乙肝檢測(cè)綜述(新)

1、乙肝檢測(cè)綜述乙型病毒性肝炎（簡(jiǎn)稱乙型肝炎）是由乙型肝炎病毒（簡(jiǎn)稱乙肝病毒）引起的肝臟 炎性損害，是我國(guó)當(dāng)前流行最廣泛、 危害最嚴(yán)重的一種傳染病。乙肝檢測(cè)在乙肝病毒感染的診斷及獻(xiàn)血員篩選上均有重要意義：1篩選供血員，通過(guò)檢測(cè) HBsAg，篩選去除HBsAg陽(yáng)性的供血者，可使輸血后乙肝發(fā)生率大幅度降低。2.可作為乙肝病人或攜帶者的特異性診斷。3.對(duì)乙肝病人預(yù)后和轉(zhuǎn)歸提供參考。一般認(rèn)為急性乙肝患者，如HBsAg持續(xù)2個(gè)月以上者，約2/3病例可轉(zhuǎn)為慢性肝炎。HBeAg陽(yáng)性者病后發(fā)展成為慢性肝炎和肝硬化的可 能性較大。4.研究乙肝的流行病學(xué)，了解各地人群對(duì)乙肝的感染情況。5 .判斷人群對(duì)乙肝的免疫水平，

2、了解注射疫苗后抗體陽(yáng)轉(zhuǎn)與效價(jià)升高情況等。隨著科技的進(jìn)步，免疫學(xué)和分子生物學(xué)等學(xué)科的不斷縱深發(fā)展以及人們對(duì)乙肝病毒的 認(rèn)識(shí)，乙肝檢測(cè)的方法手段也不斷的更新，特異性和敏感性（檢出率）也有明顯提高，而且也越來(lái)越自動(dòng)化，在乙肝的診斷、治療和控制乙肝病毒的傳播方面作出了巨大的貢獻(xiàn)。下面就具體介紹一下乙肝檢測(cè)的歷史、現(xiàn)狀、以及未來(lái)的發(fā)展趨勢(shì)。一、60年代一70年代我國(guó)在60年代末引入了免疫沉淀試驗(yàn)，開創(chuàng)了對(duì)乙型肝炎病毒抗原抗體的檢測(cè)。我們 先后采用過(guò)瓊脂免疫擴(kuò)散，對(duì)流免疫電泳，免疫放射電泳自顯影等方法，但其特異性及敏感性還較差。70年代初采用了一系列間接血凝試驗(yàn)（IHO）、免疫粘連血凝試驗(yàn)（IAHA），乳

3、膠凝集試驗(yàn)等，使檢測(cè)的敏感性和特異性有所提高。Mancini （1965）提出單向免疫擴(kuò)散技術(shù)（single immunodiffusion ）,此法是目前最常用 的簡(jiǎn)易抗原定量技術(shù)。單向免疫擴(kuò)散試驗(yàn)是在凝膠中進(jìn)行的沉淀反應(yīng)，將抗體混入加熱溶解的瓊脂中，傾注于玻片上，制成含有抗體的瓊脂板，在適當(dāng)位置打孔，將抗原材料加入瓊脂板的小孔內(nèi)，讓抗原從小孔向四周的瓊脂中擴(kuò)散，與瓊脂中的抗體相遇形成免疫復(fù)合物。當(dāng)復(fù)合物體積增加到一定程度時(shí)停止擴(kuò)散，出現(xiàn)以小孔為中心的圓形沉淀圈，沉淀圈的直徑與加入的抗原濃度成正相關(guān)。本方法簡(jiǎn)便，易于觀察結(jié)果，可測(cè)定抗原的靈敏度（最低濃度） 約為1020卩g/m,常用于定量測(cè)

4、定人或動(dòng)物血清IgG、IgM、IgA和C3等，其缺點(diǎn)是需12天才能看結(jié)果。此種方法由于靈敏度低，反應(yīng)時(shí)間長(zhǎng)，已經(jīng)不用于乙肝檢測(cè)。對(duì)流免疫電泳（cou nterimmu noelectro phoresis ）是一敏感快速的檢測(cè)方法，即在電場(chǎng)作 用下的雙向免疫擴(kuò)散。將瓊脂板放入電泳槽內(nèi)，使瓊脂板的兩孔沿著電場(chǎng)的方向，于負(fù)極 側(cè)的孔內(nèi)加入抗原，于正極側(cè)的孔內(nèi)加入抗體，通電后，抗原帶負(fù)電荷向正極泳動(dòng)，抗體 分子雖也帶負(fù)電荷，但因分子量大，向正極的位移小，而受瓊脂中電滲作用向負(fù)極移動(dòng)， 抗原和抗體能較快地集中在兩孔之間的瓊脂中形成免疫復(fù)合物的沉淀線。只需1小時(shí)左右即可觀察結(jié)果。雖然其反應(yīng)時(shí)間相對(duì)于免疫

