基于不同探針的幾種持久性有毒污染物檢測方法

1、基于不同探針的幾種持久性有毒污染物檢測方法    持久性有毒污染物(Persistent Toxic Substances,PTS)與臭氧層破壞以及溫室效應(yīng)并稱為21世紀(jì)影響人類生存與健康的三大環(huán)境問題。無論是斯德哥爾摩公約中確定的21類持久性有機(jī)污染物(Persistent Organic Pollutants,POPs);還是美國EPA確定的12類持久性生物富集有毒化合物(Persistent Bioaccumulative& Toxic Chemicals,PBT);以及環(huán)境內(nèi)分泌干擾物(Environmental EndocrineDis

2、ruptors,EEDs)的研究都與持久性有毒化學(xué)污染物有關(guān)。多環(huán)芳烴(PAHs)和多氯聯(lián)苯(PCBs)就是其中兩類典型的持久性有毒污染物,它們?cè)诃h(huán)境中分布廣泛,但多是痕量的,并且不易分解,具有高脂溶性,水溶性低,易于生物富集,同時(shí)不僅具有“三致”毒性(致癌、致畸和致突變),而且具有內(nèi)分泌干擾作用。因此對(duì)環(huán)境生物及人類健康已經(jīng)形成了不可估量的潛在威脅。加強(qiáng)對(duì)PTS的檢測分析是進(jìn)行環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)及對(duì)它們實(shí)施防控的重要前提。目前,檢測PAHs和PCBs常見的方法有氣相色譜法(GC)、高效液相色譜法(HPLC)和氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)(GC/MS)。但是這些儀器分析方法存在設(shè)備復(fù)雜、操作要求尤其是樣品前處理要求

3、苛刻、價(jià)格昂貴、測定周期長等缺陷,不適合于現(xiàn)場快速檢測和大批量分析。因此發(fā)展有效的生物分析技術(shù)將是未來的發(fā)展方向。熒光免疫分析及熒光定量免疫PCR技術(shù)由于其高特異性和高靈敏性而無需復(fù)雜的前處理過程,是很有發(fā)展前景的檢測分析方法。隨著交叉學(xué)科的發(fā)展,作為在生物及醫(yī)學(xué)領(lǐng)域廣泛應(yīng)用的這些免疫分析方法,目前已經(jīng)被引入應(yīng)用于環(huán)境監(jiān)測分析領(lǐng)域。本論文擬選擇熒光免疫分析技術(shù)和實(shí)時(shí)熒光定量免疫PCR技術(shù)對(duì)具有典型性和代表性的PTS多氯聯(lián)苯和多環(huán)芳烴,進(jìn)行分析檢測方法上的研究,為PTS的環(huán)境毒理研究和環(huán)境污染治理提供檢測方法上的科學(xué)的參考依據(jù)。同時(shí)熒光標(biāo)記物的性質(zhì)是熒光法免疫分析技術(shù)的關(guān)鍵,本論文擬引用新型熒光

4、探針量子點(diǎn)和分子信標(biāo)作為熒光免疫分析和實(shí)時(shí)熒光定量免疫PCR實(shí)驗(yàn)的熒光標(biāo)記物質(zhì),從而改善傳統(tǒng)熒光染料的高本底值,特異性差的特點(diǎn),并提高靈敏度和準(zhǔn)確性。本論文通過合成CdTe量子點(diǎn)和設(shè)計(jì)出針對(duì)pUC18具有特異性的分子信標(biāo),建立了基于CdTe量子點(diǎn)的熒光免疫測定技術(shù)和基于分子信標(biāo)探針的實(shí)時(shí)熒光定量免疫PCR技術(shù)對(duì)幾種多環(huán)芳烴和多氯聯(lián)苯進(jìn)行分析檢測。本論文主要研究內(nèi)容及結(jié)論分述如下:1、量子點(diǎn)CdTe的制備及條件優(yōu)化:采用巰基乙酸為穩(wěn)定劑,在96下回流4h,就可以在水相中直接合成了水溶性的碲化鎘(CdTe)納米晶,其熒光量子產(chǎn)率最高可達(dá)66.92%。通過TEM和XRD衍射圖譜對(duì)其進(jìn)行表征,說明了制

5、備的CdTe量子點(diǎn)具備良好的結(jié)構(gòu)特性。實(shí)驗(yàn)優(yōu)化得到了制備量子點(diǎn)的各種最佳條件。CdTe經(jīng)過表面羧基修飾,具備了生物標(biāo)記功能,通過分子偶聯(lián)作用,可鏈接DNA、多肽以及相關(guān)環(huán)境持久性有機(jī)污染物的抗體或抗原,為CdTe作為標(biāo)記探針在環(huán)境污染物分析中的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。2、生物素化探針DNA的制備和純化:探針DNA是以pUC18質(zhì)粒為模板擴(kuò)增得到的一段123個(gè)堿基對(duì)的生物素化DNA。根據(jù)DNA擴(kuò)增試劑盒的說明,在PCR擴(kuò)增體系中加入各種反應(yīng)物,包括兩條生物素化了的引物。引物序列分別是:上游引物序列從5'到3'是CTGACTCCCCGTCGTGTAGA,下游引物的序列從5'到3&#

