心肌梗塞病患者紅細胞膜粘彈性的實驗研究

1、    心肌梗塞病患者紅細胞膜粘彈性的實驗研究        本文采用微管吸吮實驗技術研究了正常健康人與心肌梗塞患者紅細胞在吸進微管的變形過程，采用二維Kelvin模型擬合實驗結果，定量地比較了正常人與心肌梗塞患者紅細胞膜的粘彈性，結果表明：心肌梗塞患者紅細胞膜的彈性模量(5.72±1.77)×10-1dyn/cm)與正常人(5.36±0.56)×10-1dyn/cm)無十分明顯差異，而粘性系數(shù)(4.39±1.72)×

2、;10-4dyns/cm)明顯高于正常健康人(1.91±0.96)×10-4dyns/cm)紅細胞粘滯性增大，變形能力降低，這可能正是造成患者心肌供血不足，以致梗塞的主要因。關鍵詞： 心肌梗塞；紅細胞膜；彈性模量；粘性系數(shù)；微管吸吮分類號： R318.01; R331.1+41EXPERIMENTAL STUDIES ON VISCOELASTIC PROPERTIES OFERYTHROCYTE MEMBRANE OF MYOCARDIAL INFARCTIONLi Zishuang, Huang Lan(Physics Department of Guangxi Uni

3、versity, Nanning 530004)Zhang Xianquan(Mathematics Department of Guangxi Teachers University, Guiling 541004)Cai Shaoxi,Wu Yunpeng(Bioengineering Institute of Chongqing University, Chongqing 400044)ABSTRACTThe deformation of a portion of erythrocyte during aspiration entry into a micropipette was an

4、alyzed, the experiment results was worked out by two-dimensional Kelvin model, and the viscoelastic properties of erythrocyte membrane of the myocardial infarction patients was quantitatively compared with those of the normal people. The results showed that the erythrocyte membrane elastic modulus o

5、f myocardial infarction patients(5.72±1.77)×10-1dyn/cm was almost the same as that of the normal people(5.36±0.56)×10-3dyn/cm), but the erythrocyte membrane viscosity of the myocardial infarction patients(4.39±1.72×10-4dyns/cm) was significantly higher than that of the

6、normal people(1.91±0.96×10-4dyns/cm)dyn/cm). The deformation of erythrocyte of myocardial infarction patient was reduced and the viscoelasticity increased. These changes caused the blood supply insufficient and myocardial infarction.Key words:Myocardial infarction; Erythrocyte membrane; El

7、astic modulus; Viscosity; Micropipette aspirate0引 言紅細胞力學性質(zhì)的最大特點是它能夠在保持其表面積恒定或變化很小的情況下發(fā)生很大的變形。這使得紅細胞在通過微血管時可發(fā)生各種形狀的變形，以保障微循環(huán)的暢通，又不因此而減小其與外界進行氣體交換的面積，保證新陳代謝正常進行。不論紅細胞在微血管中的變形如何顯著，一旦進入大血管或處于靜止狀態(tài)，則可在很短的時間內(nèi)恢復原狀。這說明紅細胞可以看作是一彈性體，彈性越好，變形能力越強。但紅細胞的彈性只表現(xiàn)在有效的應力范圍內(nèi)，在較廣的應力范圍內(nèi)，紅細胞是既有彈性，又有粘性的粘彈性體，甚至在極高的應力下表現(xiàn)出粘塑性的特

8、征1。紅細胞膜的生物物理特性在細胞的各種特性中起著十分重要的意義，而由于紅細胞相對容易收集2，3，所以我們常用紅細胞膜作為研究膜的生物物理特性的模型，由于它們在健康和病理的血液流動中起重要作用。所以，紅細胞膜的粘彈性是我們特別感興趣的領域。微玻璃管吸吮實驗技術是本世紀70年代中末期開始發(fā)展起來的一種研究單個細胞或細胞對的變形和粘附的重要手段4，5，它是用一根直徑很細的微管采用負壓，把細胞膜的一部分吸進管內(nèi)。從實驗中可以測出被吸入部分長度，以吸入長度和負壓的相應關系來分析計算出紅細胞膜的彈性系數(shù)和粘性系數(shù)，以說明膜的力學特性和細胞間的相互作用。由于紅細胞結構的簡單性及變形過程的典型性，愈來愈多的

