抗體的表達(dá)原理

1、第七章 抗體的表達(dá)華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院廖振林提要 基因工程抗體巴在多種體系獲得成功表達(dá)，包括哺乳動物細(xì)胞、大腸桿茵、酵母細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞、轉(zhuǎn)基因植物以及轉(zhuǎn)基出動物等表達(dá)體系。其中哺乳動物細(xì)胞最接近抗體產(chǎn)生的天然宿主，是比較成熟、應(yīng)用最多的表達(dá)體系，主要用于表達(dá)完整抗體分子，目前治療性單抗的生產(chǎn)基本都用這一表達(dá)體系。通過對友達(dá)載體、宿主細(xì)胞及各環(huán)節(jié)的改良和完善，己可達(dá)到100mgL左右的表達(dá)水平，大腸桿菌體系不能對表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行糖基化，只能表達(dá)抗體分子片段，但由于其遺傳背景清楚，操作簡單，成本低，周期短等優(yōu)點(diǎn)，亦有較廣泛的應(yīng)用，尤其在研究領(lǐng)域。 酵母細(xì)胞和昆蟲細(xì)胞表達(dá)體系具有一定的糖基化功能，能表達(dá)

2、完整抗體分子，可達(dá)到較高表達(dá)量 ，其操作及成本較哺乳動物細(xì)腦有一定優(yōu)勢，但在抗體表達(dá)中的應(yīng)用尚不多，應(yīng)用價值有待評價。轉(zhuǎn)基因植物和轉(zhuǎn)基因動物表達(dá)體系主要用于工程抗體的大規(guī)模生產(chǎn)，其成功應(yīng)用尚需時日?？贵w載體體統(tǒng)的種類 1 哺乳動物表達(dá)載體系統(tǒng) 2 大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng) 3 酵母及昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng) 4 動植物表達(dá)系統(tǒng)第一節(jié) 哺乳動物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng) 哺乳動物細(xì)胞是最早用來表達(dá)抗體分子的，也是目前應(yīng)用最多的表達(dá)體系。哺乳動物細(xì)胞內(nèi)有抗體折疊形成正確立體空間構(gòu)象所必需的分子伴侶，其內(nèi)質(zhì)網(wǎng)為抗體分子的正確折疊和鏈內(nèi)及鏈間二硫鍵的形成提供了有利的氧化-還原環(huán)境。 此外哺乳類動物細(xì)胞還擁有完整的轉(zhuǎn)錄、翻譯后加工及

3、分泌等機(jī)制，包括抗體的糖基化、羧基化等一系列復(fù)雜的加工過程，因而哺乳動物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的抗體通常具有正確的折疊和空間構(gòu)象以及正確的裝配，具有良好生物活性，基本近似于天然抗體。 同時哺乳動物細(xì)胞還能實(shí)現(xiàn)抗體的分泌性表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物可分泌至無血清或無蛋白的培養(yǎng)上清中，為抗體的分離純化提供了最大的便利。此外表達(dá)抗體的哺乳動物細(xì)胞也能進(jìn)行規(guī)?；囵B(yǎng)，為抗體的產(chǎn)業(yè)化相應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。哺乳動物表達(dá)細(xì)胞 但哺乳動物細(xì)胞表達(dá)體系存在構(gòu)建周期長、操作煩瑣，表達(dá)產(chǎn)量相對低，生產(chǎn)成本較高等缺點(diǎn)。因此、盡管哺乳功物細(xì)胞表達(dá)體系能用于各種基因工程抗體的表達(dá)但最適合表達(dá)的還是全分子抗體以及某些不適宜在非哺乳動物細(xì)胞表達(dá)的

4、小分子抗體。哺乳動物細(xì)胞表達(dá)體系包括宿主細(xì)胞和表達(dá)載體：目前常用的宿主細(xì)胞主要有兩類，一類是淋巴類細(xì)胞，另一類是非淋巴類細(xì)胞。一、淋巴類細(xì)胞 在體內(nèi)抗體是由漿細(xì)胞分泌產(chǎn)生的，漿細(xì)胞具有抗體正確折疊，空間構(gòu)象形成，鏈內(nèi)及鏈間二硫鍵形成的內(nèi)環(huán)境，包括內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及參與此過程的各種協(xié)向因子和分子伴侶(加重鏈結(jié)合蛋白BiP GRP78，二硫化異構(gòu)酶等等)，而且還合完成抗體恒定區(qū)糖基化等翻譯后加工修飾的細(xì)胞器、蛋白及代謝產(chǎn)物；因此漿細(xì)胞應(yīng)是最適合表達(dá)重組抗體的。但漿細(xì)胞不能在體外長期培養(yǎng)，永生化或惡性轉(zhuǎn)化的漿細(xì)胞瘤和骨髓瘤細(xì)胞系對于表達(dá)重組抗體是最接近漿細(xì)胞的，這些細(xì)胞同漿細(xì)胞一樣能提供抗體表達(dá)所需的全套協(xié)同

5、因子、分子伴侶以及糖基化等加工機(jī)制。 因此能用于表達(dá)各種重組的基因工程抗體。但是有的骨髓瘤細(xì)胞系本身也產(chǎn)生免疫球蛋白鏈，大多為輕鏈，選擇時應(yīng)首先考慮用那些本身不產(chǎn)生免疫球蛋白肽鏈的骨髓瘤細(xì)胞系。 由于目前尚無穩(wěn)定但自身不分泌Ig的人骨髓瘤細(xì)胞系，因此，用于表達(dá)基因工程抗體的淋巴類細(xì)胞，主要是小鼠和大鼠的骨髓瘤細(xì)胞。 目前在表達(dá)基因工程抗體最多的骨髓瘤細(xì)胞是小鼠骨髓瘤細(xì)胞系SP2/0和NSO，以及大鼠的骨髓瘤細(xì)胞YB2/0。這些骨髓瘤細(xì)胞均不產(chǎn)生和分泌任何免疫球蛋白。 SP2/0細(xì)胞系是小鼠骨髓細(xì)胞p3x63Ag8與經(jīng)綿羊紅細(xì)胞免疫的小鼠脾淋巴細(xì)胞融合而成的雜交瘤，再經(jīng)培養(yǎng)和藥物篩選發(fā)生變異后獲

6、得的細(xì)胞系。 SP2/0是在表達(dá)基因工程抗體中用得最廣泛的淋巴類細(xì)胞，尤其在人鼠嵌合抗體的表達(dá)中用得最多，僅其表達(dá)產(chǎn)量通常較低，多用于實(shí)驗(yàn)研究。 NSO細(xì)胞系是能在胞內(nèi)合成輕鏈的NS1細(xì)胞的變異株，不再產(chǎn)生任何免疫球蛋白鏈，能用于表達(dá)各種全分子抗體，用該細(xì)胞系表達(dá)的抗人EGF受體的人源化改型抗體己在三期臨床試用中。 此外，也有用小鼠骨髓瘤P3UI細(xì)胞表達(dá)人鼠嵌合抗體。用于表達(dá)重組抗體的大鼠骨髓瘤細(xì)胞僅見有YB2/0細(xì)胞的報道，該細(xì)胞系是大鼠骨髓瘤細(xì)胞Y3與A0株大鼠脾細(xì)胞融合建立的，本身也不表達(dá)任何免疫球蛋白肽鏈。用骨髓瘤表達(dá)重組抗體時，所用的表達(dá)載體通常多選用免疫球蛋白的啟動子和增強(qiáng)子，因這

7、些細(xì)胞中含有它們所需要的轉(zhuǎn)錄因子，有利抗體的高表達(dá)。二、非淋巴類細(xì)胞 多種非淋巴類細(xì)胞都已被用于表達(dá)重組抗體，其中包括中國倉鼠卵巢(Chinese hamster ovary，CHO)細(xì)胞、猴腎來源的COS細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞、嗜傷細(xì)胞、Hela細(xì)胞、BHK細(xì)胞等等這些不同組織來源的不同類型的細(xì)胞，在蛋白質(zhì)的糖基化中可能會有所差別，但到目前為止，尚未發(fā)現(xiàn)從這些非淋巴類細(xì)胞中表達(dá)的重組抗體有功能性的缺陷。非淋巴類細(xì)胞在表達(dá)重組抗體時若使用免疫球蛋自自身的轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件，如啟動子、增強(qiáng)子等，其表達(dá)效率低、出此常采用其他較強(qiáng)的啟動子，如SV40早期基因和晚期基因啟動子(Psv40-EL),CHO 人巨