6、39;是GCTGGCTGGTTTATTGCTGAT。PCR擴(kuò)增的程序是:94預(yù)變性4 min;30個(gè)循環(huán):每個(gè)循環(huán)94變性20s,55退火20s,72延伸20s;最后再72保持3min使延伸完全。使用UNIQ-10 PCR純化試劑盒,對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化后,再用瓊脂糖凝膠電泳后染色進(jìn)行定性,并用紫外分光光度法定量檢測分析。3、分子信標(biāo)的設(shè)計(jì)與合成:依據(jù)分子信標(biāo)探針設(shè)計(jì)原則,設(shè)計(jì)合成了針對(duì)pUC18 DNA具有特異性的分子信標(biāo)探針,其序列為:5'-FAM-CAGCGATCTGGCCCCAGTGCTGCAATCGCTG-DABCYL-3'。通過特異性考察實(shí)驗(yàn),結(jié)果表明該分子信標(biāo)

7、探針能特異識(shí)別反應(yīng)體系中的DNA,為避免PCR體系的非特異擴(kuò)增,降低本底值,提高靈敏度和準(zhǔn)確性奠定了良好基礎(chǔ)。4、直接競爭熒光免疫分析:以CdTe作為熒光標(biāo)記物,在優(yōu)化標(biāo)記條件基礎(chǔ)上,成功標(biāo)記了抗萘、抗熒蒽和抗PCB12抗體,制成了相關(guān)的熒光免疫標(biāo)記試劑。將這些標(biāo)記試劑運(yùn)用于對(duì)應(yīng)污染物的熒光免疫檢測分析(FIA)。通過考察包被介質(zhì)、包被時(shí)間、離子強(qiáng)度、pH值、表面活性劑、抗原抗體最佳工作濃度等影響因素,得到了直接競爭FIA的優(yōu)化條件,由此建立的三種污染物的直接競爭FIA抑制率標(biāo)準(zhǔn)曲線,得到線性范圍為10(-2)-103ng/mL,檢測萘、熒蒽和PCB12得到的檢出限IC20分別為7.384pg

8、/mL、9.046pg/mL和8.186pg/mL。該方法成功應(yīng)用于環(huán)境樣品的檢測,并考察了方法的特異性、回收率、精密度,結(jié)果較滿意。5、抗體包被熒光免疫分析:以CdTe作為熒光標(biāo)記物,在優(yōu)化標(biāo)記條件基礎(chǔ)上,成功標(biāo)記了萘、熒蒽和PCB12完全抗原,制成了相關(guān)的熒光免疫標(biāo)記試劑。將這些標(biāo)記試劑運(yùn)用于對(duì)應(yīng)污染物的熒光免疫檢測分析(FIA)。通過考察包被介質(zhì)、包被時(shí)間、離子強(qiáng)度、pH值、表面活性劑、抗原抗體最佳工作濃度等影響因素,得到了抗體包被FIA的優(yōu)化條件,由此建立的三種污染物的抗體包被FIA抑制率標(biāo)準(zhǔn)曲線,得到線性范圍為10(-2)-103 ng/mL,檢測萘、熒蒽和PCB12得到的IC20分

9、別為13.95 pg/mL,15.94 pg/mL和12.94 pg/mL。該方法成功應(yīng)用于環(huán)境樣品的檢測,并考察了方法的特異性、回收率、精密度,結(jié)果較為滿意。6、直接競爭實(shí)時(shí)熒光定量免疫PCR:以分子信標(biāo)作為熒光探針,運(yùn)用直接競爭實(shí)時(shí)熒光定量免疫聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(直接競爭RTFQ-IPCR)分析方法檢測環(huán)境中多環(huán)芳烴類污染物萘、蒽和熒蒽。用制備好的包被原包被經(jīng)過戊二醛處理過的PCR管,然后用PAHs與包被原競爭結(jié)合生物素化抗體,再利用親和素連接生物素化抗體和生物素化DNA,最后通過實(shí)時(shí)定量PCR儀,在優(yōu)化的擴(kuò)增程序下擴(kuò)增DNA并實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)定量檢測。論文建立了直接競爭RTFQ-IPCR方法的標(biāo)準(zhǔn)曲

10、線,對(duì)萘、蒽和熒蒽三種污染物進(jìn)行檢測,得到線性范圍分別為1-104fg/mL、10-105 fg/mL和10-107 fg/mL,相關(guān)性較好,檢出限分別為0.81、5.94、3.84 fg/mL。該方法應(yīng)用于實(shí)際環(huán)境樣品的分析,并考察了方法的特異性、回收率,結(jié)果令人滿意。實(shí)際樣品分析結(jié)果與ELISA測定結(jié)果進(jìn)行比較,具有較好的一致性,表明所建立的方法對(duì)環(huán)境持久性有毒污染物的檢測分析是可行的有效的。7、間接競爭實(shí)時(shí)熒光定量免疫PCR:以分子信標(biāo)作為熒光探針,運(yùn)用間接競爭實(shí)時(shí)熒光定量免疫聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(間接競爭RTFQ-IPCR)分析方法檢測環(huán)境中多環(huán)芳烴類污染物菲。用制備好的包被原包被經(jīng)過戊二醛