9、學者采用包括微管吸吮技術在內(nèi)的多種手段，在紅細胞變形的時間過程、理論模型等方面進行了大量的研究1，5。本文采用微管吸吮技術，定量地討論了心肌梗塞病患者紅細胞膜的粘彈性。1微管吸吮實驗器材及方法1.1試劑PBS液(NaCl,13.7931g;Na2HPO4.12H2O,15.2681g;KH2PO4,1.3609g;蒸餾水，2000ml;pH7.4，用2m濾膜過濾)，0.9%生理鹽水，10%的NaOH溶液。1.2試樣心肌梗塞病患者20例：5070歲，均為男性，由重慶市中醫(yī)研究所提供；正常對照組血液10例：5065歲，均為男性，由重慶市中醫(yī)研究所提供。1.3器材烘箱及消毒蒸鍋，小腔室(Chambe

10、r),油鏡(100/1,30)，拉針器(SUTTER INSTRUMENT CO.U.S.A MDEL P-87)，顯微鏡(GLIB2-74WB)，計算機監(jiān)視系統(tǒng)，(CONTRON ELECTRON IC VIDAS)，倒置顯微裝置(OPTON AXLDVERT 35)，微操作器(配套)(EPPEND ONF MICROMANIPULATOR 5110)，光源，壓力系統(tǒng)(計算機、步進電機)，微量注射器，微玻璃管(中科院上海腦研所)。1.4實驗方法1.4.1微管準備調(diào)整拉針器內(nèi)部程序，直至將管子拉制直徑為1.8m左右的微管，要求管尖平整光滑，變化梯度不宜太大。制好的微管中用微量注射針灌滿過濾的P

11、BS液，在光學顯微鏡下觀察，要求不得有任何一個小氣泡或雜質(zhì)夾在管內(nèi)。1.4.2壓力系統(tǒng)準備壓力系統(tǒng)內(nèi)液為0.9%的生理鹽水。排出管道中的所有氣泡，將充滿液體的微管裝在夾針頭上，其管口大的一端和壓力系統(tǒng)相聯(lián)，再經(jīng)過夾針頭固定于微操作器上。壓力通過計算機控制步進電機，以調(diào)整兩個玻璃瓶高度差來實現(xiàn)。實驗過程中，只要操作計算機就可自動得到預想的壓力值(調(diào)整壓力時，先和微管處切斷)。1.4.3紅細胞準備從受試者靜脈抽取血液1ml，肝素抗凝混合均勻。離心5min，轉(zhuǎn)速2000rpm，傾去血清及白細胞等懸浮物，用PBS液洗滌3次，最后配成一定濃度的紅細胞懸浮液。1.4.4紅細胞在微管中的變形和恢復過程打開光

12、源，將灌好PBS液的針在微操作器上裝好，并調(diào)節(jié)零點壓力，使管內(nèi)外壓力平衡，將準備好的血樣懸液約0.5ml注入一特定圓形小腔(Chamber)內(nèi)，置于倒置顯微鏡操作平臺上，放在油鏡上觀察，象同時通過攝像鏡頭、錄像機、監(jiān)視器相聯(lián)，記錄實驗中紅細胞變形，其結構框如1。1微管吸吮系統(tǒng)結構框特別小心地操作微操作器，先使微管進入小腔室(Chamber)，再慢慢調(diào)整，使管尖和Chamber內(nèi)的細胞處于同一平面上，并且使微管位置處在監(jiān)視屏中。調(diào)整零位壓力器，使管尖處細胞不吸入微管，也不被吹移離開微管，此時零位調(diào)節(jié)完畢。關閉零位調(diào)節(jié)器和微管處的壓力開關，接通零位調(diào)節(jié)器和連接瓶的壓力，將壓力置于預想值，同時打開微