8、細(xì)胞病毒立早基因啟動子(PhCMV- IE)，病毒長末端重復(fù)序列LTR等等。通常非淋巴細(xì)胞表達(dá)重組抗體的產(chǎn)量低于淋巴類細(xì)胞，大多數(shù)在lugml以下。但近十余年的研究表明，通過一系列現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)，尤其是高效擴(kuò)增表達(dá)技術(shù)，可使重組抗體在CHO細(xì)胞中的表達(dá)產(chǎn)量達(dá)200ug/ml。 此外，CHO細(xì)胞遺傳背景清楚；轉(zhuǎn)染效率高；能適用于多種載體；能表達(dá)各種類型的重組抗體；可長期穩(wěn)定傳代并穩(wěn)定表達(dá)有功能活性抗體；可用無血清或無蛋白培養(yǎng)基培養(yǎng)，有利于抗體的純化；能進(jìn)行大規(guī)模培養(yǎng)。因而CHO細(xì)胞已成為生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)化培養(yǎng)的首選工程細(xì)胞系， 目前已批準(zhǔn)上市的基因工程抗體幾乎都是在CHO細(xì)胞中表達(dá)的。COS 另

9、一種常用于表達(dá)重組抗體的非淋巴類細(xì)胞是COS細(xì)胞，COS細(xì)胞是用sv40病毒的大T抗原轉(zhuǎn)染猴腎細(xì)胞獲得的一株能長期傳代的細(xì)胞系，含有SV40復(fù)制子的重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染COS細(xì)胞后，其重組DNA并不整合到細(xì)胞的染色體上、而是以游離的形式存在于細(xì)胞漿內(nèi)、并迅速大量復(fù)制達(dá)到很高的拷貝數(shù)； COS細(xì)胞也具有糖基化和裝P配分泌抗體的功能。 因此表達(dá)的各種抗體具有抗體的功能活性：由于轉(zhuǎn)染的外源DNA在COS細(xì)胞并不整合，而是以游離形式存在并復(fù)制，因此COS細(xì)胞最常用于抗體的瞬時表達(dá)。近年來COS細(xì)胞己用于篩選或檢測新構(gòu)建的新型抗體的活性及特征，也用于研究從噬菌體庫中篩選的抗體基因在真核細(xì)胞中表達(dá)的功能和特點(diǎn)

10、，還用于各種抗體突變體的篩選。而且，結(jié)構(gòu)更為復(fù)雜的雙特異性抗體也在COS細(xì)胞表達(dá)成功。 如抗人OKT3/轉(zhuǎn)鐵蛋白受體的雙特異抗體在COS細(xì)胞成功表達(dá)，其產(chǎn)量和活性均優(yōu)于在大腸桿菌中的表達(dá)。 三、抗體的高效表達(dá) 治療用基因工程抗體的臨床用藥量大，還遠(yuǎn)超過其它生物制品。以美國批準(zhǔn)上市的治療腫瘤的兩種人源化抗體Rituxan和Herceptin為例 ， Rituxan 一個療程約需用藥1.2g， Herceptin一個療程約需用藥0.88g，而正在臨床試用的抗VEGF人源化抗體，一個病人的最大用藥量甚至達(dá)到了7.8g，這些抗體類生物制品比細(xì)胞因子類生物制品用藥量高出幾萬倍。因而基因工程抗體的高效表達(dá)

11、已經(jīng)成為其臨床應(yīng)用的最重要的先決條件之一，甚至已影響到基因工程抗體的研究開發(fā)。目前已上市的以及正處于臨床試用中的基因工程抗體多達(dá)上百種，其中絕大多數(shù)那是在哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)的，更確切地說，是在CHO細(xì)胞中表達(dá)的。以下將簡要地敘述抗體在哺乳動物細(xì)胞高效表達(dá)所涉及的諸多要素(見表7-1)。抗體表達(dá)的策略 抗體在哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)的過程是抗體的重組表達(dá)載體與宿主細(xì)胞之間相互作用的一個復(fù)雜過程，包括5個相對獨(dú)立的環(huán)節(jié)： 抗體基因在宿主細(xì)胞染色體上的定位，主要是指抗體基因在染色體上的整合位點(diǎn)以及抗體基因的基因劑量。 抗體mRNA的轉(zhuǎn)錄，轉(zhuǎn)錄效率與mRNA的穩(wěn)定性是其中最重要的因素。 抗體基因的翻譯。 抗

12、體的翻譯后加工、組裝。 抗體的分泌；針對以上5個環(huán)節(jié)，設(shè)計(jì)相應(yīng)的措施提高各環(huán)節(jié)的效率，有助于提高基因工程抗體在哺乳動物細(xì)胞中的表達(dá)水平。此外還有一些實(shí)際操作因素的影響，如高表達(dá)細(xì)胞株的篩選，生產(chǎn)細(xì)胞的穩(wěn)定等等。（一）哺乳動物細(xì)胞表達(dá)抗體的載體系統(tǒng)（一）哺乳動物細(xì)胞表達(dá)抗體的載體系統(tǒng) 基因工程抗體的表達(dá)載體系統(tǒng)是獲得高表達(dá)基因工程抗體的表達(dá)載體系統(tǒng)是獲得高表達(dá)抗體細(xì)胞株的關(guān)鍵，在確定宿主細(xì)胞后，基抗體細(xì)胞株的關(guān)鍵，在確定宿主細(xì)胞后，基 因工程抗體的表達(dá)產(chǎn)量很大程度上由共表達(dá)載體因工程抗體的表達(dá)產(chǎn)量很大程度上由共表達(dá)載體的各表達(dá)調(diào)控元件及組織方式?jīng)Q定。的各表達(dá)調(diào)控元件及組織方式?jīng)Q定。 一般來說，一

13、般來說，表達(dá)載體含有以下幾種基本元件：骨架序列、選表達(dá)載體含有以下幾種基本元件：骨架序列、選擇標(biāo)志基因、表達(dá)盒以及一些特殊的調(diào)控序列。擇標(biāo)志基因、表達(dá)盒以及一些特殊的調(diào)控序列。除骨架序列外，其它元件對抗體的高效表達(dá)均存除骨架序列外，其它元件對抗體的高效表達(dá)均存在一定的影響。在一定的影響。載體系統(tǒng)分類載體系統(tǒng)分類 根據(jù)工程細(xì)胞克隆中目的基因拷貝數(shù)能否根據(jù)工程細(xì)胞克隆中目的基因拷貝數(shù)能否擴(kuò)增，表達(dá)載體可分為兩類：擴(kuò)增，表達(dá)載體可分為兩類： A 可擴(kuò)增表達(dá)載體系統(tǒng)?？蓴U(kuò)增表達(dá)載體系統(tǒng)。 B 不可擴(kuò)增表達(dá)的載體系統(tǒng)。不可擴(kuò)增表達(dá)的載體系統(tǒng)。 有一類特殊的選擇標(biāo)志基因可以在外有一類特殊的選擇標(biāo)志基因可以

14、在外界逐漸增高的選擇壓力下實(shí)現(xiàn)在宿主細(xì)胞界逐漸增高的選擇壓力下實(shí)現(xiàn)在宿主細(xì)胞染色體上的基因拷貝數(shù)的擴(kuò)增，并且可以染色體上的基因拷貝數(shù)的擴(kuò)增，并且可以連帶兩側(cè)的序列一同擴(kuò)增，從而提高產(chǎn)量。連帶兩側(cè)的序列一同擴(kuò)增，從而提高產(chǎn)量。二氫葉酸還原酶二氫葉酸還原酶(DHFR) 目前報道的基因工程抗體的高效表達(dá)載體系統(tǒng)目前報道的基因工程抗體的高效表達(dá)載體系統(tǒng)無一例外地采用了可擴(kuò)增表達(dá)的載體。上述的可無一例外地采用了可擴(kuò)增表達(dá)的載體。上述的可擴(kuò)增選擇標(biāo)志基因目前主要包括有二氫葉酸還原擴(kuò)增選擇標(biāo)志基因目前主要包括有二氫葉酸還原酶酶(dhfr)基因和谷氨酰胺合成酶基因和谷氨酰胺合成酶(GS)基因，其中基因，其中使