11、處理的PCR管,然后用待測物菲與包被原競爭結(jié)合一抗,接著利用生物素化二抗與結(jié)合在包被原上的特異性一抗結(jié)合,再利用親和素連接生物素化抗體和生物素化DNA,最后通過實(shí)時(shí)定量PCR儀,在優(yōu)化的擴(kuò)增程序下擴(kuò)增DNA并實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)定量檢測。論文建立了間接競爭RTFQ-IPCR分析方法標(biāo)準(zhǔn)曲線,對(duì)污染物菲進(jìn)行檢測,得到線性范圍為10-106 fg/mL,檢出限為5.34 fg/mL,相關(guān)系數(shù)為0.9747。應(yīng)用于實(shí)際環(huán)境樣品的分析,并考察了方法的特異性及樣品回收率,結(jié)果滿意。實(shí)際樣品檢測結(jié)果與HPLC測定結(jié)果比較發(fā)現(xiàn)兩者相差不大,在誤差范圍內(nèi)是可以接受的。8、抗體包被實(shí)時(shí)熒光定量免疫PCR:以分子信標(biāo)作為熒光

12、探針,運(yùn)用固相抗體包被實(shí)時(shí)熒光定量免疫聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(抗體包被RTFQ-IPCR)分析方法檢測環(huán)境中多氯聯(lián)苯類污染物PCB77。用制備好的包被抗體包被經(jīng)過戊二醛處理的PCR管,然后用待測污染物PCB77小分子和生物素化半抗原競爭結(jié)合包被抗體,再利用親和素連接生物素化半抗原和生物素化的DNA,最后通過實(shí)時(shí)定量PCR儀,在優(yōu)化的擴(kuò)增程序下擴(kuò)增DNA并實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)定量檢測。論文建立了抗體包被RTFQ-IPCR分析方法標(biāo)準(zhǔn)曲線,對(duì)污染物PCB77進(jìn)行檢測,得到線性范圍為10-105 fg/mL,檢出限為6.63 fg/mL,相關(guān)系數(shù)為0.9972。應(yīng)用于實(shí)際環(huán)境樣品的分析,并考察了方法的特異性及樣品回收率

13、,結(jié)果令人滿意。實(shí)際樣品檢測結(jié)果與GC/MS測定結(jié)果比較發(fā)現(xiàn)兩者相關(guān)性較好,在誤差范圍內(nèi)存在的差異是可以接受的。本論文首次成功的將CdTe量子點(diǎn)和分子信標(biāo)探針分別作為熒光免疫分析方法和實(shí)時(shí)熒光定量免疫PCR方法的熒光標(biāo)記探針對(duì)多環(huán)芳烴和多氯聯(lián)苯污染物進(jìn)行了檢測分析,結(jié)果滿意可靠,為環(huán)境中痕量的持久性有毒污染物的檢測分析,提供了新的研究思路。同主題文章1.    周海清,沈鶴柏,陳新斌,巢強(qiáng)國. 分子信標(biāo)的原理、應(yīng)用及其研究進(jìn)展' J. 光譜實(shí)驗(yàn)室. 2004.(03)    2.  &#

14、160; 江雅新,方曉紅,萬立駿,白春禮. 一種新型熒光探針分子信標(biāo)的研究及應(yīng)用進(jìn)展' J. 分析化學(xué). 2004.(05)    3.    王怡瑾,王宏,聶立波,何農(nóng)躍. 分子信標(biāo)技術(shù)' J. 化學(xué)通報(bào). 2004.(12)    4.    劉凌鳳,王柯敏,譚蔚泓,李軍,孟祥賢,郭秋平,唐志文,劉選明,李杜. 一種基于分子信標(biāo)熒光探針快速檢測煙草花葉病毒的新方法' J. 分析化學(xué). 2003.(0

15、9)    5.    孔德明,蔣海燕,沈含熙,宓懷風(fēng). 分子信標(biāo)用于不對(duì)稱PCR檢測乙型肝炎病毒' J. 分析測試學(xué)報(bào). 2005.(02)    6.    李軍,王柯敏,何曉曉,唐志文. 納米尺度和單分子水平上的化學(xué)生物學(xué)研究' J. 大學(xué)化學(xué). 2004.(01)    7.    蹇興超. 多環(huán)芳烴（PAH）的污染' J. 環(huán)境保護(hù). 1995.(10)    8.    于曉麗，張江. 多環(huán)芳烴污染與防治對(duì)策' J. 油氣田環(huán)境保護(hù). 1996.(04)    9.    劉凌鳳,唐志文,王柯敏,譚蔚泓,李軍,郭秋平,孟祥賢,黃杉生,李杜. 基于分子信標(biāo)實(shí)時(shí)監(jiān)測大腸桿菌DNA連接酶