5、擴(kuò)散技術(shù)大大縮短，但其靈敏度仍舊有限，小 于 0.1mg。由于免疫沉淀試驗(yàn)靈敏度有限，無(wú)法滿足乙肝臨床檢測(cè)的需要，所以70年代人們采用了凝聚實(shí)驗(yàn)來(lái)代替它，其中有代表性的是反向被動(dòng)血凝實(shí)驗(yàn)（R-PHA ）。其原理是：先將綿羊紅血球以戊二醛固定，使其表面陰離子化，再經(jīng)鞣酸或氯化鉻（交聯(lián)劑）理，使提純的乙 肝表面體吸附到醛化紅血球表面致敏，此致敏血球與表面抗原相遇，發(fā)生特異性抗原抗體反應(yīng)而使血球凝集，稱為反向被動(dòng)凝集（RPHA ）。如果將含特異性抗體的待檢血清與已知抗原先混合，使發(fā)生特異性抗原抗體反應(yīng)而將抗原上的結(jié)合位點(diǎn)占據(jù)，此時(shí)加入抗體致敏血球就不能再與已知抗原起反應(yīng)，因而不產(chǎn)生血凝，此法稱為反向

6、被動(dòng)血凝抑制（RPHI ）。反向被動(dòng)血凝試驗(yàn)是用來(lái)檢查抗原的，而反向被動(dòng)血凝抑制試驗(yàn)則是用來(lái)檢測(cè)抗體的。對(duì)流免疫電泳（CIEP）法和補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)（CF）法比瓊脂免疫擴(kuò)散（ID ）法要敏感20100倍，可檢測(cè)到每毫升中含有 1 微克以上的表面抗原顆粒。而反向被動(dòng)試驗(yàn)（RPHA ）又比對(duì)流免疫電泳和補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)敏感 10100 倍，可檢出每毫升血清中所含的 0.1 微克以下的表 面抗原。雖然其靈敏度大大提高，但是衛(wèi)生部在關(guān)于整頓血液制品生產(chǎn)管理的通知中指出， 要嚴(yán)格按照衛(wèi)生部頒發(fā)的獻(xiàn)血員體格檢查標(biāo)準(zhǔn) ，對(duì)獻(xiàn)血員進(jìn)行健康檢查，關(guān)于標(biāo)準(zhǔn) 中HBsAg檢查一項(xiàng)，應(yīng)將靈敏度低的“反相間接血凝法（RPHA）

7、”改為靈敏度高的“固相放射免疫法（R I A）或“酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）”。二、 80年代 90年代12。隨我國(guó)于1983年建立分泌抗HBc IgM及l(fā)gG3的單克隆抗體的兩個(gè)雜交瘤細(xì)胞系 后相繼建立了分泌抗 HBs、抗HBe、抗前S2及抗HAV等單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株。這些 都迅速運(yùn)用于多種檢測(cè)方法和制備試劑盒的研究，顯著地提高了檢測(cè)水平。1994 年研制了HBV 前 S2（HBV PreS2） 基因工程單鏈抗體 （ScFv）14。 1995年又采用噬菌體抗體庫(kù)技術(shù)，篩 選到抗 HBs 單抗 15 。雙功能抗體檢測(cè)等新技術(shù)的研究也初見端倪。隨著單克隆抗體、人工合成多肽及基因工程表達(dá)抗原

8、、各種標(biāo)記技術(shù)的出現(xiàn)，一系列超微量免疫學(xué)檢測(cè)的研究迅速發(fā)展。固相放射免疫測(cè)定（SPRIA）及ELISA試驗(yàn)廣泛應(yīng)用于乙肝的檢測(cè)，敏感度達(dá)到 ngfg/ml水平。放射免疫分析（radioimmunoassay, RIA ）是以放射 性核素為標(biāo)記物的標(biāo)記免疫分析法， 用于定量測(cè)定受檢標(biāo)本中的抗原。 最初建立的方法模式 是以核素標(biāo)記的抗原與受檢標(biāo)本中抗原競(jìng)爭(zhēng)的測(cè)定模式，本法的靈敏度高達(dá)ng甚至pg水平,必須加以防護(hù)， 核素實(shí) 另外由于核素有半衰期， 試劑 但現(xiàn)仍普遍使用于縣級(jí)以上乙肝病毒酶聯(lián)免疫法診斷試 固相和酶標(biāo)記的 把受檢標(biāo)本 （測(cè)定其中的抗體或抗原）和酶標(biāo) 用洗滌的方法使固相載體上測(cè)定的準(zhǔn)確性

