā)生熒光共振能量轉移，此時充分靠近發(fā)生熒光共振能量轉移，此時檢測到的就是檢測到的就是YFPYFP的發(fā)射波長為的發(fā)射波

35、長為527nm527nm的熒光。的熒光。 692000年，年，RNA的研究進展被美國的研究進展被美國科學科學雜志評為雜志評為重大科技突破；重大科技突破；2001年年“RNA干擾干擾”作為當年最重要的科學研究成作為當年最重要的科學研究成果之一，再次入選果之一，再次入選“十大科技突破十大科技突破”；2002年年12月月20日，日，Science雜志將雜志將“Small RNA & RNAi”評為評為2002年度最耀眼的明星。同時，年度最耀眼的明星。同時， Nature雜志亦將雜志亦將Small RNA評為年度重大科技成功之一。評為年度重大科技成功之一。2003年，小核糖核酸的研究第四次入選

36、年，小核糖核酸的研究第四次入選“十大科技十大科技突破突破”，排在第四位。，排在第四位。RNA研究的突破性進展，是生物醫(yī)學領域近研究的突破性進展，是生物醫(yī)學領域近20年來，年來，可與可與HGP（人類基因組計劃，生物通網(wǎng)站注）相提（人類基因組計劃，生物通網(wǎng)站注）相提并論的最重大成果之一。并論的最重大成果之一。 70RNAi(RNA interference, RNA)RNAi(RNA interference, RNA)技術技術RNARNA干擾廣泛存在于植物、真菌、線蟲、昆蟲、蛙類、干擾廣泛存在于植物、真菌、線蟲、昆蟲、蛙類、鳥類、大鼠、小鼠、猴乃至人類的幾乎所有真核生物中，鳥類、大鼠、小鼠、猴乃

37、至人類的幾乎所有真核生物中，大腸桿菌中也存在大腸桿菌中也存在RNARNA干擾現(xiàn)象。干擾現(xiàn)象。雙鏈小分子雙鏈小分子RNARNA可高效、特異性降解細胞內(nèi)同源可高效、特異性降解細胞內(nèi)同源mRNAmRNA，阻斷靶基因表達，使細胞出現(xiàn)靶基因缺失的表型，這種阻斷靶基因表達，使細胞出現(xiàn)靶基因缺失的表型，這種現(xiàn)象稱為現(xiàn)象稱為RNARNA干擾干擾(RNAi)(RNAi)。這些雙鏈小這些雙鏈小RNARNA稱稱siRNA(Small/short interfering RNA, siRNA(Small/short interfering RNA, siRNA)siRNA)。引發(fā)引發(fā)RNAiRNAi的雙鏈的雙鏈RNA

38、RNA長度必須在長度必須在30nt30nt以上，具有以上，具有5-P5-P、3-OH3-OH基團，且基團，且33端有兩個突出的堿基。端有兩個突出的堿基。 71 72miRNA研究發(fā)現(xiàn)研究發(fā)現(xiàn)miRNA的主要功能是調(diào)節(jié)生物體內(nèi)的主要功能是調(diào)節(jié)生物體內(nèi)在的與機體生長、發(fā)育、疾病發(fā)生過程有關在的與機體生長、發(fā)育、疾病發(fā)生過程有關的基因的表達，而且研究人員推測這種小分的基因的表達，而且研究人員推測這種小分子調(diào)節(jié)著人類三分之一的基因子調(diào)節(jié)著人類三分之一的基因 73MicroRNA也可以寫做也可以寫做miRNA ，是一種，是一種2125nt長的單鏈小分子長的單鏈小分子RNA。它廣泛存在于真。它廣泛存在于真

39、核生物中，是一組不編碼蛋白質的短序列核生物中，是一組不編碼蛋白質的短序列RNA，其本身不具有開放閱讀框（，其本身不具有開放閱讀框（ORF）。）。成熟的成熟的miRNA，5端有一個磷酸基團，端有一個磷酸基團，3端端為羥基。為羥基。 74編碼編碼miRNAs的基因最初產(chǎn)生一個長的的基因最初產(chǎn)生一個長的pri-RNA分子，這種分子，這種初期分子還必須被剪切成約初期分子還必須被剪切成約70-90個堿基大小、具發(fā)夾結構個堿基大小、具發(fā)夾結構單鏈單鏈RNA前體（前體（pre-miRNA）并經(jīng)過）并經(jīng)過Dicer酶加工后生成。酶加工后生成。 75 76MiRNA的作用方式的作用方式miRNA基因是一類高度保

40、守的基因家族，按基因是一類高度保守的基因家族，按其作用模式不同可分為兩種：第一種以線蟲其作用模式不同可分為兩種：第一種以線蟲lin-4為代表，作用時與靶標基因不完全互補為代表，作用時與靶標基因不完全互補結合，進而抑制翻譯而不影響結合，進而抑制翻譯而不影響mRNA的穩(wěn)定的穩(wěn)定性（不改變性（不改變mRNA豐度），這種豐度），這種miRNA是目是目前發(fā)現(xiàn)最多的種類；前發(fā)現(xiàn)最多的種類；第二種以擬南芥第二種以擬南芥miR-171為代表，作用時與為代表，作用時與靶標基因完全互補結合，作用方式和功能與靶標基因完全互補結合，作用方式和功能與siRNA非常類似，最后切割靶非常類似，最后切割靶mRNA； 77Mi