13、管處的壓力開關和記錄鍵，記錄細胞吸進微管過程，攝制完后，輕放壓力，準備另一個細胞的吸吮過程。所有實驗均在20左右進行，約4h完成。1.4.5計算與統(tǒng)計分析在微管吸吮試驗中，紅細胞變形分析是基于在一個無限大平面上，紅細胞膜的一部分被吸入到半徑為Rp的管子里，并假定在紅細胞膜變形的每一時刻均處于動態(tài)平衡狀態(tài)，膜張力在管口邊緣連續(xù)，管口摩擦力可忽略不計。參照Chien等半球狀帽子模型理論5，用Kelvin模型擬合實驗結果，該模型由一個模量為的彈性元件和一個系數(shù)為的粘性元件并連而成。設在t時刻紅細胞膜被吸進微管長度為Dp，在2s的記錄時間內(nèi)所達到的最大長度為Dpm，則有5：(P)Rp/=2Xm-1+L

14、n(2Xm)(1)=-a/4dLn(Dpm-Dp)/dt(2)=(3)式中，為所施加的階躍負壓，Rp為微管內(nèi)半徑，Xm=Dpm/Rp,為所記錄變形過程的時間常數(shù)，a為在區(qū)間1,Xm內(nèi)(1)式線性擬合所得的常數(shù)。即：(P)Rp/=2Xm-1+Ln(2Xm)=aX+b(4)方程(4)被擬合為5：a=2.45,b=-0.603=-1/1.633d(LnDpm-Dp)dt(5)由以上5式計算求得彈性模量，時間常數(shù)和粘性系數(shù)作為表征紅細胞粘彈性的客觀物理量。統(tǒng)計處理采用兩樣本均數(shù)的t檢驗。2實驗結果及討論2.1微管吸吮紅細胞的動態(tài)過程記錄電視攝像記錄系統(tǒng)的象通過回放入象處理系統(tǒng)測出其吸入長度Dp，管子內(nèi)

15、徑Rp，確定各點的時間及對應的壓力值。2是一個典型的患者紅細胞在一定階躍壓力作用下在微管里變形的時間序列。2.2紅細胞膜的彈性模量在穩(wěn)定的狀態(tài)，Dp最大值定義為Dpm(Dpm是吸吮壓力，微管內(nèi)徑Rp及紅細胞膜彈性模量的函數(shù))，從使用不同P和Rp得到穩(wěn)定狀態(tài)的應力應變數(shù)據(jù)，從而得到無綱量的變形參數(shù)Dpm/Rp和P(Rp)關系。在3中為患者血樣的Dpm/Rp和P(Rp)關系，兩曲線分別為理論曲線和實測數(shù)據(jù)。結果表明：當Dp/Rp1時，Dpm/Rp和P(Rp)幾乎成線性關系，在每一點上都可比較Dm/Rp和P(Rp)而得到。通過計算，我們可以得到不同血樣下細胞膜的彈性模量。2患者紅細胞在一定階躍壓力作

16、用下在微管里變形時間序列3穩(wěn)定狀態(tài)，無量綱變形量Dp/Rp和P(Rp)關系4紅細胞變形過程中無量綱量吸入長度Dp/Rp對無量綱量(t-t1)/D1的關系2.3加載期間紅細胞膜的粘彈性在微管吸吮實驗中，紅細胞在微管中的整個變形分為兩個階段。第一階段是快速的變形過程，通常短在1s之內(nèi)，接著，變形緩慢進行到最后狀態(tài)Dpm(大約時間20s左右)。由于整個變形的95%以上發(fā)生在第一階段，故我們考慮快速變形過程。由方程(5)，我們可得到快速變化的時間常數(shù)m:m=-1/1.633dLn(Dpm-Dp)/dt取Dp/Rp=1,D則為D1。D1隨Dpm/Rp變化而變化。為了消除管徑初始時間影響，采用Dp/Rp來

17、表征吸入長度，用(t-t1)/D1來表征時間，二者都為無量綱量，則Dp/Rp與(t-t1)/D1的關系，表示了紅細胞的變形過程這一動態(tài)過程，同時亦表征了紅細胞的變形能力(見4)?？焖僮兓A段紅細胞膜的粘性系數(shù)計算為：D1=D1表1為實驗數(shù)據(jù)計算所得的紅細胞膜的彈性模量，粘性系數(shù)，表中同時給出了各組細胞的幾何尺寸及變形過程的時間常數(shù)。表1心肌梗塞患者及正常人紅細胞膜的彈性模量，粘性系數(shù)，時間常數(shù)及幾何尺寸d(m)(10-3dyn/cm)(10-4dyn.s/cm)(Sec)正常人1.101.305.36±0.56n=201.91±0.96n=200.018±0.00