9、良好，特異性強(qiáng)、精密度高、有試劑盒供應(yīng)，而且儀器設(shè)備并不昂貴，在醫(yī)學(xué) 檢驗(yàn)中應(yīng)用極為廣泛， 但由于核素的放射性對(duì)人體有一定的危害性， 驗(yàn)室的建設(shè)須經(jīng)防疫部門的監(jiān)督， 操作人員須經(jīng)過(guò)特殊訓(xùn)練。 盒的貨存期較短， 因而放射免疫分析在應(yīng)用中有諸多不便之處， 醫(yī)院。酶聯(lián)免疫法興起于 20 世紀(jì) 80 年代， 產(chǎn)品現(xiàn)在處于成熟期，最后結(jié)合在固相載體上的酶量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的 底物被酶催化變?yōu)橛猩a(chǎn)物， 產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受劑盒市場(chǎng)上很普遍。 其基礎(chǔ)是抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶標(biāo)記， 的抗原或抗體及酶均保持其活性。在測(cè)定時(shí)， 抗原或抗體按不同的步驟與固相載體表面的抗原或抗體起反應(yīng)。 形成的抗原抗體復(fù)

10、合物與其他物質(zhì)分開， 量成一定的比例。 加入酶反應(yīng)的底物后， 檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，故可根據(jù)顏色反應(yīng)的深淺定性或定量分析。由于酶的催化頻率很高， 故可極大地地放大反應(yīng)效果， 從而使測(cè)定方法達(dá)到很高的敏感度。 雖然其靈敏度與放免相比 有限，適用于臨床定性判定，但由于其檢測(cè)方便，快捷，試劑穩(wěn)定，成本低，無(wú)污染，而且 自動(dòng)化程度高， 所以現(xiàn)在普遍使用于各級(jí)臨床機(jī)構(gòu)， 是檢測(cè)各種肝炎病毒抗原抗體仍為較普 遍應(yīng)用的重要診斷條件，也是我國(guó)臨床免疫診斷的基本方法。化學(xué)發(fā)光法 20世紀(jì) 80 年代在國(guó)外已經(jīng)興起， 現(xiàn)已被臨床普遍使用， 成為臨床免疫診斷 的支柱方法。 但在國(guó)內(nèi)， 目前僅有個(gè)別較大的醫(yī)院開展個(gè)別項(xiàng)

11、目， 產(chǎn)品處于導(dǎo)入期或成長(zhǎng)期。 其原理和酶聯(lián)免疫法基本相同， 只是所用的底物為發(fā)光底物， 最后根據(jù)發(fā)光值來(lái)測(cè)定標(biāo)本的 含量。 由于化學(xué)發(fā)光法既兼有酶聯(lián)免疫法的各種優(yōu)點(diǎn)， 又屏除了放射免疫法有污染， 操作不 便等缺點(diǎn)， 因此目前不但在技術(shù)上開始有了飛躍的進(jìn)展， 而且高級(jí)儀器的自動(dòng)化程度也越來(lái) 越高。相信化學(xué)發(fā)光法將會(huì)成為乙肝定量檢測(cè)的方法中具有競(jìng)爭(zhēng)力的一種，引起科研生產(chǎn)單位及用戶的關(guān)注。免疫滲濾試驗(yàn)（DICA ）及核酸雜交法是繼 EIA后較有前途的檢測(cè)手段。90年代初發(fā)展 了以膠體金為標(biāo)記物的斑點(diǎn)免疫滲濾試驗(yàn)（ dotymmunogoldfiltrationassay ， DIGFA ），又名滴