15、用最久、最廣泛、效果最好的使用最久、最廣泛、效果最好的dhfr基因。基因。 dhfr基因編碼的基因編碼的DHFR是細(xì)胞代謝途徑中的是細(xì)胞代謝途徑中的一個重要的酶當(dāng)細(xì)胞缺乏此酶或此酶失活一個重要的酶當(dāng)細(xì)胞缺乏此酶或此酶失活 時必須依靠在培養(yǎng)基中添加次黃嘌呤和胸腺嘧啶時必須依靠在培養(yǎng)基中添加次黃嘌呤和胸腺嘧啶脫氧核核苷才能存活。脫氧核核苷才能存活。 甲氨蝶呤甲氨蝶呤(MTX)是是 DHFR的類似底的類似底物可競爭抑制物可競爭抑制DHFR的活性。當(dāng)環(huán)境的活性。當(dāng)環(huán)境存在高濃度的存在高濃度的MTX，dhfr基因可自發(fā)在基因可自發(fā)在染色體上擴(kuò)增共拷貝數(shù)，以產(chǎn)生更多的染色體上擴(kuò)增共拷貝數(shù)，以產(chǎn)生更多的DH

16、FR來維持細(xì)胞的正常代謝，當(dāng)其擴(kuò)來維持細(xì)胞的正常代謝，當(dāng)其擴(kuò)增時，可以連帶它兩側(cè)的序列一起擴(kuò)增，增時，可以連帶它兩側(cè)的序列一起擴(kuò)增，dhfr基因共擴(kuò)增的序列的大小通常比該基因共擴(kuò)增的序列的大小通常比該基因要大許多，甚至可以達(dá)到上千個基因要大許多，甚至可以達(dá)到上千個kb，足以包含其兩翼的目的抗體基因，這種足以包含其兩翼的目的抗體基因，這種共擴(kuò)增也就實(shí)現(xiàn)了目的抗體基因的基因共擴(kuò)增也就實(shí)現(xiàn)了目的抗體基因的基因劑量的擴(kuò)增，從而極大地提高表達(dá)產(chǎn)量。劑量的擴(kuò)增，從而極大地提高表達(dá)產(chǎn)量。 dhfr基因在基因在CHO細(xì)胞中擴(kuò)增時能在染色細(xì)胞中擴(kuò)增時能在染色體上形成較穩(wěn)定的多拷貝序列，存在于宿體上形成較穩(wěn)定的多

17、拷貝序列，存在于宿主細(xì)胞染色體中。因此選擇可擴(kuò)增表達(dá)系主細(xì)胞染色體中。因此選擇可擴(kuò)增表達(dá)系統(tǒng)時最好選擇在統(tǒng)時最好選擇在CHO細(xì)胞中表達(dá)，另細(xì)胞中表達(dá)，另外內(nèi)源性外內(nèi)源性dhfr基因的存在會降低外源性基因的存在會降低外源性dhfr基因帶動擴(kuò)增目的基因的效果。因此基因帶動擴(kuò)增目的基因的效果。因此應(yīng)該選擇應(yīng)該選擇dhfr基因缺陷的基因缺陷的CHO-dhfr -細(xì)胞，細(xì)胞，以達(dá)到抗體的最高表達(dá)。以達(dá)到抗體的最高表達(dá)。谷氨酰胺合成酶谷氨酰胺合成酶(GS) 利用利用GS基因也可對目的基因進(jìn)行擴(kuò)增；基因也可對目的基因進(jìn)行擴(kuò)增；GS基基因是一種顯性基因擴(kuò)增選擇標(biāo)志基因，在染色體因是一種顯性基因擴(kuò)增選擇標(biāo)志基因

18、，在染色體上可以有較高的擴(kuò)增倍數(shù)，像上可以有較高的擴(kuò)增倍數(shù)，像dhfr基因一樣，擴(kuò)基因一樣，擴(kuò)增時連帶兩側(cè)序列一起擴(kuò)增。在外界存在蛋氨酸增時連帶兩側(cè)序列一起擴(kuò)增。在外界存在蛋氨酸磺酰胺磺酰胺(MSX)時。不表達(dá)或弱表達(dá)時。不表達(dá)或弱表達(dá)GS基因的細(xì)胞基因的細(xì)胞受到受到MSX的顯性篩選死亡，而的顯性篩選死亡，而GS基因表達(dá)較高基因表達(dá)較高的細(xì)胞則能存活。細(xì)胞對的細(xì)胞則能存活。細(xì)胞對MSX的耐受濃度與的耐受濃度與GS基因的表達(dá)水平呈劑量依賴關(guān)系，提高基因的表達(dá)水平呈劑量依賴關(guān)系，提高M(jìn)SX的濃的濃度將要求細(xì)胞有更高水平的基因表達(dá)造成度將要求細(xì)胞有更高水平的基因表達(dá)造成GS基基因和目的基因的擴(kuò)增，達(dá)

19、到目的基因的高表達(dá)。因和目的基因的擴(kuò)增，達(dá)到目的基因的高表達(dá)。表達(dá)載體的表達(dá)盒表達(dá)載體的表達(dá)盒 每一個表達(dá)載體均帶有目的基因的表達(dá)盒，每一個表達(dá)載體均帶有目的基因的表達(dá)盒，表達(dá)盒一般包括表達(dá)盒一般包括啟動子、克隆位點(diǎn)以及轉(zhuǎn)錄終止啟動子、克隆位點(diǎn)以及轉(zhuǎn)錄終止信號。信號。 因?yàn)榭贵w分泌前導(dǎo)肽通常適用于多種抗體基因?yàn)榭贵w分泌前導(dǎo)肽通常適用于多種抗體基因，所以還可以將抗體分泌前導(dǎo)肽也包因，所以還可以將抗體分泌前導(dǎo)肽也包 含在表達(dá)盒中。另外，還可以在抗體分泌前導(dǎo)肽含在表達(dá)盒中。另外，還可以在抗體分泌前導(dǎo)肽前再加上一些特殊的表達(dá)調(diào)控序列?？贵w基前再加上一些特殊的表達(dá)調(diào)控序列?？贵w基 因表達(dá)盒的組織形式己較

20、為固定，但其中各元件因表達(dá)盒的組織形式己較為固定，但其中各元件的選擇仍然有值得探討的地方。的選擇仍然有值得探討的地方。 1 啟動子 抗體基因表達(dá)盒中最關(guān)鍵的元件是驅(qū)動抗抗體基因表達(dá)盒中最關(guān)鍵的元件是驅(qū)動抗體基因表達(dá)的啟動子以及相應(yīng)的增強(qiáng)子。所有體基因表達(dá)的啟動子以及相應(yīng)的增強(qiáng)子。所有的真核啟動子都含有兩個基本組成部分，的真核啟動子都含有兩個基本組成部分，TATA盒和其下游的富含盒和其下游的富含GC的序列，的序列，TATA盒盒確定了轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，富含確定了轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，富含GC的序列則決定的序列則決定轉(zhuǎn)錄起始頻率，因而不同的啟動子產(chǎn)生不同的轉(zhuǎn)錄起始頻率，因而不同的啟動子產(chǎn)生不同的轉(zhuǎn)錄起始頻率。轉(zhuǎn)

21、錄起始頻率。 目前使用的哺乳類細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)的啟動于目前使用的哺乳類細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)的啟動于主要有病毒啟動子，如主要有病毒啟動子，如SV40早期基因早期基因 和晚期和晚期基因的啟動子、人巨細(xì)胞病毒立早基因啟動子、基因的啟動子、人巨細(xì)胞病毒立早基因啟動子、病毒的長末端重復(fù)序列病毒的長末端重復(fù)序列(LTR)等；哺乳類動物等；哺乳類動物細(xì)胞基因的啟動子，如轉(zhuǎn)錄因于細(xì)胞基因的啟動子，如轉(zhuǎn)錄因于EF-1的啟動的啟動子、人干擾素子、人干擾素-的啟動子、各種鼠的啟動子、各種鼠IgG啟動子啟動子等。等。2 核糖體進(jìn)入位點(diǎn) 啟動子下游有真核的核糖體進(jìn)入位點(diǎn)，它對于啟動子下游有真核的核糖體進(jìn)入位點(diǎn)，它對于所有的抗體基因

22、的表達(dá)都是必要的。真核的核糖體進(jìn)所有的抗體基因的表達(dá)都是必要的。真核的核糖體進(jìn)入位點(diǎn)通常為入位點(diǎn)通常為GCCGCC A/GCCAUGG+4的共有序列，的共有序列，它通過調(diào)控核糖體進(jìn)入它通過調(diào)控核糖體進(jìn)入mRNA起始翻譯的頻率來影響起始翻譯的頻率來影響目的基因的翻譯效率，從而影響目的基因的表達(dá)水平。目的基因的翻譯效率，從而影響目的基因的表達(dá)水平。通常載體均帶有核糖體進(jìn)入位點(diǎn)，但其起始翻譯的效通常載體均帶有核糖體進(jìn)入位點(diǎn)，但其起始翻譯的效率并不太高。前面提到的率并不太高。前面提到的IRES具有較強(qiáng)的起始翻譯具有較強(qiáng)的起始翻譯的能力。最近的一些研究發(fā)現(xiàn)在某些哺乳動物細(xì)胞的的能力。最近的一些研究發(fā)現(xiàn)在

