實驗十-50L發(fā)酵罐的使用——發(fā)酵過程與控制(共5頁)

1、精選優(yōu)質文檔-傾情為你奉上實驗十 50L發(fā)酵罐的使用發(fā)酵過程與控制生物工程132 鄧信任1、 實驗目的認識全自動生物反應器的安裝和準備，反應后的拆卸和清洗等；了解pH電極和溶氧電極（DO）的結構及基本原理；掌握pH電極和溶氧電極的校正方法；認識發(fā)酵罐培養(yǎng)基的滅菌，認識反應器在位高壓滅菌的方法和規(guī)程，學會反應器培養(yǎng)液滅菌過程中的升溫、保壓、降溫和培養(yǎng)溫度的設定等操作；掌握接種的方法及操作，確保發(fā)酵液無雜菌污染；掌握pH調節(jié)劑、消泡劑及補料的連接方法；學會從反應器中定時取出樣液的方法；學會如何進行參數(shù)控制并掌握正確使用先進反應器發(fā)酵生產(chǎn)的方法，從而可對中試級中試以上的發(fā)酵生產(chǎn)研究有一個初步的概念和

2、感性認識。2、 實驗原理1.安裝和拆卸反應器為碟形，上蓋可以自動起降，與罐體通過橡皮墊圈和螺栓密封。蓋上設有攪拌電機、攪拌軸、機械密封及多個接口（接種口、空氣進口、尾氣出口、各種檢測儀表的插孔、消泡劑和酸堿液注入口、補料口、備用口、壓力表等）；罐體設有夾套層，用以加熱或冷卻；罐內有攪拌槳葉、擋板、空氣分布器；中部側面裝有溫度傳感器、溶氧電極和pH電極插口及取樣口；與罐體連接的部分布有無菌空氣系統(tǒng)，并配備一臺自動調控裝置。整個裝置處于工作狀態(tài)時，必須保持無菌，而操作結束后，必須移走培養(yǎng)液并清洗罐體等。2.pH電極的校正待校正的pH電極是由氯化銀參比電極和玻璃電極組合在一起的復合玻璃電極。復合電極

3、的內層玻璃管與玻璃球泡相通，內充以恒定pH的標準緩沖溶液，從中引出氯化銀電極導線，組成玻璃電極（即指示電極）。在外層玻璃管引入銀絲，其表面覆蓋一層氯化銀薄膜。從上部擴大部分邊上的注液口加入飽和氯化鉀溶液，即形成氯化銀電極，在外玻璃管的下部開有一小口，裝有多孔陶瓷芯，使氯化鉀溶液可稍往外溶液滲漏，即所謂的液絡部。復合電極的基本性能參數(shù)有電極轉換系數(shù)（也稱Nernst斜率）、電極零電位、電極內阻、參比電阻、電極響應時間、耐高溫沖擊的次數(shù)等，它們都有一定的要求和測試方法。新使用的電極或已經(jīng)發(fā)酵運行一段時間的電極，其性能參數(shù)會發(fā)生變化，對某些性能參數(shù)要進行測定，決定是否可投入使用。3. 溶氧電極的校正

4、電解型電極是由一個陰極（貴重金屬如鉑或金）、一個陽極（Ag/AgCl）和一種電解質（如中性NaCl溶液）組成的（圖1）。在某一榮溶氧濃度一定的溶液系統(tǒng)中，通過電極之間0.60.8V的電壓，使溶解氧在陰極上被還原，從電極的電流電壓極譜圖（圖2a）中可以看出，OA為極譜殘余電流；A點為氧的分解電壓，當外加電壓大于分解電壓A時，電極輸出電流I隨著外加電壓而增加，當達到B點后，電極電流就不再隨著外加電壓增大而增加，即電極電壓進入恒定區(qū)，此時稱為飽和電流或擴散電流。當外加電壓繼續(xù)增至C點時，電極輸出電流迅速增加，這是由水被還原成氧造成的。從圖2b中也可以看出，飽和電流與溶氧濃度呈正比關系。因此，只要把外

