培養(yǎng)基及設(shè)備的滅菌

1、第五章培養(yǎng)基及設(shè)備的滅菌 第一節(jié) 培養(yǎng)基滅菌的目的、要求和方法一、定義1,培養(yǎng)基滅菌的定義是指從培養(yǎng)基中殺滅有生活能力的細菌營養(yǎng)體及其抱子，或從中將其除去。工業(yè)規(guī)模的液體培養(yǎng)基滅菌，殺滅雜菌比除去雜菌更為常用。2,滅菌與消毒的區(qū)別滅菌:用物理或化學(xué)方法殺死或除去環(huán)境中所有微生物，包括營養(yǎng)細胞、細菌芽抱和抱子消毒:用物理或化學(xué)方法殺死物料、容器、器皿內(nèi)外的病源微生物。二、培養(yǎng)基滅菌的目的1,在發(fā)酵過程中夾雜其它雜菌造成的后果：生產(chǎn)菌和雜菌同時生長，生產(chǎn)菌喪失生產(chǎn)能力；在連續(xù)發(fā)酵過程中，雜菌的生長速度有時會比生產(chǎn)菌生長得更快，結(jié)果使發(fā)酵罐中以雜菌為主；雜菌及其產(chǎn)生的物質(zhì)，使提取精制發(fā)生困難雜菌會降

2、解目的產(chǎn)物；雜菌會污染最終產(chǎn)品，雜菌會污染最終產(chǎn)品；發(fā)酵時如污染噬菌體，可使生產(chǎn)菌發(fā)生溶菌現(xiàn)象。2,工業(yè)上具體措施包括：(1)使用的培養(yǎng)基和設(shè)備須經(jīng)滅菌 ；(2)好氧培養(yǎng)中使用的空氣應(yīng)經(jīng)除菌處理；(3)設(shè)備應(yīng)嚴密，發(fā)酵罐維持正壓環(huán)境；(4) 培養(yǎng)過程中加入的物料應(yīng)經(jīng)過滅菌；(5)使用無污染的純粹種子。3,培養(yǎng)基滅菌的目的殺滅培養(yǎng)基中的微生物，為后續(xù)發(fā)酵過程創(chuàng)造無菌的條件。4,培養(yǎng)基滅菌的要求(1)達到要求的無菌程度(10-3)(2)盡量減少營養(yǎng)成分的破壞，在滅菌過程中，培養(yǎng)基組分的破壞，是由兩個基本類型的反應(yīng)引起的：培養(yǎng)基中不同營養(yǎng)成分間的相互作用；對熱不穩(wěn)定的組分如氨基酸和維生素等的分解。5

3、,滅菌的方法(1)化學(xué)法化學(xué)藥品滅菌法(2)物理法干熱滅菌法濕熱滅菌法射線滅菌法6,濕熱滅菌的原理每一種微生物都有一定的最適生長溫度范圍。當(dāng)微生物處于最低溫度以下時，代謝作用幾乎停止而處于休眠狀態(tài)。當(dāng)溫度超過最高限度時，微生物細胞中的原生質(zhì)膠體和酶起了不 可逆的凝固變性，使微生物在很短時間內(nèi)死亡， 加熱滅菌即是根據(jù)微生物這一特性而進行的。7,濕熱滅菌中的相關(guān)定義?殺死微生物的極限溫度稱為 致死溫度。在致死溫度下，殺死全部微生物所需的時間稱為致死時間；在致死溫度以上，溫度愈高，致死時間愈短。?微生物的熱阻：是指微生物在某一特定條件 (主要是溫度和加熱方式) 下的致死時間。相對熱阻是指某一微生物在

4、某條件下的致死時間與另一微生物在相同條件下的致死 時間的比值。各種微生物對濕熱的相對熱阻微生物 相對熱阻營養(yǎng)細胞和酵母1.0細菌芽抱3M06霉菌抱子210病毒和噬菌體158,濕熱滅菌的優(yōu)點?蒸汽來源容易，操作費用低，本身無毒；?蒸汽有強的穿透力，滅菌易于徹底；?蒸汽有很大的潛熱；?操作方便，易管理。第二節(jié)濕熱滅菌的理論基礎(chǔ)一，培養(yǎng)基濕熱滅菌需解決的工程問題1,將培養(yǎng)基中的雜菌總數(shù) N0殺滅到可以接受的總數(shù) N (10-3),需要多高的溫度、多 長的時間為合理。2,菌溫度和時間的確定取決于：(1)雜菌抱子的熱滅死動力學(xué)(2)反應(yīng)器的形式和操作方式(3)培養(yǎng)基中有效成分受熱破壞的可接受范圍二、微生