23、某些哺乳動物細(xì)胞的基因前，存在某些類似基因前，存在某些類似IRES的序列、可以獨(dú)立啟動的序列、可以獨(dú)立啟動翻譯，并且產(chǎn)生的翻譯效率很高，可以稱之為翻譯型翻譯，并且產(chǎn)生的翻譯效率很高，可以稱之為翻譯型增強(qiáng)子。增強(qiáng)子。3 轉(zhuǎn)錄終止信號和轉(zhuǎn)錄終止信號和polyA加尾信加尾信號號 載體的轉(zhuǎn)錄終止信號和多聚腺苷酸載體的轉(zhuǎn)錄終止信號和多聚腺苷酸(PolyA)加尾信加尾信號也在很大程度上影響抗體基因的表達(dá)。轉(zhuǎn)錄的終止號也在很大程度上影響抗體基因的表達(dá)。轉(zhuǎn)錄的終止和和polyA尾巴的合成影響尾巴的合成影響mRNA的有效合成和穩(wěn)定性。的有效合成和穩(wěn)定性。強(qiáng)轉(zhuǎn)錄終止信號和加尾信號可提高胞漿中能進(jìn)行有效強(qiáng)轉(zhuǎn)錄終止信

24、號和加尾信號可提高胞漿中能進(jìn)行有效翻譯的翻譯的mRNA濃度，提高表達(dá)水平濃度，提高表達(dá)水平 。目前使用最廣泛。目前使用最廣泛的是牛生長激素的轉(zhuǎn)錄終止信號和加尾信號的是牛生長激素的轉(zhuǎn)錄終止信號和加尾信號(BGH poly A site)，它的轉(zhuǎn)錄終止作用強(qiáng)于，它的轉(zhuǎn)錄終止作用強(qiáng)于SV40的。雖然的。雖然它也能有效地終止轉(zhuǎn)錄，并在以前被廣泛采用，但最它也能有效地終止轉(zhuǎn)錄，并在以前被廣泛采用，但最近的高效表達(dá)載體已極少采用。近的高效表達(dá)載體已極少采用。 另外的此轉(zhuǎn)錄終止信號和加尾信號也有被采用的，另外的此轉(zhuǎn)錄終止信號和加尾信號也有被采用的，如人如人-actin的的polyA和抗體本身的和抗體本身的p

25、oly A site，均獲，均獲得滿意的效果。另外，將兩個轉(zhuǎn)錄終止信號和加尾信得滿意的效果。另外，將兩個轉(zhuǎn)錄終止信號和加尾信號串聯(lián)使用也可能增強(qiáng)終止轉(zhuǎn)錄的強(qiáng)度，例如同時利號串聯(lián)使用也可能增強(qiáng)終止轉(zhuǎn)錄的強(qiáng)度，例如同時利用抗體恒定區(qū)基出組序列的轉(zhuǎn)錄終止信號和加尾信號用抗體恒定區(qū)基出組序列的轉(zhuǎn)錄終止信號和加尾信號以從載體上具有的以從載體上具有的BGH polyA信號。信號。(二)抗體高效表達(dá)的其他因素 1 抗體基因的結(jié)構(gòu)抗體基因的結(jié)構(gòu) 2 抗體表達(dá)克隆的篩選抗體表達(dá)克隆的篩選 3 宿主細(xì)胞的選擇和篩選宿主細(xì)胞的選擇和篩選有內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn) invitrogenQiagene第二節(jié) 大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)

26、 一一 大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)的特點(diǎn)大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)的特點(diǎn) 是應(yīng)用最廣的源和表達(dá)系統(tǒng)，是應(yīng)用最廣的源和表達(dá)系統(tǒng)， 產(chǎn)量高產(chǎn)量高 ， 成本低成本低 ， 周期短等特點(diǎn)。周期短等特點(diǎn)。以下簡述原核表達(dá)載體的構(gòu)成元件及特點(diǎn)以下簡述原核表達(dá)載體的構(gòu)成元件及特點(diǎn)表達(dá)策略 一、基因表達(dá)信號一、基因表達(dá)信號如果將外源基因插入標(biāo)準(zhǔn)的克隆載體，不可能合如果將外源基因插入標(biāo)準(zhǔn)的克隆載體，不可能合成重組蛋白，因?yàn)榛虻谋磉_(dá)依賴于基因周圍的一組成重組蛋白，因?yàn)榛虻谋磉_(dá)依賴于基因周圍的一組信號，這些信號必須能被細(xì)菌識別。這些信號都是一信號，這些信號必須能被細(xì)菌識別。這些信號都是一些短的核苷酸序列，為轉(zhuǎn)錄和翻譯提供信號，三個最

27、些短的核苷酸序列，為轉(zhuǎn)錄和翻譯提供信號，三個最重要的信號：重要的信號：1） promoter: 是轉(zhuǎn)錄起始信號，在是轉(zhuǎn)錄起始信號，在E. coli中，中，啟動子必須能被啟動子必須能被RNA聚合酶的聚合酶的sigma亞基所識別。亞基所識別。2） Terminator：轉(zhuǎn)錄結(jié)束的位點(diǎn)，終止子一般：轉(zhuǎn)錄結(jié)束的位點(diǎn)，終止子一般是可以自我配對形成是可以自我配對形成stem-loop的核苷酸序列。的核苷酸序列。3） 核糖體結(jié)合位點(diǎn)：能被核糖體識別的位點(diǎn)，核糖體結(jié)合位點(diǎn)：能被核糖體識別的位點(diǎn)，轉(zhuǎn)錄成轉(zhuǎn)錄成mRNA分子后，核糖體在這一位點(diǎn)上結(jié)合。分子后，核糖體在這一位點(diǎn)上結(jié)合。高等生物的基因也被表達(dá)信號所包圍

28、，但他們的高等生物的基因也被表達(dá)信號所包圍，但他們的核苷酸序列與核苷酸序列與E. coli的并不相同。比較的并不相同。比較E. coli和人類和人類的啟動子，有一些是相同的，但是的啟動子，有一些是相同的，但是E. coli的的RNA聚合聚合酶不可能結(jié)合到人類的啟動子上，細(xì)菌不能識別人類酶不可能結(jié)合到人類的啟動子上，細(xì)菌不能識別人類基因的表達(dá)信號。基因的表達(dá)信號。 解決的方法是將外源基因插入載體中，使解決的方法是將外源基因插入載體中，使其處于一系列的其處于一系列的E. coli表達(dá)信號的控制之下。表達(dá)信號的控制之下。這樣基因可以轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。克隆載體提供了表這樣基因可以轉(zhuǎn)錄和表達(dá)?？寺≥d體提供了表

29、達(dá)的信號，所以可以用來生產(chǎn)重組蛋白，被稱達(dá)的信號，所以可以用來生產(chǎn)重組蛋白，被稱為表達(dá)載體。為表達(dá)載體。 （一）（一） 啟動子啟動子啟動子是表達(dá)載體的最重要的組成成分，啟動子是表達(dá)載體的最重要的組成成分，這是因?yàn)閱幼涌刂屏嘶虮磉_(dá)的第一個階段，這是因?yàn)閱幼涌刂屏嘶虮磉_(dá)的第一個階段，決定了決定了mRNA合成的速度。獲得重組蛋白的數(shù)合成的速度。獲得重組蛋白的數(shù)量很大程度上取決于表達(dá)載體所攜帶的啟動量很大程度上取決于表達(dá)載體所攜帶的啟動子。子。 所有所有E. coli啟動子都有兩個保守序列，保啟動子都有兩個保守序列，保守序列的變化是影響轉(zhuǎn)錄效率的主要因素。強(qiáng)守序列的變化是影響轉(zhuǎn)錄效率的主要因素

30、。強(qiáng)啟動子可以啟動高效率的表達(dá)，合成大量表達(dá)啟動子可以啟動高效率的表達(dá)，合成大量表達(dá)產(chǎn)物。相反，弱啟動子，在細(xì)胞中表達(dá)量較低。產(chǎn)物。相反，弱啟動子，在細(xì)胞中表達(dá)量較低。表達(dá)載體應(yīng)該含有強(qiáng)啟動子，這樣克隆的基因表達(dá)載體應(yīng)該含有強(qiáng)啟動子，這樣克隆的基因可以以最高的速度表達(dá)?？梢砸宰罡叩乃俣缺磉_(dá)。建立表達(dá)載體的另一個需要考慮的因素是建立表達(dá)載體的另一個需要考慮的因素是啟動子的調(diào)控，主要有兩種調(diào)控方式：啟動子的調(diào)控，主要有兩種調(diào)控方式：誘導(dǎo)：一個誘導(dǎo)的基因是在加入底物后基誘導(dǎo)：一個誘導(dǎo)的基因是在加入底物后基因的表達(dá)才能啟動因的表達(dá)才能啟動抑制：可抑制的基因是在加入調(diào)控物后表抑制：可抑制的基因是在加入調(diào)

