酵母中還原型谷胱甘肽的提取方法研究

1、谷胱甘肽(L-谷氨酰-L-半胱氨酰-甘氨酸是三肽化合物,作為機(jī)體內(nèi)重要的生物活性巰基物質(zhì),谷胱甘肽對于維持生物體內(nèi)合適的氧化還原環(huán)境起著至關(guān)重要的作用1,廣泛存在于動植物以及微生物體內(nèi),其中以酵母、谷物種子、胚芽、人體和動物的心臟、肝臟、腎臟、紅細(xì)胞和眼睛晶狀體中含量較高2。GSH的制備方法包括化學(xué)法、酶法、發(fā)酵,其中發(fā)酵法是最具潛力的方法3,4,5,由于GSH存在于細(xì)胞內(nèi),所以要得到GSH,首先必須采用一定的破壁手段,使GSH溶出。目前關(guān)于酵母破壁的研究較多,大體可歸納為:化學(xué)破壁酸解、堿解、物理破壁液體剪切、固體剪切等、生物破壁酶解、自溶。但是目前的方法尚存在一些問題。如GSH不穩(wěn)定,無法

2、滿足食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域所要求的產(chǎn)品純度高,采用溶劑無毒等6。本文以啤酒酵母為研究對象,采用高效液相色譜法檢測樣品GSH純度,對熱水提取法和酒精提取法提取效果進(jìn)行比較,從而找出適合的提取條件。1材料和方法1.1材料啤酒酵母菌種:由上海復(fù)旦大學(xué)微生物研究室提供。1.2主要試劑亞硝基鐵氰化鈉(天津科密歐化學(xué)試劑有限公司;庚烷磺酸鈉(天津傲然精細(xì)化工研究所;牛血清白蛋白(上海藍(lán)季科技有限公司;考馬斯亮藍(lán)G-250(上海藍(lán)季科技有限公司;還原型谷胱甘肽標(biāo)準(zhǔn)品(上海伯奧生物科技有限公司進(jìn)口分裝;其余試劑均為分析純。1.3儀器LC-100高效液相色譜儀(上海伍豐科技儀器有限公司;752可見分光光度計(上海光譜

3、儀器有限公司;LGJ-12冷凍干燥機(jī)(北京松源華興科技發(fā)展有限公司;AL104電子分析天平(上海梅特勒-托利多儀器有限公司1.4分析方法用0.9%生理鹽水洗菌體3次,去除雜質(zhì),以得到純凈的啤酒酵母。熱水提取GSH稱取一定量的酵母,加入水,混勻,使混合液保持在95100一段時間后放置冰水中速冷,離心,取上清液。通過測定提取液中GSH的含量,計算濕菌體,于菌體中GSH的含量。乙醇提取GSH稱取一定量的酵母按比例與乙醇混合均勻,室溫下攪拌一段時間,離心,取上清液。通過測定提取液中GSH的含量,計算濕菌體,干菌體中GSH的含量。亞硝基鐵氰化鈉法7檢測GSH含量。高效液相檢測樣品中GSH純度8酵母中還原

4、型谷胱甘肽的提取方法研究舒嬡王家騏朱立江黃娟許鐵成(河北梅花味精集團(tuán)有限公司河北廊坊065702摘要:采用熱水和乙醇提取啤酒酵母中的還原型谷胱甘肽(GSH。研究表明,在室溫條件下,按菌體與乙醇比例1:2(W/V加入50%的乙醇,200rmin-1,攪拌2h,能有效地提取GSH,干酵母谷胱甘肽含量2.01%。與熱水提取法比較,乙醇提取液量少,過濾,濃縮時間短,所得樣品純度較高,從而大大減少了后續(xù)純化的工作量,并且乙醇可回收重復(fù)使用,因此乙醇提取法是一種有效的提取方法。關(guān)鍵詞:谷胱甘肽;啤酒酵母;提取16表2正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果表1乙醇提取GSH 的因素水平表A 提取時間(hB攪拌速率(rpmC料液比(g