5、物的熱死滅動力學(xué)方程實驗證明，微生物營養(yǎng)細胞的均相熱死滅動力學(xué)符合化學(xué)反應(yīng)的一級反應(yīng)動力學(xué)，即:dN"dTN:任一時刻的活細菌濃度（個 /L） t:時間 m min）K:比熱死速率常數(shù)（min-1）取邊界條件t0=0, N=N o，對（1）積分得N N0 e Kt3fflaj營養(yǎng)細胞典型死亡速率的數(shù)據(jù) < 大腸桿窗>實驗還證明，細菌抱子的熱殺滅動力學(xué)與營養(yǎng)細胞的有所不同。它表現(xiàn)為非對數(shù)的死亡動力學(xué)。這可能與抱子壁的化學(xué)成分及結(jié)構(gòu)有關(guān)。但當(dāng)溫度超過120?C時，熱阻極強的嗜熱脂肪芽抱桿菌抱子的熱殺滅動力學(xué)也接近對數(shù)死亡動力學(xué)即符合一級反應(yīng)規(guī)律。三、溫度對K的影響微生物的熱死

6、滅動力學(xué)接近一級反應(yīng)動力學(xué)，它的比熱死滅速率常數(shù)K與滅菌溫度 T的關(guān)系可用阿累尼烏斯方程表征E/RTK A e4A :頻率因子（min-1）AE:活化能（J/mol）R:通用氣體常數(shù)J/ （mol.k）從方程（4）可以看出：（1）活化能AE的大小對K值有重大影響。其它條件相同時，AE越高，K越低，熱死速率越慢。（2）不同菌的抱子的熱死滅反應(yīng)A E可能各不相同。對方程（4）兩邊取對數(shù)，得方程（5）ln K RE ln A 5K是AE和T的函數(shù)，K的對T的變化率與有關(guān)，對方程（5）兩邊對T取導(dǎo)數(shù)，得方 程（6）。由方程（6）可得出結(jié)論：反應(yīng)的 AE越高，lnK對T的變化率越大，即 T的變化 對K的

7、影響越大試驗表明， 細菌抱子熱死滅反應(yīng)的 A E很高，而某些有效成分熱破壞反應(yīng)的AE較低（見下表）。將溫度提高到一定程度，會加速細菌抱子的死滅速度，縮短滅菌時間， 由于有效成分的 AE很低，溫度的提高只能稍微增大其破壞速度，但由于滅菌時間的顯著縮 短，有效成分的破壞反而減少。受熱物質(zhì)A E (J/mol)維生素B1296232維生素B1鹽酸鹽92048嗜熱脂肪芽抱桿菌抱子283257肉毒梭菌抱子343088317984X 4.184匕Kbs從 0.12 (AEbs =67000 X 4.184 (J/mol),維生素 105?CK高127?C,Kvb* 0：02(min-1)；Min-1)。

8、3DBi 的 AEvb=22000 是高到 0.06(min-1),枯草桿菌抱子嗜熱脂肪芽抱桿菌抱子和維生素Bi的lnK-1/T圖嗜熱脂肪芽抱桿菌抱子死滅程度為N/No=10-16時，滅菌溫度對維生素B1破壞的影響火菌溫度（？C）達到滅菌程度的時間（min）維生素B1的損失（）10084399.9911075891207.6271300.851101400.10731500.0151第三節(jié)培養(yǎng)基滅菌的工程設(shè)計一、無菌的標準根據(jù)微生物熱死滅方程， 要求滅菌后達到絕對無菌是很難做到的，也是不必要的。因此在工程設(shè)計中常取 N=10-3O二、分批滅菌1,分批滅菌的設(shè)計在發(fā)酵罐中進行實罐滅菌，是典型的分

9、批滅菌。全過程包括升溫、保溫、降溫三栩用:一0 L，. 上 -工 一 1.1_ 、一 一 口 20 40 6030 100 120 140 160 18。205 220 24。263Bifl （分）dNdT池子熱死亡的規(guī)律符合積分得（8)ln NN0 Kt8在分批滅菌過程中廷 東:格 得喏ln中0 1n左ln等 9N11nSKht2 ti111n N2 At3e E/RTdt 12K不是常數(shù)，所以:t2因為升溫、冷卻階段 T是時間t的函數(shù)， 式中Kh是保溫階段的抱子比熱死亡速度常數(shù)分批滅菌中幾種換熱方式的溫度-時間變化關(guān)系加熱或者冷 卻的型式溫度-時間變化關(guān)系直接蒸汽鼓泡T = Tot 1斗（