31、控物后表達(dá)被關(guān)閉。達(dá)被關(guān)閉。a) 啟動子的選擇真核原核啟動子差異 基因調(diào)控是一個復(fù)雜的過程，啟動子的參與僅僅基因調(diào)控是一個復(fù)雜的過程，啟動子的參與僅僅是間接的。許多參與誘導(dǎo)和抑制的序列存在于啟是間接的。許多參與誘導(dǎo)和抑制的序列存在于啟動子的周圍。所以誘導(dǎo)和抑制啟動子的化學(xué)試劑動子的周圍。所以誘導(dǎo)和抑制啟動子的化學(xué)試劑也同樣調(diào)控克隆基因的表達(dá)。也同樣調(diào)控克隆基因的表達(dá)。如果重組蛋白對細(xì)菌有害，其合成必須嚴(yán)格如果重組蛋白對細(xì)菌有害，其合成必須嚴(yán)格控制在毒性的水平之下。可以利用調(diào)控物抑制基控制在毒性的水平之下?？梢岳谜{(diào)控物抑制基因的表達(dá)。即使重組蛋白對寄主細(xì)胞無害，仍然因的表達(dá)。即使重組蛋白對寄主

32、細(xì)胞無害，仍然需要調(diào)控克隆基因的表達(dá)，因?yàn)槌掷m(xù)的高水平表需要調(diào)控克隆基因的表達(dá)，因?yàn)槌掷m(xù)的高水平表達(dá)可以影響重組質(zhì)粒的復(fù)制，最終導(dǎo)致表達(dá)產(chǎn)物達(dá)可以影響重組質(zhì)粒的復(fù)制，最終導(dǎo)致表達(dá)產(chǎn)物的下降。的下降。b) 表達(dá)載體應(yīng)用的啟動子 幾種使用頻率最高的啟動子：幾種使用頻率最高的啟動子：1) lac啟動子：控制編碼啟動子：控制編碼-乳糖苷酶的乳糖苷酶的lacZ基因基因轉(zhuǎn)錄的序列，可以被轉(zhuǎn)錄的序列，可以被IPTG所誘導(dǎo)，所以加入誘導(dǎo)物后，所誘導(dǎo)，所以加入誘導(dǎo)物后，可以誘導(dǎo)啟動子下游的外源基因的表達(dá)?？梢哉T導(dǎo)啟動子下游的外源基因的表達(dá)。2) trp啟動子：色氨酸啟動子可以被色氨酸抑制，啟動子：色氨酸啟動子可

33、以被色氨酸抑制，也可以很容易的被也可以很容易的被3-吲哚丙烯酸誘導(dǎo)。吲哚丙烯酸誘導(dǎo)。3) tac啟動子：是啟動子：是lac和和trp啟動子的雜交分子，啟動子的雜交分子，比兩者都要強(qiáng)，同樣可以被比兩者都要強(qiáng)，同樣可以被IPTG所誘導(dǎo)。所誘導(dǎo)。4) PL啟動子：是負(fù)責(zé)啟動子：是負(fù)責(zé) DNA分子轉(zhuǎn)錄的啟動分子轉(zhuǎn)錄的啟動子之一。子之一。PL啟動子是可以被啟動子是可以被E. coli RNA聚合酶所識聚合酶所識別的強(qiáng)啟動子，轉(zhuǎn)而轉(zhuǎn)錄噬菌體別的強(qiáng)啟動子，轉(zhuǎn)而轉(zhuǎn)錄噬菌體DNA。該啟動子可以。該啟動子可以被被cI基因產(chǎn)物所抑制。攜帶基因產(chǎn)物所抑制。攜帶PL啟動子的載體使用溫啟動子的載體使用溫度敏感的度敏感的E

34、. coli cI突變體。在較低的溫度下，突變體突變體。在較低的溫度下，突變體所產(chǎn)生的所產(chǎn)生的cI蛋白可以抑制蛋白可以抑制 PL啟動子，在較高的溫度啟動子，在較高的溫度下，蛋白失活可以導(dǎo)致克隆基因的轉(zhuǎn)錄。下，蛋白失活可以導(dǎo)致克隆基因的轉(zhuǎn)錄。啟動子下游的SD序列 啟動子下游需有啟動子下游需有SD(Shine and Dalgarno)序列，序列，這段序列是核糖體結(jié)合位點(diǎn)這段序列是核糖體結(jié)合位點(diǎn)(RBS)的一部分研的一部分研究發(fā)現(xiàn)究發(fā)現(xiàn)SD序列為序列為UAAGGAGG時比時比AAGGA翻譯翻譯效率高，起始密碼子效率高，起始密碼子ATG與與SD序列序列UAAGGAGG的最適距離為的最適距離為6-8b

35、P，與，與A AGGA的距離的距離5-7bP為為好，在分泌表達(dá)時需要有前導(dǎo)序列，大腸桿菌中好，在分泌表達(dá)時需要有前導(dǎo)序列，大腸桿菌中比較常用的幾種前導(dǎo)肽序列為比較常用的幾種前導(dǎo)肽序列為pelB(果膠酶基因果膠酶基因)、OmpA(外膜蛋白基因外膜蛋白基因)、OmpF等等 ，使用何種前，使用何種前導(dǎo)肽對產(chǎn)量影響并不大。導(dǎo)肽對產(chǎn)量影響并不大。解釋SD序列 SD序列（序列（Shine-Dalgarno sequence）：）：mRNA中用中用于結(jié)合原核生物核糖體的序列。于結(jié)合原核生物核糖體的序列。 原核生物中，核糖體受一段富含嘌呤的原核生物中，核糖體受一段富含嘌呤的SD序列引導(dǎo)從而序列引導(dǎo)從而識別識別

36、AUG起始密碼。這段位于起始密碼。這段位于AUG上游的序列和上游的序列和30S核核糖體亞基的糖體亞基的16s rRNA一段序列互補(bǔ)，保守區(qū)一段序列互補(bǔ)，保守區(qū)5-UAAGGAGGUGA-3，核糖體結(jié)合位點(diǎn)，核糖體結(jié)合位點(diǎn)RBS和起始密和起始密碼碼AUG之間的距離以及堿基的組成對翻譯的效率有顯著之間的距離以及堿基的組成對翻譯的效率有顯著影響，在設(shè)計(jì)的時候要注意。而真核生物的那段保守序影響，在設(shè)計(jì)的時候要注意。而真核生物的那段保守序列成為列成為Kozak序列（序列（5-GCCACCAUGG-3），要高效），要高效翻譯，翻譯，+1G和和-3A就很重要。不過如果就很重要。不過如果mRNA沒有這段沒有這

37、段Kozak序列而有一段適當(dāng)長度序列而有一段適當(dāng)長度5UTR也能夠有效地在無也能夠有效地在無細(xì)胞體系中得到翻譯。有趣的是，還有數(shù)據(jù)提示，大腸細(xì)胞體系中得到翻譯。有趣的是，還有數(shù)據(jù)提示，大腸桿菌的核糖體通常只認(rèn)得桿菌的核糖體通常只認(rèn)得SD序列，而真核比如網(wǎng)織紅細(xì)序列，而真核比如網(wǎng)織紅細(xì)胞的核糖體能識別胞的核糖體能識別Kozak序列，也能識別序列，也能識別SD序列。序列。 表達(dá)產(chǎn)物中需要加入tag 在表達(dá)產(chǎn)物中加入標(biāo)簽序列在表達(dá)產(chǎn)物中加入標(biāo)簽序列(tag squence)后后可以方便地利用可以方便地利用ELISA等常規(guī)的免疫學(xué)方法進(jìn)等常規(guī)的免疫學(xué)方法進(jìn)行活性檢測、定量及親和層析純化產(chǎn)物；通常行活性