5、/mlD乙醇濃度(%112001:130223001:240334001:350水平因素DiscoverC18柱(250mm ×4.6mm ,5m;流動相:磷酸鹽溶液(取磷酸二氫鈉6.80g ,庚烷磺酸鈉2.20g ,加水溶解使成1000ml ,用磷酸調(diào)節(jié)pH 值至3.0-甲醇(97:3;流速:1ml /min ,檢測波長210nm ,柱溫30,進(jìn)樣20l 。標(biāo)品:稱30mg ,置100ml 容量瓶。樣品:分別將熱水和乙醇提取法提取得到的提取液,濃縮,無水乙醇沉淀,沉淀經(jīng)真空冷凍干燥,為待測樣品。稱取適量樣品(約相當(dāng)于考馬斯亮藍(lán)G-250法。結(jié)晶牛血清白蛋白,用0.15mol /L

6、NaC1制成lmg/mL 蛋白溶液,分別吸取0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06mL ,各以0.15mol /L NaC1補(bǔ)至0.1mL ,然后加入0.1mg/mL 考馬斯亮藍(lán)G-250溶液5ml ,搖勻,1h 內(nèi)以不加試劑為空白,在595nm波長下測吸光度,制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。配1mg/ml 多糖樣品溶液,按上述方法操作測吸光度,以標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品中蛋白質(zhì)含量。2結(jié)果與討論2.1熱水提取采用熱水提取法抽提GSH ,酵母與4倍體積的沸水混合均勻,每隔2min 取樣檢測,以確定最佳的提取時間。由圖1可以看出,熱水提取12min 以后, 干酵母中GSH 含量為1.905%,隨著浸提

7、時間的延長,GSH 含量隨之下降,這可能是由于在加熱的條件下GSH 不穩(wěn)定,向GSSH 轉(zhuǎn)化,造成了部分損失。所以提取時間確定為2h 。稱取等量酵母分別加入1,2,3,4,5,6倍體積的沸水混合均勻,提取12min 取樣檢測,以確定最佳的提取料液比2。由圖2可看出,隨著加水量的增加,浸出的GSH 含量提高,加水4倍體積時,提取GSH 含量達(dá)1.865%,隨加水量的增加,GSH 含量無明顯提高,考慮到加水量過高會延長上清液濃縮時間,加大不必要的工作量,故加水量選取為1:4。2.2乙醇提取通過單因素試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)提取時間,攪拌速率,料液比,乙醇濃度等因素對提取效果有影響。因此在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,以干酵

8、母中GSH 含量為主要指標(biāo),選定提取時間,攪拌速率,料液比,乙醇濃度四因素,進(jìn)行L 9(34正交實(shí)驗(yàn)。圖2料液比對熱水提取GSH 的影響圖1提取時間對熱水提取GSH 的影響實(shí)驗(yàn)號A B C D 含量(%21232.0117由表2分析得出,各因素對產(chǎn)物的影響順序?yàn)?C>D>B>A,即料液比>乙醇濃度>攪拌速率>浸提時間。乙醇提取GSH的最佳工藝條件為: A2B1C2D3,即攪拌速率200rmin-1,提取乙醇濃度50%,料液比1:2,浸提時間2h。2.3兩種提取方法對樣品純度的影響由于GSH分子量很小,在水中的溶解度很大,擴(kuò)散要比大分子快得多,受到的阻力較小,