5、加電壓固定在電流電壓圖中的平坦部分，電極輸出電流就可以校正測量溶解氧，這個固定電壓常選為0.60.8V。 反應式為： 陰極：O2+2H20+2e-H2O+2OH-H2O2+2e-2OH-陽極：Ag+Cl-AgCl+e- 總反應：4Ag+O2+2H2O+4Cl-4AgCl+4OH-用NaCl或KCl作為電解質，在使用過程中電解質被消耗，必須在一段時間后補充。4. 反應器培養(yǎng)液的滅菌與接種培養(yǎng)生物反應器的滅菌時采用夾套層蒸汽預熱后直接或間接通入飽和蒸汽滅菌的方式進行的，可將反應器內培養(yǎng)液的溫度升至121，以達到滅菌的效果。滅菌后的培養(yǎng)基冷卻至培養(yǎng)溫度后，即可接種培養(yǎng)。接種時，嚴格按照無菌操作進行，

6、避免雜菌污染。5. 補料、取樣生物反應器的補料（酸堿、消泡劑及其他營養(yǎng)液）可通過蠕動泵進行，可自動也可手動；取樣時了解發(fā)酵過程的重要手段，取樣時，嚴格按照無菌操作進行，避免雜菌污染。3、 實驗步驟1. 準備工作首先擰下螺栓，啟動自動升降機，打開上蓋，檢查培養(yǎng)罐內部是否清洗干凈。插入校正完畢的pH電極和氧電極與罐側面相關位置，并與控制連接。加入配置好的培養(yǎng)液，加蓋并對稱地擰緊螺母，直至上蓋被密封固定。安裝安全閥、泡沫傳感器、觀察燈、壓力計、取樣管及空氣過濾器等，剩余的孔洞需用硅膠塞擰緊備用。使用完畢后拆卸時與以上步驟相反，并徹底清洗罐體及零件。2. pH校正此步驟必須于發(fā)酵罐滅菌前先校正，再將電

7、極插入罐內。（1） 將電極置入零點標準液里（7.00），看pH穩(wěn)定后按7.00（ZERO下方）。此時pH顯示值（PV）會顯示7.00（2） 將電極用純水洗滌，置入標準液里（4.00），看pH穩(wěn)定后按4.00鍵（SPAN下方）。此時pH顯示值（PV）會顯示4.00（3） 將電極置入標準液里（7.00），看pH之量測值是否顯示正確。（4） 如尚有誤差，請重復（1）、（2）步驟。注意：用于發(fā)酵過程中經(jīng)取樣量測。如發(fā)現(xiàn)與顯示值有偏差，請調整使顯示值正確。此數(shù)值乃將取樣量測值減顯示值之誤差量輸入。3. DO校正此步驟必須于發(fā)酵罐滅菌后罐內溫度穩(wěn)定時才能進行。（1） 將電極訊號線接頭拆開，看DO之量測值穩(wěn)

8、定后按0鍵（ZERO下方）。DO顯示值會顯示0.0。（2） 將電極訊號線接頭街上，槽內通氣至飽和?？碊O之量測值穩(wěn)定后按100鍵（SPAN下方）。此時DO顯示值會顯示99.9。（3） 將電極訊號線接頭拆開，看DO量測值是否顯示正確。（4） 如尚有誤差，請重復（1）、（2）步驟。注意：用于發(fā)酵過程中經(jīng)取樣量測。如發(fā)現(xiàn)與顯示值有偏差，請調整使顯示值正確。此數(shù)值乃將取樣量測值減顯示值之誤差量輸入。4. 反應器的滅菌和發(fā)酵1） 滅菌此系統(tǒng)在滅菌狀態(tài)前需將滅菌的條件作業(yè)準備妥當，包括以下幾個方面：（1） 罐體洗干凈后將頂板降下并鎖緊（切記此步驟完成后方可將控制啟動）。（2） 再次確定頂板蓋是否已完全緊密

9、，各接口是否已安裝上并鎖緊，空氣過濾器是否已安裝或確定可用。（3） pH先行校正完成并插入槽內，DO電極插入槽內（DO滅完菌后溫度至發(fā)酵溫度后再校正）。（4） 將培養(yǎng)基裝入罐內，并確認容量足夠高于各感測電極。（5） 加料液及管件是否已事先滅菌準備完成。（6） 頂板不用的接口是否已拴緊。（7） 檢查電極孔及取樣口是否已定位鎖緊，各供應源是否已準備好（空氣、冷卻水、蒸汽）。（8） 完成上述所有步驟后即可開始滅菌。確定所設定滅菌條件正確后，將攪拌、溫度、流量控制開關啟動，開啟滅菌開關開始滅菌。滅菌完成后系統(tǒng)會自動冷卻，待冷卻程序完成后系統(tǒng)會警報警示。之后將系統(tǒng)切至發(fā)酵即可開始發(fā)酵。2） 接種與培養(yǎng)通