18、60.0050.034患者1.041.305.27±1.77n=404.39±1.72+n=400.045±0.016+0.0120.106d：微管內(nèi)徑；與正常人比較：+P<0.001,+P<0.01 3討論微管吸吮實驗使我們能動態(tài)地定量地分析紅細胞在階躍負壓下吸吮進微管的變形過程及在撤消階躍負壓時的恢復過程。在吸吮過程中，大部分變形發(fā)生在初始階段(即快速變化階段)，大約在1s以內(nèi)，1s以后變形緩慢，大約在20s后達到穩(wěn)定狀態(tài)，不再發(fā)生變形?？焖匐A段的時間常數(shù)D1與無量綱量吸吮長度(Dm/Rp)成反比。D相對應，由于=D，所以，在快速變形階段紅細胞膜的

19、粘性系數(shù)(D1)亦與(Dpm/Rp)成反比。提高(Dm/Rp)意味著提高無量綱量壓力參數(shù)P(Rp)/(見2)。表明隨著應變率提高，紅細胞膜粘性系數(shù)隨之下降。紅細胞變形性是紅細胞重要的流變特性之一，它取決于紅細胞的粘彈性，紅細胞內(nèi)粘度以及由紅細胞表面積/體積的比值及紅細胞的幾何形狀。以微管吸吮技術定量地區(qū)別反映影響紅細胞變形的諸多因素時，一個重要條件是所用的微管內(nèi)徑控制。使用微管內(nèi)半徑若在0.51m，則實驗結果基本上反映紅細胞膜的粘彈性，而如果使用的內(nèi)徑接近3m，則實驗結果主要反映紅細胞表面積/體積的相對關系。我們實驗所使用的管內(nèi)半徑在1m以內(nèi)，基本上反映了紅細胞膜的粘彈性。彈性模量是指產(chǎn)生非軸

20、向伸展所需的力，其值愈大，表明硬度愈大。粘性系數(shù)指的是細胞膜受力發(fā)生變形反應或外力撤消后形成的恢復時間依賴性，所需時間越長，其表面粘性系數(shù)愈大。實驗結果表明：心肌梗塞患者血樣紅細胞粘性系數(shù)明顯高于正常人，說明患者紅細胞滯性增大，變形性降低。這也正是患者客觀流變學指標測定中的粘度及粘彈性明顯高于正常值的原因之一。其粘性系數(shù)的增高還可能與細胞膜有關6，7。而患者的紅細胞膜彈性模量和正常紅細胞比較無明顯差異，其原因還待進一步研究，對恢復期的細胞粘彈性亦可作進一步研究。細胞力學的研究是當前生物力學研究中的前沿課題之一，我們的研究是在前人基礎上作了一些工作，還存在許多問題需要進一步解決，在建立微管吸吮實

21、驗的理論模型中，沒有考慮細胞膜與微管間的摩擦力。而且本文的分析是采用了小變形模型來分析細胞的力學特性，事實上在實驗中，細胞在微管內(nèi)可以測量的變形相對于初始形已經(jīng)較大，小變形理論只能是一種近似的分析實驗數(shù)據(jù)的簡單方法。由于細胞的實際變形往往較大，無論是被動變形還是主動變形，所以應進行大變形分析，需進一步引入生理的邊界條件，建立更完善的細胞變形模型。李自雙（廣西大學物理系，南寧 530004）黃蘭（廣西大學物理系，南寧 530004）張顯全（廣西師范大學數(shù)計系，桂林 541004）蔡紹皙（重慶大學生物工程研究院，重慶 400044）吳云鵬（重慶大學生物工程研究院，重慶 400044）4參考文獻1，Chabanel. A, et al. Viscoelastic properties of red cell membrane in hereditary elliptocytcosis, Blood, 1989,73(2):5925952，Sato M, et al. Application of the m