9、在細(xì)胞不完全破碎的條件下,只要細(xì)胞表面產(chǎn)生一些裂縫,就可以順利地擴(kuò)散到溶劑中,所以利用一些條件相對溫和的方法在提取GSH等小分子物質(zhì)方面是可行的9。通過比較可以看到,熱水提取法提取時間短,方法簡便,由于溫度較高,GSH的提取率比乙醇提取法稍低,但是熱水提取GSH的同時有大量的蛋白質(zhì),核酸等雜質(zhì)溶出。試驗(yàn)結(jié)果表明,乙醇提取法是一種較溫和的提取方法,提取時間較熱水提取時間長,但料液比例小,可大大縮短離心,濃縮提取液的時間,并且乙醇可回收利用,GSH損失少,雜質(zhì)含量較低。由圖3可見GSH對照品 的出峰時間為 12.98min。將圖4與圖5進(jìn)行比較可以看出,熱水提取所得樣品譜圖中含有許多其他組分,表明

10、雜質(zhì)含量較多,樣品GSH純度為13.56%,而乙醇提取所得樣品譜圖中部分組分峰面積減小,甚至已經(jīng)不存在,表明雜質(zhì)含量減少,樣品GSH純度為19.86%。測定結(jié)果表明,乙醇提取法所得樣品蛋白質(zhì)、核酸、色素等雜質(zhì)溶出量少,純度較高,從而減少了后續(xù)分離純化的工作量。表3兩種提取方法比較方法干酵母GSH含量%蛋白質(zhì)提取率%料液比W/V時間min圖3GSH標(biāo)準(zhǔn)色譜圖圖4熱水提取樣品色譜圖圖5乙醇提取樣品色譜圖183結(jié)論實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,酵母,加入4倍體積的水,使混合液保持在95-100,12min ,所得GSH 含量最高。通過正交實(shí)驗(yàn)測定乙醇提取法的最佳工藝條件為:攪拌速率200rpm ,提取乙醇濃度50%

11、,料液比1:2,浸提時間2h 。用HPLC 檢測兩種提取方法所得的樣品GSH 純度,從譜圖可以看出,乙醇提取所得樣品雜峰相對較少,純度達(dá)19.86%,優(yōu)于熱水提取法。雖然乙醇提取法較熱水提取法提取時間長,但料液比較小,可有效地減小下一步過濾,濃縮的工作量,無需加熱,提取GSH 損失少,蛋白質(zhì)、色素、核酸等雜質(zhì)溶出少,所得樣品純度較高,有益于后續(xù)的分離純化,并且乙醇可回收利用,降低了成本。實(shí)驗(yàn)表明乙醇提取法是一種有效的提取谷胱甘肽的方法。參考文獻(xiàn):1Penninckx M.A short review on the role of glutathione in the response of y

12、east to nutritional,environmental,and oxidative stressesJ.Enzyme Microb Technol,2001,26(9-10:737-742.2鄭建仙,功能性食品M.北京:中國輕工業(yè)出版社.1995.3林金萍,李華鐘,李寅等.中國醫(yī)藥工業(yè)雜志J.2000,31(5:236-239.4周楠迪,李寅,陳堅.從酵母細(xì)胞中回收谷胱甘肽J.1997,7(4:30-33.6潘飛,邱雁臨,黃欣.啤酒廢酵母中還原型谷胱甘肽的抽提新方法探討J,2005,15(4:50-52.7劉娟,王雅琴,劉剛,張博潤.發(fā)酵液中還原型谷胱甘肽三種測定方法的改進(jìn)及其比較J.2004,31(3:35-38.8張錦,鄒玉明,張小松等.反相高效液相色譜法測定還原型谷胱甘肽制劑的含量J.2005,14(12:41-41.9范崇東,王淼,徐榕榕.熱水提取酵母中谷胱甘肽的條件優(yōu)化J.2004,25(2:132-135.培養(yǎng)基滅菌時,為什么采用高溫短時間的方法能減少營養(yǎng)成分的破壞根據(jù)化學(xué)反應(yīng)動力學(xué)理論,在活化能大的反應(yīng)中,反應(yīng)速度隨溫度變化也大。反之,如果某一反應(yīng)的活化能非常小,那么該反應(yīng)的速度隨溫度