4、實驗方法總結(jié)(4)：組織水平部分_修正版

1、修正版實驗方法總結(jié)(4):組織水平部分1、免疫組化1.1 SP 法1.2雙層夾心ELISA法1.3膠體金法2、HE染色3、原位雜交1、免疫組化 1.1 SP 法 單克隆抗體 MMP-2、MMP-9,SP試劑盒購自ZYMED公司(1 100)。 3%巴02封閉內(nèi)源性過氧化物酶，微波加熱抗原修復(fù)，10%正常羊血清孵育，滴加一抗，4C冰 箱 中過夜,PBS 緩沖液（Na 2 HP O4 8.1 mmol/L,KH 2 PO/W mmol/L,NaCI137mmol/L, 2.7 mmol/L pH 7.4)振蕩清洗后分別滴加二、三抗 QAB顯色，蘇木素復(fù)染,常規(guī)封片。LM1.2雙層夾心ELISA法以

2、純化后的多克隆抗體作為捕獲抗體，以本實驗室已經(jīng)制備的抗Internalin A單克隆抗體3R6為檢測抗體，建立雙抗夾心 ELISA方法。具體步驟如下：多克隆抗體稀釋液 f洗板3次f 3% BSA封閉f洗板3次f待測菌稀釋液f洗板3次f單克隆抗體稀釋液 f洗板4次f酶標(biāo)羊抗鼠IgG f洗板5次-TMB顯色液 T終止液-測定 OD450值抗體、抗原和 BSA稀釋液均為 0.01mol/L、pH7.4PBS。洗板 液為含 0.1% Tween-20 的 0.01 mol/L、 pH7.4PBS（PBST）。結(jié)果判定：以（測定孔OD值空白對照孔OD值）/（陰性對照孔OD值一空白對照孔 OD值）>

3、 2.1（即P/N > 2.1）時判斷為陽性。1.3膠體金法 器皿洗滌準(zhǔn)備，將錐形瓶等實驗所用的玻璃器皿放入由重鉻酸鉀和濃硫 酸配制的酸液中浸泡 48 h，取出后用蒸餾水反復(fù)沖洗，并用超純水漂洗34次,烘干待用。膠體金的制備膠體金熬制方法參照文獻(xiàn)采用檸檬酸三鈉還原法制 備膠體金，具體方法步驟如下：在含有99 mL超純水的干凈錐形瓶中加入 1 mL 1%氯金酸溶液，配制成100 mL 0.01%氯金酸溶液；用恒溫電磁力攪拌器不斷攪拌加熱沸騰；氯金酸溶液煮沸后快速加入 1%檸檬酸三鈉并不斷攪拌，溶液顏色變成紫紅色后，繼續(xù)回流10 min后停止加熱，冷卻至室溫，存放 4 °C冰箱備用

4、。膠體金標(biāo)記抗克倫特羅單克隆抗體膠體金標(biāo)記抗體制備金標(biāo)抗體探針的方法參照文獻(xiàn)進(jìn)行：取適量熬制好的膠體金溶液至燒杯中，用0.2 mol/L K 2CO 3溶液調(diào)節(jié)膠體金溶液 pH至6.0，超純水溶解抗體至膠體金 1/10體積，并逐滴加入膠體金溶液，攪拌反應(yīng)30 min （抗體標(biāo)記濃度分別為0.5他/mL、1 pg/mL以及2 pg/mL ），然后按膠體金1/10體積逐滴加入10% BSA，攪拌封閉30 min，繼續(xù)按膠體金1/10體積逐滴加入1% PEG 20000，攪拌封閉30 min后，9000 rpm 離心30 min，吸去上清后加入原體積 1/10的復(fù)溶液（含 1% BSA、2%蔗糖、0

5、.05% PEG20000、0.1% NaN 3 的 pH 7.4 0.02 mol/L 的磷酸鹽緩沖液）重懸金標(biāo)抗體。 CLE膠體金試紙條免疫反應(yīng)動力學(xué)分析在陰性混合豬尿中添加 CLE標(biāo)準(zhǔn)品至濃度分別為0、0.2、0.5、1.0 ng/ml,分別取70pl加入試紙條加樣孔，膠體金讀數(shù)儀每隔30S測定試紙條T、C線值以及T/C比值，跟蹤記錄加樣后 30 min。并以T、C線值以及T/C比值為縱坐標(biāo)，時間為橫坐標(biāo)，繪制動力學(xué)曲線，觀察試紙條T、C線值，T/C比值隨濃度和時間的變化。以動力學(xué)曲線變化間接反應(yīng)試紙條 T、C線上抗原抗體免疫學(xué)反應(yīng)。2、HE染色 1.脫蠟：二甲苯I脫蠟10min左右（自

6、動染色機(jī)染10min人二甲苯nm脫蠟5min左右（自動染色機(jī)染10min ）;無水酒精（乙醇）I洗去二甲苯1min（機(jī)染1min ）；無水酒精（乙醇）n洗去二甲苯 1min （機(jī)染1min ）；95% 酒精1min （機(jī)染1min ）；85%酒精1min （機(jī)染1min ）；自來水洗片刻（機(jī) 染1min ）。2.染色：蘇木素染色15min左右（機(jī)染15min ）；自來水洗 片刻（機(jī)染1min ）;1%或0.5%或0.25%鹽酸水分化35s （機(jī)分化30s）; 自來水洗，溫水藍(lán)化片刻（機(jī)洗5min ）；伊紅酒精染液浸染20s2min （機(jī)染30s5min ）。3.脫水、透明、封固：85%的酒精脫

7、水20s （機(jī)染20s）;95% 的酒精1min （機(jī)染1min ）；無水酒精I(xiàn)染12min （機(jī)染2min ）；無水酒 精n染2min （機(jī)染2min ）；二甲苯I浸2min （機(jī)染2min ）；二甲苯n浸2min （機(jī)染2min ）；中性樹膠或加拿大樹膠封片。3、原位雜交鎖核酸探針熒光原位雜交(Fluoresce nee In situ hybridizatio n, FISH )及免疫 熒光雙標(biāo)于同一切片行 miR-129-5 p和I型膠原及整合素 a1的雙標(biāo)染色冰凍切片充分干燥后 DEPC-PBS潤洗，0.3%的TritonX100浸泡10分鐘，20卩 g/ml蛋白酶k消化5分鐘，DE

8、PC-PBS漂洗2次，每次5分鐘，加入雜交液（由 SSC、blocki ng reage nt 、Formamide、NLS、SDS 構(gòu)成）與 60 E 預(yù) 雜交1小時，加入 miR-129-5p LNA 探針（20nM ）, 83度變性5分鐘，53C孵育 20 小時，預(yù)熱至 60C的 Wash Buffer （由 SSC、Formamide、NLS 構(gòu) 成）沖洗 2遍，遍 20分鐘，RNase buffer室溫孵育 5分鐘，含 20卩 g/mlRNsae A 的 RNase buffer37 E孵育半小時，2 X SSC 0.1%NLS 37 E 20分鐘 2 次，0.2 X SSC 0.1%NLS 37 E 20 分鐘 2 次，TB（由 Block ing reage nt 、Tris-HCI、NaCl溶液構(gòu)成）室溫孵育1小時，加入POD-DIG及免疫熒光用的一抗（I型膠原或整合素a 1）室溫過夜，TS9.5（ Tris-HCI、NaCl、MgCl 2構(gòu)