41、RNA的特異性的特異性 研究表明研究表明MiRNAs在物種間具有高度的保守性、時在物種間具有高度的保守性、時序性和組織特異性序性和組織特異性在特定的時間、組織才會表在特定的時間、組織才會表達。達。擬南芥中的擬南芥中的miR-171僅在其花序中高水平表達，在僅在其花序中高水平表達，在某些組織低水平表達，在莖、葉等組織中卻無任何某些組織低水平表達，在莖、葉等組織中卻無任何表達的跡象；表達的跡象；20-24h的果蠅胚胎提取物中可發(fā)現(xiàn)的果蠅胚胎提取物中可發(fā)現(xiàn)miR-12，卻找不，卻找不到到miR3-miR6，在成年果蠅中表達的，在成年果蠅中表達的miR-1和和let-7也無法在果蠅胚胎中表達。也無法在

42、果蠅胚胎中表達。MiRNA表達的時序性和組織特異性暗示表達的時序性和組織特異性暗示miRNA的的分布可能決定組織和細胞的功能特異性，也可能參分布可能決定組織和細胞的功能特異性，也可能參與了復雜的基因調(diào)控，對組織的發(fā)育起重要作用。與了復雜的基因調(diào)控，對組織的發(fā)育起重要作用。 78相同點：相同點：MiRNA和和siRNA都是由都是由22個左右的核苷組成；個左右的核苷組成；它們都是它們都是Dicer酶的產(chǎn)物；酶的產(chǎn)物；它們都會和它們都會和RISC復合體結合；復合體結合；它們都可以抑制靶標基因的翻譯；它們都可以抑制靶標基因的翻譯； 79兩者之間的主要差異：兩者之間的主要差異：起源階段起源階段SiRNA

43、：通常是外源的，如病毒感染和人工：通常是外源的，如病毒感染和人工插入的插入的dsRNA被剪切后產(chǎn)生外源基因進入細被剪切后產(chǎn)生外源基因進入細胞（注：病毒入侵，或者是自身合成胞（注：病毒入侵，或者是自身合成RNA中中出現(xiàn)錯誤，細胞內(nèi)就會產(chǎn)生雙鏈出現(xiàn)錯誤，細胞內(nèi)就會產(chǎn)生雙鏈RNA，來阻，來阻止這些異?；虻谋磉_）。止這些異?；虻谋磉_）。MiRNA：是內(nèi)源性的，是一種非編碼的：是內(nèi)源性的，是一種非編碼的RNA；由由miRNA基因表達出最初的基因表達出最初的pri-miRNA分子。分子。 80成熟過程成熟過程SiRNA：直接來源是長鏈的：直接來源是長鏈的dsRNA（通常為外源）；（通常為外源）；經(jīng)過經(jīng)

44、過Dicer酶酶*切割形成雙鏈切割形成雙鏈siRNA,而且每個前體而且每個前體dsRNA能夠被切割成不定數(shù)量的能夠被切割成不定數(shù)量的siRNA片段。片段。MiRNA：在細胞核中轉錄的較大的：在細胞核中轉錄的較大的pri-miRNA經(jīng)由經(jīng)由Drosha(一種一種RNAse 酶酶) 加工成為單鏈加工成為單鏈pre-miRNA；接著，發(fā)夾狀、部分互補的接著，發(fā)夾狀、部分互補的pre-miRNA在細胞質中在細胞質中被被Dicer*（一種（一種RNAse 酶）酶切割形成酶）酶切割形成miRNA；在生物體中的表達具有時序性、保守性和組織特異在生物體中的表達具有時序性、保守性和組織特異性。性。 81功能階段

45、功能階段miRNA可抑制靶標基因的翻譯，也可導致靶可抑制靶標基因的翻譯，也可導致靶標基因降解，即在轉錄水平后和翻譯水平起標基因降解，即在轉錄水平后和翻譯水平起作用；而作用；而siRNA只能導致靶標基因的降解，只能導致靶標基因的降解，即為轉錄水平后調(diào)控；即為轉錄水平后調(diào)控； 82凝膠阻滯實驗凝膠阻滯實驗(electrophoretic mobility shift assay, (electrophoretic mobility shift assay, EMSA)EMSA)是體外分析是體外分析DNADNA與蛋白質相互作用的一種特殊的凝膠電與蛋白質相互作用的一種特殊的凝膠電泳技術。泳技術。原理：在凝膠電泳中，由于電場的作用，裸露的原理：在凝膠電泳中，由于電場的作用，裸露的DNADNA朝朝正電極移動的距離與其分子量的對數(shù)成反比。如果此時正電極移動的距離與其分子量的對數(shù)成反