38、檢測、定量及親和層析純化產(chǎn)物；通常這段標(biāo)簽位點(diǎn)都置于產(chǎn)物的這段標(biāo)簽位點(diǎn)都置于產(chǎn)物的C-末端，這樣一般末端，這樣一般不會影響抗體片段的活性，在進(jìn)行直接不會影響抗體片段的活性，在進(jìn)行直接ELISA時也能保持標(biāo)簽位點(diǎn)的活性。目前常用的標(biāo)簽時也能保持標(biāo)簽位點(diǎn)的活性。目前常用的標(biāo)簽序列有組氨酸串、序列有組氨酸串、FLAG、c-myc10肽及肽及Strep標(biāo)簽。組氨酸串為標(biāo)簽。組氨酸串為5-6個組氨酸，它可以與個組氨酸，它可以與Ni+、Zn2+及及Co+等陽離子結(jié)合，因此帶有等陽離子結(jié)合，因此帶有His的抗體的抗體片段可以通過金屬螯合層析片段可以通過金屬螯合層析 富集、純化。疏水性多肽序列富集、純化。疏水

39、性多肽序列DYKDDDDK被稱被稱為為“FLAG”也可用于檢測和純化重組蛋白，也可用于檢測和純化重組蛋白， 它的特點(diǎn)是既可置于它的特點(diǎn)是既可置于N末端，又可置于末端，又可置于C末端。末端。C-myc10肽是鼠單克隆抗體肽是鼠單克隆抗體9E10的結(jié)合表的結(jié)合表 位該標(biāo)簽的特點(diǎn)是特異件很高。位該標(biāo)簽的特點(diǎn)是特異件很高。Strep是一段是一段合成的合成的9肽，其序列為肽，其序列為AWRHPQFGG，它能與，它能與 鏈親合素鏈親合素(streptavidin)結(jié)合，用于柱層析純化，結(jié)合，用于柱層析純化，其不足之處是只能連于其不足之處是只能連于C末端。經(jīng)改進(jìn)的末端。經(jīng)改進(jìn)的strep tag II (S

40、NWSHPQFEK)的親和力有所降低，但的親和力有所降低，但可以連于可以連于N端發(fā)揮作用。端發(fā)揮作用。二、重組抗體片段的可溶表達(dá) 由于可溶表達(dá)的抗體可能對宿主菌產(chǎn)生毒性，由于可溶表達(dá)的抗體可能對宿主菌產(chǎn)生毒性，因此可溶表達(dá)載體應(yīng)選用嚴(yán)格調(diào)控的誘導(dǎo)因此可溶表達(dá)載體應(yīng)選用嚴(yán)格調(diào)控的誘導(dǎo) 型啟動子來降低本底，過強(qiáng)的啟動子因?yàn)閷Υ竽c型啟動子來降低本底，過強(qiáng)的啟動子因?yàn)閷Υ竽c桿菌的分泌、加工能力要求過高而并不能增桿菌的分泌、加工能力要求過高而并不能增 加分泌表達(dá)的產(chǎn)量，有時甚至?xí)档涂扇鼙磉_(dá)的加分泌表達(dá)的產(chǎn)量，有時甚至?xí)档涂扇鼙磉_(dá)的產(chǎn)量，誘導(dǎo)的強(qiáng)度和持續(xù)時間也會影響產(chǎn)物的正產(chǎn)量，誘導(dǎo)的強(qiáng)度和持續(xù)時間也

41、會影響產(chǎn)物的正確折疊，多數(shù)情況下可以利用降低溫度來增加可確折疊，多數(shù)情況下可以利用降低溫度來增加可溶表達(dá)的產(chǎn)量，經(jīng)驗(yàn)值為溶表達(dá)的產(chǎn)量，經(jīng)驗(yàn)值為24-32度。度。(一)可溶表達(dá)的實(shí)驗(yàn)方案 從新鮮涂布的平板上挑取單菌落，在起從新鮮涂布的平板上挑取單菌落，在起始培養(yǎng)基中培養(yǎng)后轉(zhuǎn)接入始培養(yǎng)基中培養(yǎng)后轉(zhuǎn)接入50ml含抗生素的豐富含抗生素的豐富培養(yǎng)基培養(yǎng)基(2YT或或LB)中培養(yǎng)，如果要進(jìn)行更大體中培養(yǎng)，如果要進(jìn)行更大體積的培養(yǎng)，則應(yīng)將單菌落接種在積的培養(yǎng)，則應(yīng)將單菌落接種在4ml豐富培養(yǎng)豐富培養(yǎng)基中基中37度培養(yǎng)度培養(yǎng)4-8h，然后再以此培養(yǎng)基轉(zhuǎn)接至，然后再以此培養(yǎng)基轉(zhuǎn)接至大量培養(yǎng)基。如需過夜培養(yǎng)應(yīng)該在

42、大量培養(yǎng)基。如需過夜培養(yǎng)應(yīng)該在30度或更低度或更低溫度下培養(yǎng)，而不宜在溫度下培養(yǎng)，而不宜在37度培養(yǎng)過夜。誘導(dǎo)在度培養(yǎng)過夜。誘導(dǎo)在37度培養(yǎng)至度培養(yǎng)至OD600約為約為0.4-1.0時開始進(jìn)行。誘時開始進(jìn)行。誘導(dǎo)條件因啟動子不同而異，參見表導(dǎo)條件因啟動子不同而異，參見表7-2。加入。加入誘導(dǎo)物后繼續(xù)振蕩培養(yǎng)誘導(dǎo)物后繼續(xù)振蕩培養(yǎng)3h或過夜培養(yǎng)誘導(dǎo)進(jìn)或過夜培養(yǎng)誘導(dǎo)進(jìn)行的時間取決于啟動子的特性和誘導(dǎo)溫度。以行的時間取決于啟動子的特性和誘導(dǎo)溫度。以下列出不同溫度下誘導(dǎo)培養(yǎng)的時間的經(jīng)驗(yàn)值：下列出不同溫度下誘導(dǎo)培養(yǎng)的時間的經(jīng)驗(yàn)值：15-25度過夜誘導(dǎo)、度過夜誘導(dǎo)、30度誘導(dǎo)度誘導(dǎo)5-6h或更長時間、或更長

43、時間、37度誘導(dǎo)度誘導(dǎo)3-4h。（二）可溶表達(dá)條件的優(yōu)化 1 質(zhì)粒拷貝數(shù)質(zhì)?？截悢?shù) （適中）（適中） 2 mRNA的數(shù)量與蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性的數(shù)量與蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性 3 抗體片斷的折疊與組裝抗體片斷的折疊與組裝第三節(jié)第三節(jié) 抗體在酵母及昆蟲細(xì)胞中的表達(dá)抗體在酵母及昆蟲細(xì)胞中的表達(dá) 一、昆蟲表達(dá)系統(tǒng)及其在基因工程抗體中一、昆蟲表達(dá)系統(tǒng)及其在基因工程抗體中的應(yīng)用的應(yīng)用 1 以重組桿狀病毒為載體的昆蟲表達(dá)系以重組桿狀病毒為載體的昆蟲表達(dá)系 統(tǒng)。統(tǒng)。 2 桿狀病毒表達(dá)載體（宿主細(xì)胞為桿狀病毒表達(dá)載體（宿主細(xì)胞為sf9） 3 桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)的效率與加工能力桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)的效率與加工能力 4 穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的昆蟲

44、表達(dá)系統(tǒng)穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的昆蟲表達(dá)系統(tǒng)多核多角體病毒MNPV特點(diǎn)： 1 具完整的感染性具完整的感染性 2 不依賴輔助病毒不依賴輔助病毒 3 表達(dá)產(chǎn)物多半可溶表達(dá)產(chǎn)物多半可溶 4 在自然界生存時間短暫，安全。在自然界生存時間短暫，安全。 5 不能感染脊椎動物。不能感染脊椎動物。Invitrogen公司新式桿狀病毒和昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)新式桿狀病毒和昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng) 特點(diǎn)：特點(diǎn)： 外源基因表達(dá)產(chǎn)量高（外源基因表達(dá)產(chǎn)量高（1-500mg/L1-500mg/L）；昆蟲）；昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)條件簡單；昆蟲病毒宿主范圍窄，細(xì)胞培養(yǎng)條件簡單；昆蟲病毒宿主范圍窄，不感染脊錐動物細(xì)胞，具較高的安全性。不感染脊錐動物細(xì)胞，具較高的

45、安全性。 轉(zhuǎn)化方式：轉(zhuǎn)化方式： 同源重組：磷酸鈣共沉淀法同源重組：磷酸鈣共沉淀法 啟動子：啟動子： 多角體蛋白啟動子：非常強(qiáng)，其控制的外多角體蛋白啟動子：非常強(qiáng)，其控制的外源蛋白的表達(dá)可達(dá)到細(xì)胞蛋白的源蛋白的表達(dá)可達(dá)到細(xì)胞蛋白的3030。 P10P10蛋白啟動子蛋白啟動子 已有系統(tǒng)：已有系統(tǒng)： ClontechClontech公司的公司的BacPAKBacPAKTMTM桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)，桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)，IPLB-Sf21 CellsIPLB-Sf21 Cells，提供兩個轉(zhuǎn)移質(zhì)粒：，提供兩個轉(zhuǎn)移質(zhì)粒：pBacPAK8pBacPAK8和和pBacPAK9pBacPAK9 BaculoDirec

