鄂產(chǎn)魔芋中葡甘露聚糖的含量測定

1、鄂產(chǎn)魔芋中葡甘露聚糖的含量測定        【摘要】  目的 優(yōu)化3，5-二硝水楊酸（DNS）比色法檢測魔芋葡甘露聚糖并測定鄂產(chǎn)魔芋中葡甘露聚糖的含量。方法從葡甘露聚糖的提取方法、檢測波長、顯色時間、DNS添加量、水解酸度和水解時間幾個方面優(yōu)化DNS比色法，利用優(yōu)化后的DNS比色法測定了我省五峰、長陽、利川和南漳等地的魔芋中葡甘露聚糖含量。結(jié)果魔芋精粉、二級精粉、長陽產(chǎn)魔芋、利川產(chǎn)魔芋和南漳產(chǎn)魔芋中葡甘露聚糖含量分別為72.84%,65.25%,49.12%,50.70%和40.77%。結(jié)論不同產(chǎn)地的鄂

2、產(chǎn)魔芋中葡甘露聚糖含量有一定的差異，為今后開發(fā)利用提供了依據(jù)。 【關(guān)鍵詞】  魔芋； 葡甘露聚糖； 3,5-二硝基水楊酸Abstract:ObjectiveTo optimize 3,5-dinotrosalicy (DNS) colorimetry and determine the content of konjac glucomannan in Hubei province.MethodsThe 3,5-dinotrosalicy (DNS) colorimetry was optimized from extraction, wavelength, reaction time

3、, dosage of DNS, acidity and time of hydroolyze. The content of konjac glucomannan in Hubei province was determined by the optimized method.ResultsThe content of Konjac glucomannan from Wufeng, Changyang, Nanzhang, Lichuan was 72.84%,65.25%,49.12%,50.70% and 40.77% respectively.ConclusionThe content

4、 of konjac glucomannan is different from place to place, which is valuable for the future utilization and exploitation.Key words:Konjac；  Glucomannan；  3，5-dinotrosalicy    魔芋原植物名為Amorphophallus rerieri，又稱蒟蒻，屬單子葉植物綱，天南星科耐蔭性多年草本植物。全世界大約有170種，主要分布在亞洲和非洲。我國魔芋資源豐富，有20多種，其中至少13種為

5、我國所特有，是世界上魔芋精粉最大的出口國。據(jù)不完全統(tǒng)計，我國每年生產(chǎn)魔芋約7080萬t。魔芋的球莖中主要含有葡甘露聚糖（Konjac Glucomannan，KGM）、淀粉、生物堿、纖維素和礦物質(zhì)等1，其中KGM是其生理活性主體，它是由葡萄糖和甘露糖通過-（1-4）糖苷鍵和-（1-3）糖苷鍵2連接而成的高分子多糖。近年來，國內(nèi)外研究證實，KGM是一種優(yōu)良的低熱量、低脂肪、高纖維素的水溶性膳食纖維，對營養(yǎng)不平衡有重要調(diào)節(jié)作用。諸多學(xué)者研究表明，KGM具有降血糖，降血脂及逆轉(zhuǎn)脂肪肝、通便減肥、抗癌、增強免疫功能、抗衰老等3保健作用和醫(yī)療功效。    目前，KGM含量測

6、定方法已有一些報道，一般通過酸完全水解KGM后，再以費林滴定法、重量法4、分光光度法57、旋轉(zhuǎn)粘度法8、薄層色譜法9，10、氣相色譜法11和高效液相色譜法12，13進行測定，每種方法都有各自的優(yōu)缺點。其中分光光度法既不需要昂貴的大型分析儀器，結(jié)果準確度又高，而且可應(yīng)用于大型生產(chǎn)。依據(jù)14，DNS比色法是魔芋葡甘露聚糖測定較為理想的方法之一。而DNS比色法中KGM提取方法以及顯色時間、水解酸度等因素對KGM的含量測定也有很大的影響，因此，尋求一種最精確、最簡單、最快速的測定魔芋葡甘露聚糖的方法十分必要。1  儀器與試劑1.1 材料魔芋豆腐、魔芋精粉（五峰杰成魔芋有限公司提供）、生魔芋（

7、長陽、利川、南漳產(chǎn)）。1.2 儀器721分光光度計（上海泰益醫(yī)療儀器設(shè)備有限公司）、S-1100紫外可見分光光度計（韓國新科公司）、85-2恒溫加熱磁力攪拌器（杭州儀表電機有限公司）、微型臺式高速離心機5415D（德國eppendof公司）、KQ5200B型超聲波清洗器（寧波榮順科技儀器廠）、FW177型中草藥粉碎機（天津市泰斯特儀器有限公司）、電熱恒溫鼓風(fēng)箱（上海精宏實驗設(shè)備有限公司）、AL201天平（Mettle-Toledo）、水浴鍋（上海躍進醫(yī)療器械廠）。1.3 試劑DNS，乙醇，硫酸，葡萄糖，甲酸，氫氧化鈉，亞硫酸氫鈉，酒石酸甲鈉，乙醚，石油醚等購自試劑公司，均為分析純。1.4 DN