12、 金免疫測(cè)定法（簡(jiǎn)稱滴金法） 。其原理以雙抗體夾心法為例，在硝酸纖維素膜的膜片中央滴加純化的抗體，為膜所吸附。當(dāng)?shù)渭釉谀ど系臉?biāo)本液體滲濾過(guò)膜時(shí)，標(biāo)本中含抗原被膜上抗體捕獲，其余無(wú)關(guān)蛋白等沒(méi)濾出膜片。其后加入的膠體金標(biāo)記也在滲濾中與已結(jié)合在膜上的抗原相結(jié)合。因膠體金本身呈紅色， 陽(yáng)性反應(yīng)即在膜中央顯示紅色斑點(diǎn)。在滴金法中不需酶Me 抗 HBs，1 ng/ml。可 其試劑穩(wěn)操作簡(jiǎn)對(duì)底物的反應(yīng)，更加簡(jiǎn)便、快速，在臨床檢驗(yàn)中應(yīng)用日漸廣泛。另外一種與此相近的技術(shù)是膠體金免疫層析技術(shù)，1997年采用膠體金標(biāo)記以硝酸纖維素膜為載體進(jìn)行層析檢測(cè)HBsAg的技術(shù)，其特異性好，靈敏度可達(dá)DNA 或 RNAHBV

13、DNA存在就可以引起乙肝的傳 而最早的直接檢測(cè)病毒遺傳物質(zhì) HBVDNA 作探針，與病人血清中 存在，則其堿基與探針的 HBVDNA以避免在ELISA(特別是一步法)等方法中出現(xiàn)的由于抗原過(guò)剩所導(dǎo)致的鉤狀效應(yīng)。 定、易于保存，附有質(zhì)控帶可行質(zhì)量監(jiān)控，是適合基層單位檢測(cè)肝炎病毒抗原抗體， 易快速、無(wú)須儀器設(shè)備的良好檢測(cè)方法。肝炎病毒顆粒的存在與否決定了它的傳染性的有無(wú)，而肝炎病毒特異性 是肝炎病毒是否存在的直接證據(jù)。另外，研究發(fā)現(xiàn)只要染。以上各種方法的共同點(diǎn)是不能直接檢測(cè)病毒遺傳物質(zhì)， 的方法是斑點(diǎn)雜交法。用核素或生物素標(biāo)記克隆化的 HBVDNA進(jìn)行分子雜交，如病人血清中有HBV DNA相配對(duì)結(jié)

14、合并顯色，則為陽(yáng)性，表示有乙肝病毒感染，病毒在復(fù)制，有傳染性。此法操作簡(jiǎn) 單，用血量少，價(jià)格較低，且病毒量要大于105拷貝/毫升才呈陽(yáng)性，故靈敏度差。1985年P(guān)CR ( Polymerase Chain Reaction )出現(xiàn)， PCR技術(shù)應(yīng)用于乙肝檢測(cè) 是指將 病人血清中特異的 HBVDNA在內(nèi)外引物的作用下，使其HBVDNA特異性片段在設(shè)定的條件下不斷擴(kuò)增到原來(lái)的數(shù)百萬(wàn)倍。PCR法直接檢測(cè)病毒基因、具有高度的特異性、靈敏性，而且快速、簡(jiǎn)便、易于自動(dòng)化，因而取代了斑點(diǎn)雜交、原位雜交、膜印跡雜交等基因檢測(cè)技 術(shù)，迅速?gòu)V泛地用于肝炎病毒的檢測(cè)研究，是檢測(cè)技術(shù)的一項(xiàng)革命性突破。在實(shí)驗(yàn)技術(shù)上不斷

15、發(fā)展的套式PCR、原位PCR、鏈特異性PCR等也應(yīng)用于體液及組織中肝炎病毒基因的檢 測(cè)。目前，PCR技術(shù)已成為公認(rèn)的對(duì)病毒性肝炎的診斷、療效觀察及預(yù)防研究工作最理想的 方法之一。 但PCR技術(shù)也不是十全十美的，因?yàn)槠洳僮鬟^(guò)程易被污染而致假陽(yáng)性，且只能定性。目前已用于病毒性肝炎等多種病毒傳染性疾病的病原診斷，考核抗病毒治療效果，鑒定乙肝疫苗和血液制品的安全性，以及分析病毒基因變異等許多方面。1997年運(yùn)用PCR擴(kuò)增片段限制性內(nèi)切酶片段長(zhǎng)度及基因序列分析，報(bào)告了我國(guó)HBV DNA變異的研究結(jié)果。HBVDNA定量的方法包括酶標(biāo)法和熒光法。酶標(biāo)法是先用 PCR法將HBVDNA進(jìn)行擴(kuò)最終加底 PCR-E