46、tBaculoDirect 桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)是生產(chǎn)桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)是生產(chǎn)重組桿狀病毒最快和最容易的方法重組桿狀病毒最快和最容易的方法 不需要煩瑣的細(xì)菌轉(zhuǎn)化和不需要煩瑣的細(xì)菌轉(zhuǎn)化和bacmidbacmid的分離，或的分離，或是將轉(zhuǎn)移載體和線性桿狀病毒是將轉(zhuǎn)移載體和線性桿狀病毒DNADNA共轉(zhuǎn)染進(jìn)昆蟲共轉(zhuǎn)染進(jìn)昆蟲細(xì)胞。細(xì)胞。經(jīng)過生物工程改造的經(jīng)過生物工程改造的BaculoDirectBaculoDirect線性線性DNADNA（桿狀病毒基因組），利用快速和有效的（桿狀病毒基因組），利用快速和有效的GatewayGateway 重組反應(yīng)代替了這些煩瑣的工作。重組反應(yīng)代替了這些煩瑣的工作。 使用使用B

47、aculoDirectBaculoDirect系統(tǒng)，從最初的反應(yīng)混系統(tǒng)，從最初的反應(yīng)混合物的轉(zhuǎn)染到桿狀病毒苗的分離，只需要花費(fèi)合物的轉(zhuǎn)染到桿狀病毒苗的分離，只需要花費(fèi)大約大約8 8小時小時僅花費(fèi)了不到傳統(tǒng)方法一半的時僅花費(fèi)了不到傳統(tǒng)方法一半的時間！間！ BaculoDirectBaculoDirect系統(tǒng)利用快速、簡便的系統(tǒng)利用快速、簡便的GatewayGateway技術(shù)技術(shù)。 BaculoDirectBaculoDirect線性線性DNADNA包含了包含了attRattR位點(diǎn)，允位點(diǎn)，允許與包含有目的基因的許與包含有目的基因的GatewayGateway入門克隆進(jìn)行入門克隆進(jìn)行有效的重組。有

48、效的重組。 將將entryentry克隆、克隆、BaculoDirectBaculoDirect線性線性DNADNA和和GatewayGateway LRLR ClonaseClonase酶混合物稍加混勻，在酶混合物稍加混勻，在室溫下反應(yīng)室溫下反應(yīng)1 1小時即可。小時即可。 最終的反應(yīng)混和物中包含有攜帶目的基因的最終的反應(yīng)混和物中包含有攜帶目的基因的桿狀病毒，可以直接用于轉(zhuǎn)染昆蟲細(xì)胞（桿狀病毒，可以直接用于轉(zhuǎn)染昆蟲細(xì)胞（sf9sf9或或sf21sf21）。）。 酵母表達(dá)載體一、外源基因在畢赤酵母中的表達(dá)一、外源基因在畢赤酵母中的表達(dá)特特 點(diǎn)點(diǎn)： 酵母生長快，易培養(yǎng)，成本低，遺傳操作酵母生長快，

49、易培養(yǎng)，成本低，遺傳操作方便，對外源蛋白能進(jìn)行翻譯后修飾和加方便，對外源蛋白能進(jìn)行翻譯后修飾和加工。工。 畢赤酵母利用畢赤酵母利用AOX1AOX1強(qiáng)啟動子或者強(qiáng)啟動子或者3-3-磷酸甘磷酸甘油醛脫氫酶（油醛脫氫酶（GAPDHGAPDH）啟動子，可高效表達(dá)）啟動子，可高效表達(dá)外源基因。外源基因。 畢赤酵母的細(xì)胞密度可達(dá)畢赤酵母的細(xì)胞密度可達(dá)150g/L150g/L 畢赤酵母可進(jìn)行糖基化，糖基化位點(diǎn)畢赤酵母可進(jìn)行糖基化，糖基化位點(diǎn)（Asn-X-Ser/ThrAsn-X-Ser/Thr） 畢赤酵母表達(dá)外源蛋白通常步驟：畢赤酵母表達(dá)外源蛋白通常步驟： 外源基因表達(dá)載體的構(gòu)建外源基因表達(dá)載體的構(gòu)建 載體

50、載體DNADNA導(dǎo)入酵母細(xì)胞導(dǎo)入酵母細(xì)胞 篩選表達(dá)載體染色體整合的菌株篩選表達(dá)載體染色體整合的菌株 撿出外源蛋白表達(dá)情況撿出外源蛋白表達(dá)情況 優(yōu)化發(fā)酵條件建立高密度發(fā)酵方法優(yōu)化發(fā)酵條件建立高密度發(fā)酵方法 建立外源蛋白純化工藝建立外源蛋白純化工藝二、酵母表達(dá)系統(tǒng) 酵母是一類單細(xì)胞真核生物，具備易于操作，遺傳酵母是一類單細(xì)胞真核生物，具備易于操作，遺傳背景清楚，生產(chǎn)成本低等原核生物的特點(diǎn)，又具有真核背景清楚，生產(chǎn)成本低等原核生物的特點(diǎn)，又具有真核生物的折疊、分泌機(jī)制，可以完成真核生物特異的蛋白生物的折疊、分泌機(jī)制，可以完成真核生物特異的蛋白酶解、折疊、糖基化等翻譯后修飾過程。酵母的生長速酶解、折疊

51、、糖基化等翻譯后修飾過程。酵母的生長速度（度（1- 3h /代）比昆蟲或其它動物細(xì)胞（約代）比昆蟲或其它動物細(xì)胞（約 l d/代）快許代）快許多，培養(yǎng)基成分簡單。使用無血清培養(yǎng)基更可以簡化蛋多，培養(yǎng)基成分簡單。使用無血清培養(yǎng)基更可以簡化蛋白產(chǎn)物純化過程，在酵母表達(dá)系統(tǒng)中應(yīng)用最多的是釀酒白產(chǎn)物純化過程，在酵母表達(dá)系統(tǒng)中應(yīng)用最多的是釀酒酵母和畢赤酵母。釀酒是使用最早，應(yīng)用最廣的酵母菌酵母和畢赤酵母。釀酒是使用最早，應(yīng)用最廣的酵母菌株但目前有被畢赤酵母取代的趨勢。與釀酒酵母相株但目前有被畢赤酵母取代的趨勢。與釀酒酵母相比畢赤醉母有幾個突出的優(yōu)點(diǎn)，它的乙醇氧化酶基因比畢赤醉母有幾個突出的優(yōu)點(diǎn)，它的乙醇

52、氧化酶基因（AOXI）是一個甲醇誘導(dǎo)表達(dá)的嚴(yán)格調(diào)控基因，啟動活）是一個甲醇誘導(dǎo)表達(dá)的嚴(yán)格調(diào)控基因，啟動活性高，滲漏低在加人甲醇后可以迅速啟動轉(zhuǎn)錄；它比性高，滲漏低在加人甲醇后可以迅速啟動轉(zhuǎn)錄；它比釀酒酵母更適合高密度培養(yǎng)，這對于提高重組蛋白的產(chǎn)釀酒酵母更適合高密度培養(yǎng)，這對于提高重組蛋白的產(chǎn)量至關(guān)重要；它的量至關(guān)重要；它的 N 糖基化方式也更接近高等真核生糖基化方式也更接近高等真核生物。對該體系的載體構(gòu)建、表達(dá)特點(diǎn)和體系優(yōu)化已經(jīng)進(jìn)物。對該體系的載體構(gòu)建、表達(dá)特點(diǎn)和體系優(yōu)化已經(jīng)進(jìn)行了系統(tǒng)研究。行了系統(tǒng)研究。（一）酵母表達(dá)系統(tǒng)的特點(diǎn) 在酵母表達(dá)系統(tǒng)中常用的載體可按復(fù)制形式分為在酵母表達(dá)系統(tǒng)中常用的