8、S配制稱取10 g 3,5-二硝基水楊酸溶于蒸餾水中，加入20 g NaOH，20 g酒石酸鉀鈉和500 ml水，加熱溶解后再加入重蒸酚2 g，無水亞硫酸鈉0.5 g，待全部溶解后冷卻，定容至1 000 ml，過濾，濾液于棕色試劑瓶中，放置1周后使用。2  方法2.1  KGM的提取文獻報道15，16魔芋葡甘露聚糖的提取方法有乙醇沉淀法、酸性冷溶法、沸水溶解法和直接酸解法，本文使用同一種魔芋材料，選擇常用的3種提取方法，即水提法、超聲波提取法和甲酸-氫氧化鈉緩沖液溶脹法，在495 nm處測定吸光度，常規(guī)方法出KGM的含量。結(jié)果見表1。    從

9、表1可以看出，甲酸-氫氧化鈉緩沖液溶脹法提取效率最高，與其它兩種方法相比具有顯著差異。比超聲波提取法和常規(guī)水提法所提取的KGM含量分別高5.78%和10.43%。并且從操作過程看，甲酸-氫氧化鈉緩沖液溶脹法簡單快速，它省去了常規(guī)法、超聲水提法中用85%乙醇除去游離還原糖的操作。雖然魔芋粉中的游離還原糖也能與DNS顯色，但通過試樣空白（T白）對照可將其從實驗結(jié)果中扣除。2.2  標準曲線按文獻15方法, 分別取濃度為1.0 mg·ml-1標準葡萄糖工作液0.00，0.40，0.80，1.20，1.60，2.0 ml于6個25 ml容量瓶中，再分別加1.5 ml DNS試劑，搖

10、勻，沸水浴中加熱5 min，立即冷卻，定容至刻度。用1 cm比色皿比色，以空白對照溶液調(diào)零點。在全波長范圍內(nèi)進行掃描，并在常用的4種波長下建立葡萄糖紫外分光光度法標準曲線，結(jié)果表明在505 nm處有最大吸收峰，且線性關(guān)系最好。結(jié)果見表2。表1  3種提取方法結(jié)果比較（略）表2  不同波長下葡萄糖標準曲線的回歸方程和相關(guān)系數(shù)（略）2.3  顯色時間的影響按照文獻16的方法制備KGM水解液，分別取2 ml加入到8只比色管中，再分別加入1.5 ml DNS，在沸水浴上水解不同的時間，然后在505 nm測定其吸光度值。結(jié)果表明DNS與還原糖反應(yīng)的顯色時間達5 min時趨向

11、平衡。2.4  DNS添加量的影響取KGM水解液2 ml加入到8支比色管中，然后分別加入不同體積的DNS，在沸水浴上水解1.5 h，505 nm處測定其吸光度值。實驗結(jié)果表明，DNS添加量為1.5 ml時顯色反應(yīng)完全。2.5  魔芋葡甘露聚糖水解酸度的影響取6支25 ml比色管，分別加入1 ml KGM提取液和不同濃度的H2SO4溶液0.5 ml，沸水浴中水解1.5 h，505 nm處測定其吸光度值。結(jié)果表明水解液中酸度為2N時魔芋中葡甘露聚糖已經(jīng)完全水解。2.6  魔芋葡甘露聚糖水解時間影響取6支25 ml比色管，準確加入1.0 ml魔芋甘露聚糖KGM提取液，分

12、別加入3 mol·L-1 H2SO4 溶液0.5 ml。依次按不同時間在沸水浴中水解，505 nm處測定各水解時間t下溶液的吸光度值，結(jié)果表明沸水浴中水解1.5 h時魔芋葡甘露聚糖即可完全水解。2.7  鄂產(chǎn)魔芋葡甘露聚糖含量的測定1         取魔芋粉200 mg，置150 ml燒杯中，加100 ml 0.1 mol·L-1甲酸-氫氧化鈉緩沖溶液（pH 33.2），在30時攪拌2 h，放置過夜。將已溶脹的葡甘露聚糖溶液離心，以4 000 r/min離心30 min，移取上清液，

13、即得到KGM提取液。分別取2 ml KGM提取液于3個25ml具塞比色管中，加入0.5 ml 3 mol·L-1硫酸溶液，在沸水浴中水解1.5 h，取出冷卻。準確加入2.5 ml 6 mol·L-1 氫氧化鈉溶液，搖勻，用蒸餾水定容，即得KGM水解液。分別取KGM提取液2 ml加入3支25 ml具塞比色管中，分別取KGM水解液2 ml加入3支25 ml具塞比色管中，另取1支25 ml具塞比色管中加入2 ml蒸餾水。在7支比色管中分別加1.5 ml DNS試劑，搖勻，沸水浴中加熱5 min，立即冷卻,然后用蒸餾水定容至刻度，即得KGM檢測液。測定KGM檢測液在505 nm處的