10、1芋41間接加熱T=Th（1電加熱 T = Tq（ J + cu ）盤管冷卻Tcc C 1 + p'at ）hs又 Sa = MCpTo§ = MUA a To- Th 產(chǎn)，0 = " Th口_s 一 及pTQWCp -tiA/wc'pT:介質(zhì)溫度（K）; T。：介質(zhì)初溫（K）; t:時間（min）; h：蒸汽相對于介質(zhì)的熱 始（kJ/kg）; s：蒸汽的重量流率（kg/min ）; M ：介質(zhì)重量（kg）; Cp：介質(zhì)比熱kJ/（kg.K）； Th：熱源溫度（K）; U :總傳熱系數(shù)kJ/ （m2.min.K） ; q：傳熱速率（kJ/min）; Cp：

11、冷卻劑比熱；W:冷卻劑流率；Tco：冷卻劑溫度2,計算舉例（自學(xué)）參見：微生物工程工藝原理P226、倫世儀主編生化工程P13。3,保證間歇滅菌 成功的要素(1)內(nèi)部結(jié)構(gòu)合理(主要是無死角)，焊縫及軸封裝置可靠，蛇管無穿孔現(xiàn)象(2)壓力穩(wěn)定的蒸汽發(fā)酵罐的接管圖4,培養(yǎng)基間歇滅菌過程中應(yīng)注意的問題(1)溫度和壓力的關(guān)系(2)泡沫問題(3)投料過程中，妹皮和豆餅粉等固形物在罐壁上殘留的問題(4)滅菌結(jié)束后應(yīng)立即引入無菌空氣保壓、連續(xù)滅菌的設(shè)計 1,連續(xù)滅菌的流程(1)噴射加熱連續(xù)滅菌狙有時間典型的噴射加熱連續(xù)滅菌時的溫度和時間曲線圖(2)薄板換熱器連續(xù)滅菌薄板換熱器連續(xù)滅菌流程薄板換熱器連續(xù)滅菌時的

12、溫度和時間曲線圖(3)噴淋冷卻連續(xù)滅菌7連酒塔連儂3放汽培養(yǎng)液 冷卻水幢淋冷用器噴淋冷卻連續(xù)滅菌流程2,連續(xù)滅菌設(shè)計及計算舉例(自學(xué))參見：微生物工程工藝原理 P228,倫世儀主編生化工程P22。3,連續(xù)滅菌設(shè)備的結(jié)構(gòu)及計算(1)設(shè)備結(jié)構(gòu):套管式連消塔口噴嘴式連消塔連消器噴射加熱器圖2-19噴射加熱器示意圖1 一嗜臂2一吸入口 3吸入室，一混合嗔膏5-混合段6一擴大管薄板換熱器維持罐(2)連消塔計算(自學(xué))參見發(fā)酵工程與設(shè)備 P53四、連續(xù)滅菌與間歇滅菌的比較 1,連續(xù)滅菌的優(yōu)缺點優(yōu)點- 保留較多的營養(yǎng)質(zhì)量- 容易放大- 較易自動控制；- 糖受蒸汽的影響較少；- 縮短滅菌周期；- 在某些情況下

13、，可使發(fā)酵罐的腐蝕減少；- 發(fā)酵罐利用率高；- 蒸汽負荷均勻。缺點- 設(shè)備比較復(fù)雜，投資較大。2,分批滅菌的優(yōu)缺點優(yōu)點- 設(shè)備投資較少- 染菌的危險性較小- 人工操作較方便- 對培養(yǎng)基中固體物質(zhì)含量較多時更為適宜缺點-滅菌過程中蒸汽用量變化大， 造成鍋爐負荷波動大，一般只限于中小型發(fā)酵裝置。五、影響滅菌的因素 (1)培養(yǎng)基成分對滅菌的影響油脂，糖類及一定濃度的蛋白質(zhì)可增加微生物的耐熱性，另一些物質(zhì)，如高濃度的鹽類,色素等可削弱其耐熱性。- 2)培養(yǎng)基的物理狀態(tài)對滅菌的影響- 3)培養(yǎng)基中微生物數(shù)量對滅菌的影響- 4)培養(yǎng)基中氫離子濃度對滅菌的影響培養(yǎng)基中氫離子濃度直接影響滅菌的效果。培養(yǎng)基的酸堿度越大，所需殺滅微生物的溫度越低。(5)微生物細胞中水分對滅菌的影響細胞含水越多，蛋白質(zhì)變性的溫度越底(6)微生物細胞菌齡對滅菌的影響老細胞水分含量低、低齡細胞水分含量高(7)空氣排除情況對滅菌的影響(8)攪拌對滅菌的影響（ 9）泡沫對滅菌的影響6、 發(fā)酵罐的滅菌培養(yǎng)基的滅菌如果是采用連續(xù)滅菌法。則發(fā)酵罐應(yīng)在加入滅菌的培養(yǎng)基前先行單獨滅菌。通常是用蒸汽加熱發(fā)酵罐的夾套或設(shè)管并從空氣分布管中通入蒸汽，充滿整個容器后，再從徘氣管中緩緩排出。容器內(nèi)的蒸汽