53、載體可按復(fù)制形式分為 Yip、 Yrp 、Ycp、 Yep和和YAC幾種。幾種。pPIC9K 為為常用的酵母表達(dá)載體，其組成元件如圖，一常用的酵母表達(dá)載體，其組成元件如圖，一 3 所所示。除示。除AOXI啟動子外常用的還有啟動子外常用的還有 GAL 系列啟系列啟動子；分泌表達(dá)還需要前導(dǎo)肽將產(chǎn)物引導(dǎo)至分泌動子；分泌表達(dá)還需要前導(dǎo)肽將產(chǎn)物引導(dǎo)至分泌途徑酵母天然的前導(dǎo)肽不一定適用于所有外源途徑酵母天然的前導(dǎo)肽不一定適用于所有外源蛋白，來源于釀酒酵母的蛋白，來源于釀酒酵母的-MF 前導(dǎo)肽為常用的前導(dǎo)肽為常用的前導(dǎo)肽。檢測或分離重組蛋白可以選擇前導(dǎo)肽。檢測或分離重組蛋白可以選擇 His、c-myc等與大

54、腸桿菌的質(zhì)粒載體相似的標(biāo)記序列。等與大腸桿菌的質(zhì)粒載體相似的標(biāo)記序列。 研究發(fā)現(xiàn)在研究發(fā)現(xiàn)在E coli中以包含體方式表達(dá)的蛋中以包含體方式表達(dá)的蛋白在酵母中大都能可溶表達(dá)，征大腸桿菌中經(jīng)白在酵母中大都能可溶表達(dá)，征大腸桿菌中經(jīng)常發(fā)生的蛋白降解現(xiàn)象，在酵母中也有所改善。常發(fā)生的蛋白降解現(xiàn)象，在酵母中也有所改善。酵母表達(dá)系統(tǒng)的產(chǎn)量比原核表達(dá)系統(tǒng)要高在酵母表達(dá)系統(tǒng)的產(chǎn)量比原核表達(dá)系統(tǒng)要高在適當(dāng)?shù)那皩?dǎo)肽引導(dǎo)下可以分泌到培養(yǎng)基中，其適當(dāng)?shù)那皩?dǎo)肽引導(dǎo)下可以分泌到培養(yǎng)基中，其培養(yǎng)基中的污染物種類很少有助于簡化純化培養(yǎng)基中的污染物種類很少有助于簡化純化過程。過程。 wood等于等于1985年就在釀酒酵母中成

55、功地表年就在釀酒酵母中成功地表達(dá)了能正確折疊、并且有生物功能的完整抗體達(dá)了能正確折疊、并且有生物功能的完整抗體分子分子 。到目前為止，完整的抗體、抗體片段。到目前為止，完整的抗體、抗體片段如如Fab、ScFv等抗體分子均已在酵母中得到表等抗體分子均已在酵母中得到表達(dá)。分泌的重組抗體片段在酵母中也可以高水達(dá)。分泌的重組抗體片段在酵母中也可以高水平表達(dá)。平表達(dá)。(二)酵母表達(dá)抗體片段的局限 酵母可以完成和高等真核生物極其類似的酵母可以完成和高等真核生物極其類似的O-糖糖基化及基化及N-糖基化，但酵母的糖基化，但酵母的O和和N-糖基的主要成糖基的主要成分為甘露糖。分為甘露糖。N-糖基化時添加的糖鏈長

56、度會影響糖基化時添加的糖鏈長度會影響所表達(dá)蛋白的性質(zhì)。在酵母中的糖鏈所表達(dá)蛋白的性質(zhì)。在酵母中的糖鏈(50個糖基個糖基)比哺乳動物的糖鏈比哺乳動物的糖鏈(20個糖基個糖基)長許多，稱為過度長許多，稱為過度糖基化。這種過度糖基化產(chǎn)生的長鏈可能會影響糖基化。這種過度糖基化產(chǎn)生的長鏈可能會影響蛋白的折疊，影響抗體的活性，具有免疫原性。蛋白的折疊，影響抗體的活性，具有免疫原性。有人報道酵母表達(dá)的有人報道酵母表達(dá)的IgG抗體雖可以介導(dǎo)抗體雖可以介導(dǎo)ADCC，但卻不能激活補(bǔ)體系統(tǒng)。但卻不能激活補(bǔ)體系統(tǒng)。 這類抗體分子還因?yàn)榭赡芫哂忻庖咴约霸谘@類抗體分子還因?yàn)榭赡芫哂忻庖咴约霸谘褐幸妆幌贿m用于

57、臨床治療?？贵w分子液中易被消除而不適用于臨床治療?？贵w分子在酵母表達(dá)時會否發(fā)生過度糖基化以及這種過在酵母表達(dá)時會否發(fā)生過度糖基化以及這種過度糖基化是否合影響抗體的活性還很難確定。度糖基化是否合影響抗體的活性還很難確定。酵母表達(dá)系統(tǒng)的不足之處還在于它的分泌表達(dá)酵母表達(dá)系統(tǒng)的不足之處還在于它的分泌表達(dá)模式與高等真核生物的差別會造成某些蛋白不模式與高等真核生物的差別會造成某些蛋白不能正常分泌而滯留在分泌途經(jīng)中。這可能是因能正常分泌而滯留在分泌途經(jīng)中。這可能是因?yàn)榻湍笇η皩?dǎo)肽的識別能力以及細(xì)胞器的功能為酵母對前導(dǎo)肽的識別能力以及細(xì)胞器的功能與高等真核生物不同，改用酵母天然的前導(dǎo)肽與高等真核生物不同，改

58、用酵母天然的前導(dǎo)肽可以改善某種蛋白的分泌狀況，但不具有普遍可以改善某種蛋白的分泌狀況，但不具有普遍意義。意義。第四節(jié) 動植物表達(dá)系統(tǒng) 一 動物表達(dá)系統(tǒng) 二 植物表達(dá)系統(tǒng)一、哺乳動物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)一、哺乳動物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng) 特點(diǎn)：特點(diǎn)： 能進(jìn)行復(fù)雜的蛋白翻譯后加工修飾能進(jìn)行復(fù)雜的蛋白翻譯后加工修飾1、影響外源基因在哺乳動物表達(dá)、影響外源基因在哺乳動物表達(dá)的序列因素的序列因素 啟動子：啟動子： 起始位點(diǎn)上游起始位點(diǎn)上游20bp20bp處的處的TATATATA盒盒RNARNA聚合酶聚合酶開始裝配和轉(zhuǎn)錄的地方開始裝配和轉(zhuǎn)錄的地方 CAATCAAT盒盒 GCGC盒盒 調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄的起始。調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄的起始。 增強(qiáng)子

59、：增強(qiáng)子： 增強(qiáng)子序列是決定基因表達(dá)強(qiáng)度基因表達(dá)增強(qiáng)子序列是決定基因表達(dá)強(qiáng)度基因表達(dá)空間與時序的重要元件?？臻g與時序的重要元件。 SV40SV40增強(qiáng)子增強(qiáng)子 人巨細(xì)胞病毒（人巨細(xì)胞病毒（CMVCMV）增強(qiáng)子）增強(qiáng)子 逆轉(zhuǎn)錄病毒逆轉(zhuǎn)錄病毒LTRLTR增強(qiáng)子增強(qiáng)子 RNARNA剪接位點(diǎn)和內(nèi)含子：剪接位點(diǎn)和內(nèi)含子： 內(nèi)含子一般含有決定基因表達(dá)強(qiáng)度和時空內(nèi)含子一般含有決定基因表達(dá)強(qiáng)度和時空專一性的構(gòu)件，一些啟動子可和內(nèi)含子相專一性的構(gòu)件，一些啟動子可和內(nèi)含子相互作用提高表達(dá)水平?；プ饔锰岣弑磉_(dá)水平。 5 5非翻譯區(qū)序列（非翻譯區(qū)序列（5 5UTRUTR）：）： 5 5UTRUTR的長度至少大于的長度

60、至少大于20bp20bp 起始起始AUGAUG及其周圍序列：及其周圍序列： 3 3非翻譯區(qū)（非翻譯區(qū)（3 3UTRUTR）：）： 已發(fā)展和使用的病毒載體有：已發(fā)展和使用的病毒載體有： SV40SV40病毒載體，腺病毒載體，多瘤病毒載病毒載體，腺病毒載體，多瘤病毒載體，牛痘痘苗賓服度載體，單純泡疹病毒體，牛痘痘苗賓服度載體，單純泡疹病毒載體，逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，腺病毒相關(guān)病毒載體，逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，腺病毒相關(guān)病毒載體，載體，EBEB病毒載體，牛乳頭瘤病毒載體等。病毒載體，牛乳頭瘤病毒載體等。2、哺乳動物細(xì)胞的表達(dá)載體、哺乳動物細(xì)胞的表達(dá)載體3、篩選標(biāo)記基因、篩選標(biāo)記基因 是細(xì)胞產(chǎn)生特定的藥物抗性或產(chǎn)生