14、吸光度值，依下式各樣品中KGM的含量：    KGM（%）=（255T樣-T白）×1002 m×100%    上式中0.9，為甘露糖和葡萄糖在葡甘露聚糖分子中的殘基分子量與葡甘露聚糖水解后得到的甘露糖和葡萄糖分子量之比：    T樣水解液的吸光度值    T白水解液的吸光度值    m魔芋粉樣品重（mg）3  結(jié)果與分析    對五峰杰成魔芋有限公司提供的魔芋特級精粉和二級精粉以及長陽

15、、利川、南漳三地產(chǎn)魔芋利用上述方法進行多次測量，得出魔芋的KGM含量。結(jié)果見表4。表4  鄂產(chǎn)魔芋葡甘露聚糖含量（略）3.1  回收率測定按上述方法制備KGM檢測溶液，直至水解完成，用6 mol·L-1氫氧化鈉中和，在2支比色管中精密加入10 mg·ml-1的葡萄糖對照溶液0.5 ml，另一支比色管中不加葡萄糖，再用蒸餾水定容至25 ml，即得水解液。檢測各自在505 nm處的吸光度T，其平均回收率為98.05%。結(jié)果見表5。表5  回收率實驗結(jié)果（略）3.2  精密度實驗選三組魔芋樣品，利用甲酸-氫氧化鈉溶脹提取法，多次平行實驗結(jié)果

16、表明，其標準偏差為0.090.26，變異系數(shù)為0.26%0.67%。結(jié)果見表6。表6  精密度實驗結(jié)果（略）4  結(jié)論    本實驗結(jié)果表明，甲酸-氫氧化鈉緩沖液溶脹法提取KGM提取效率高而且結(jié)果可靠，此法減少了去還原糖的步驟并且獨特的定容方法避免轉(zhuǎn)移過程中容器壁上附著KGM，從而使測定結(jié)果更加準確，實驗重現(xiàn)性高。另外，此法較其它方法用時少，操作簡單。    從報道看，利用分光光度法測定魔芋葡甘露聚糖含量時，其吸收波長各異。本文利用紫外可見分光光度計在全波長掃描，得出葡萄糖在505 nm處有最大的吸收峰，且線性關(guān)系

17、最好。    對實驗的優(yōu)化條件摸索后，最終得出葡甘露聚糖含量測定的最佳方法：用0.1 mol·L-1甲酸-氫氧化鈉緩沖溶液（pH 33.2）溶漲魔芋粉，在30時攪拌2，放置過夜。以4 000 r/min離心30 min，得到KGM提取液。加入0.5 ml 3 mol·L-1硫酸溶液，在沸水浴中水解1.5 h，冷卻，加入2.5 ml 6 mol·L-1 氫氧化鈉，搖勻，定容，即得KGM水解液。分別取KGM提取液和KGM水解液2 ml加入2只25 ml具塞比色管中，另取1只25 ml具塞比色管中加入2 ml蒸餾水。分別加1.5 ml DN

18、S試劑，搖勻，沸水浴中加熱5 min，立即冷卻后定容，在505 nm處測定其吸光度。   優(yōu)化后本實驗方法的回收率為98.05%，標準偏差為0.090.26，變異系數(shù)為0.26%0.67%。綜上所述可知，優(yōu)化后的實驗方法具有簡單、快速、高效等特點。    利用上述優(yōu)化后的葡甘露聚糖含量測定方法，對鄂產(chǎn)魔芋進行了葡甘露聚糖含量測定，可知不同產(chǎn)地的魔芋其KGM的含量有一定的差異，為今后開發(fā)利用提供了科學(xué)依據(jù)?！疚墨I】  1Chong Zeng-zhe. Science of Amorphophalus KonjacM.Chengdu:Si

19、chuan University Press 1990(Ch).2許時嬰，錢和.魔芋葡甘露聚糖的化學(xué)結(jié)構(gòu)與流變性質(zhì)J.無錫輕學(xué)院學(xué)報，1991，10（1）：1.3Gu DY, Shi YX, Hu ZY. Action of Konjac Glucomannan on antiageingJ.Zhongchaoyao(Chin Tradit Herbal Drugs), 1999,30(2):127.4吳萬興，李科友，李涵，等.魔芋精粉中甘露聚糖的測定方法J.食品工業(yè)科技，1994，5：74.5王照例，吳萬興，李科友，等.魔芋精粉中甘露聚糖含量測定研究J.食品科技，1998，（3）：56.6Jia Cheng-yu, CHEN Su-wen, MO Wei-ping. A Quantitative Analysis of Glucomannan from Amorphophallus KonjacJ. Study and Research of Natural Products, 1989,1:42.7孫遠明，劉佩瑛，張盛材，等.魔芋葡