16、LISA只能作為一種定性試驗(yàn)，但 熒光法是將熒光探針加人標(biāo)本進(jìn)行擴(kuò) 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)熒光梯度曲線得出所測(cè)標(biāo)本HBV-DNA含量的原理。PCR的一對(duì)引物之外，加入一個(gè)兩端帶有熒光標(biāo)記的 5 '端報(bào)告熒光基團(tuán)的激發(fā)光被 3 '端的淬滅熒光基團(tuán)所 Tao酶沿著DNA模板移動(dòng)到熒光標(biāo)記探針的結(jié)合 將熒光探針切斷，釋放出報(bào)告熒光基團(tuán)的熒光信號(hào)，PCR產(chǎn)增，PCR引物5'端標(biāo)記上地高辛或生物素等非放射性標(biāo)記物，擴(kuò)增產(chǎn)物滴加到固定有特異 性探針的微孔板上，再加入抗地搞辛或生物素酶標(biāo)抗體一辣根過(guò)氧化物酶結(jié)合物， 物顯色，在酶標(biāo)板上測(cè)定 0D值判定結(jié)果。常規(guī)的 若加入內(nèi)標(biāo)，作出標(biāo)準(zhǔn)曲線也可實(shí)現(xiàn)定

17、量檢測(cè)的目的。 增，動(dòng)態(tài)觀察熒光的變化并與標(biāo)準(zhǔn)熒光變化進(jìn)行比較， HBVDNA的定量。熒光法比酶標(biāo)法敏感而準(zhǔn)確，應(yīng)用較廣。下面主要講一下熒光探針疋量 PCR ( FQ-PCR)法準(zhǔn)確定量檢測(cè)已肝病人血清中的通過(guò)定量PCR儀定時(shí)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)每一循環(huán)，可以得到樣品實(shí)際擴(kuò)增曲線， 得到每一樣品模板 DNA ，無(wú)需PCR后處理和冗長(zhǎng)的實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)是在常規(guī) 寡核苷酸探針。在探針完好的狀態(tài)下， 抑制。PCR反應(yīng)過(guò)程中，隨著鏈的延伸， 位置，發(fā)揮它的5'73外切核酸酶活性， 每合成一個(gè)模板，一個(gè)報(bào)告基團(tuán)的信號(hào)釋放，被釋放的激離報(bào)告熒光基團(tuán)的數(shù)目和 物是一對(duì)一的關(guān)系。 找到PCR擴(kuò)增的對(duì)數(shù)期。軟

18、件通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)品的待測(cè)品的對(duì)數(shù)期比較， 的起始拷貝數(shù)。該技術(shù)整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程均在完全閉管的狀態(tài)下進(jìn)行 電泳、紫外或染色檢測(cè)，解決了常規(guī)PCR實(shí)驗(yàn)不能準(zhǔn)確定量及擴(kuò)增產(chǎn)物污染而導(dǎo)致的假陽(yáng)性操作繁復(fù)以及強(qiáng)烈致癌物溴化已錠對(duì)操作人員的危害和污染環(huán)境等問(wèn)題.成為 PCR 的更新?lián)Q代的技術(shù)。 但關(guān)于 FQ-PCR 能否作為一種定量 PCR 技術(shù)， 目前存在著兩種完全對(duì)立的學(xué)派。三、未來(lái)趨勢(shì)基因芯片是最重要的一種生物芯片， 是指將大量探針?lè)肿庸潭ㄓ谥С治锷希?然后與標(biāo)記 的樣品進(jìn)行雜交， 通過(guò)雜交信號(hào)的強(qiáng)弱判斷靶分子的數(shù)量。 用該技術(shù)可將大量的探針同時(shí)固 定于支持物上， 所以一次可對(duì)大量核酸分子進(jìn)行檢測(cè)分析， 從而解決了傳統(tǒng)核酸印跡雜交技 術(shù)操作復(fù)雜、自動(dòng)化程度低、檢測(cè)目的分子數(shù)量少、效率低等不足。它能在同一時(shí)間內(nèi)分析 大量的基因， 使人們準(zhǔn)確高效地破譯遺傳密碼。 這將是繼大規(guī)模集成電路后又一次意義深遠(yuǎn) 的科技革命。 目前， 國(guó)際上正在研制多種基因芯片， 我國(guó)的超群基因芯片目前主要用于檢測(cè) 乙型肝炎、 丙型肝炎和艾滋病病毒。 華聲報(bào)訊：只需被檢驗(yàn)者一滴靜脈血液，一種芯片就可 利用四百多個(gè)探針對(duì)乙肝病毒基因的不同區(qū)域、 多個(gè)位點(diǎn)同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)， 準(zhǔn)確率達(dá)百分之百。 最近，這種只有幾平方厘米大小、 卻記載著四百二十九種乙肝病毒突變類型的基因芯片在南 開大學(xué)問(wèn)世。 這種神奇的基因芯片 “乙肝病毒基因