10、入反應器的空氣從空壓機經(jīng)空氣過濾器而成無菌空氣，再由空氣分布管送入滅過菌的培養(yǎng)罐內。在控制臺上，設定所需的攪拌轉速、發(fā)酵溫度、pH，并將空氣流量計的流量調至確定值，DO校正。將事先培養(yǎng)好的培養(yǎng)液（在三角瓶中進行搖床培養(yǎng)，處于對數(shù)生長期的細胞，以無菌操作方式倒入已滅菌的、帶有插在保險管套筒內的注射針及軟管的三角瓶內；或直接倒入三角瓶種子）由接種口接入罐內。接種時，要在接種口的隔膜周圍放上浸有乙醇的棉花或用13ml乙醇覆蓋，點燃，以產(chǎn)生上升的氣流來防止雜菌污染。接種塞從無菌筒內取出，然后將接種針穿過火焰和隔膜，慢慢插入中心部位，擰緊連接螺帽，直至插入部分固定。接種量大體上是培養(yǎng)液的百分之幾。5.

11、補料、取樣當調節(jié)pH和泡沫時，可將酸液或堿液及消泡劑裝入三角瓶，滅菌后，分別經(jīng)蠕動泵與反應器連接，補料與之相同。這樣，通過控制臺的自動控制，就可以自動地連接流加。為了了解培養(yǎng)過程中反應物的變化，必須定時進行取樣。取樣前，要先Udine取樣口進行滅菌后再取樣；取樣時關閉排氣口，使罐內處于正壓狀態(tài)，打開取樣口，培養(yǎng)液即可自動流出。但是，在下次取樣時，必須注意將殘夜放干凈后再取樣。四、思考題（1） 為什么pH電極在生物反應之前要進行校正？答：因為要對PH電極的零電位和斜率標定后測量才準確。校正其電極，保持其反應靈 敏度，之后的測量更加準確。pH 電極使用一段時間后，不對稱電位將會發(fā)生很大改 變，故必

12、須定期校準。在下列情況下，必須重新校準：a、長期使用的電極基新?lián)Q的電極。b、測量濃酸（pH 2）以后，或測量濃堿（pH12）以后。c、測量含有氟化物的溶液或較濃的有機溶液后。d、被測溶液溫度與標準溶液溫度（或室溫）相差過大時。 對新使用的電極或已經(jīng)發(fā)酵運行一段時間的電極，其性能參數(shù)要發(fā)生變化，對某些性能參數(shù)要進行測定，決定是否可投入使用。因為在經(jīng)過使用后，標準緩沖液的濃度會發(fā)生變化等。每使用過一次，標準緩沖液也會發(fā)生細微變化，因為緩沖液和發(fā)酵液在測試時，會發(fā)生交換。緩沖液濃度，成分等會改變。因而，pH指示不是真正的標準值。因而，pH電極在生物反應之前要進行矯正，通常選取pH=4,pH=7進行矯

13、正。而首次使用前需要給其進行電極通電，進行火化。（2） 在pH電極的校正操作過程中應注意哪些注意事項？ 答：1.認真地在發(fā)酵罐中安裝好PH電極，安裝過程時，切忌將電極薄膜碰撞到發(fā)罐管壁等。2、根據(jù)發(fā)酵液的pH確定電極矯正的pH矯正，一般是pH=4,pH=7。3、矯正前要確保標準液，如pH=4的標準液沒有被污染，盡量混勻。4、在不同的標準液進行矯正前，先用純水清洗一下，以免相互影響。5、pH電極一般進行多次矯正。（3） 為什么在生物反應之前要對DO電極進行校正？是否每次反應都必須校正？為什么？ 答：因為在測量發(fā)酵液的溶氧量時，也會發(fā)生電解液和發(fā)酵液的進行交換等，這樣會導致電解液的變化，從而導致溶氧電極的測定也會出現(xiàn)誤差。所以，在生物反應之前要對Do電極的矯正。 每次反應都要進行矯正，因為溶氧電極在不同罐內測定有不同的罐壓，同時，