細(xì)菌生長(zhǎng)曲線之測(cè)定

1、實(shí)驗(yàn)六 細(xì)菌生長(zhǎng)曲線之測(cè)定 Exp 11. Turbidity of bacteria一、目的：在進(jìn)行細(xì)菌生長(zhǎng)曲線之測(cè)定前，必須先了解 U-2001 Spectropho-tometer 操作方法，才能將細(xì)菌的數(shù)量以吸光值的方式表示出來。二、原理：請(qǐng)?jiān)斪x整理 p. 90-92，學(xué)會(huì)調(diào)整 Optical density (O.D.) 【Exp 13.會(huì)用到】。三、器材：1. culture：(每組)24 hr Escherichia coli (broth)2. medium： (每組)Nutrient broth3. equipment ：1 ml pipette，pipette aid，cu

2、vette，拭鏡紙，廢菌液杯，裝蒸餾水的洗瓶，滅菌空試管，U-2001 Spectrophotometer，振盪器。四、實(shí)驗(yàn)步驟 由助教先示範(fàn)操作方法，再由學(xué)生自行操作與測(cè)量待測(cè)液之吸光值。1. 了解 U-2001 Spectrophotometer 操作方法：a. 溫機(jī)約 15 分鐘。b. MENU (主目錄) 選 1. Photometer 輸入波長(zhǎng) 600 nm 及 ABS Forward c. Nutrient broth 歸零 autozero (前、後二支 cuvette) 1d. 取出後面之 cuvette ，倒入待測(cè)液2，等到右上方數(shù)據(jù)穩(wěn)定後，按下 Start 記錄。1 cuv

3、ette 有石英管 (測(cè)波長(zhǎng) 340 nm 以下)、玻璃管、塑膠管等材質(zhì)，本實(shí)驗(yàn)使用塑膠材質(zhì)之比色管。2 每次測(cè)定前需先用蒸餾水滴洗 cuvette，再以待測(cè)液潤(rùn)濕，倒掉，再裝入待測(cè)液，測(cè)完倒掉，用蒸餾水滴洗。測(cè)定之前 cuvette 須用拭鏡紙擦乾，手握管的非透明處；廢菌液請(qǐng)滴洗入廢菌液杯中，集中處理) 。2. 每組取一管助教所準(zhǔn)備之E. coli 當(dāng)待測(cè)液，實(shí)際演練 U-2001 Spectrophotometer 操作，測(cè)出其原液 O.D. 【Exp 13. 將會(huì)利用到此操作，故須熟悉其操作步驟】 。 Exp 12. Serial Dilution-Agar Plate Procedur

4、e to Quantitate Viable Cells一、目的：1. 學(xué)習(xí)連續(xù)稀釋法。2. 觀察活菌數(shù)。二、原理：微生物數(shù)目之計(jì)數(shù)法有：1.直接顯微鏡計(jì)數(shù) (Direct Microscopic Counts)：以 Petroff Hauser chamber 計(jì)數(shù)。僅計(jì)數(shù)微量菌液，再由數(shù)學(xué)方法求取總菌數(shù)，此法迅速方便但活與死菌皆涵蓋之且總菌數(shù)若低於一百萬(wàn)時(shí)，準(zhǔn)確度差。2.電子細(xì)胞計(jì)數(shù)器 (Electronic Cell Counters)：如 Coulter Counter，此法不能區(qū)分活或死菌，也無法區(qū)別惰性顆粒物質(zhì)與細(xì)胞物質(zhì)。3.化學(xué)方法 (Chemical Methods)：以間接測(cè)

5、定蛋白質(zhì)濃度、DNA 產(chǎn)量、細(xì)胞質(zhì)量及代謝物等反推菌數(shù)。4.分光光度計(jì)分析 (Spectrophotometric Analysis)：利用穿透菌液之光線量，隨菌量增加而減少。此法迅速但菌數(shù)若低於一千萬(wàn)時(shí)，敏感度差。5.連續(xù)稀釋-洋菜平板法 (Serial Dilution-Agar Plate)：此法乃計(jì)數(shù)活菌。利用無菌水對(duì)菌液做一連串稀釋，採(cǎi) Pour Plate 法進(jìn)行之，經(jīng)隔夜培養(yǎng)後計(jì)數(shù) (或者使用Quebec，參考課本 Figure 21.4, p. 89)。 本實(shí)驗(yàn)課中繪製細(xì)菌生長(zhǎng)曲線之方法便是利用連續(xù)稀釋-洋菜平板法，故Exp 12 與細(xì)菌生長(zhǎng)曲線之測(cè)定一併進(jìn)行。 Exp 13.

6、 The Bacterial Growth Curve一、目的：了解細(xì)菌的族群生長(zhǎng)變動(dòng)，繪製生長(zhǎng)曲線 (growth curve)，並求出增代時(shí)間 (generation time)。二、原理：a. 細(xì)胞的生長(zhǎng)：將細(xì)菌接種在液態(tài)培養(yǎng)基中，置於其最適環(huán)境下 (最適溫度、pH 及氣體組成) 培養(yǎng)，則可求出一細(xì)菌生長(zhǎng)曲線。細(xì)菌之生長(zhǎng)曲線可分成以下數(shù)個(gè)時(shí)期：1. 遲滯期 (lag phase)：細(xì)胞正在適應(yīng)新環(huán)境，數(shù)目無明顯增加。2. 對(duì)數(shù)期 (log phase)：細(xì)胞生長(zhǎng)快速，數(shù)目呈幾何級(jí)數(shù)增加。3. 靜止期 (stationary phase)：因養(yǎng)分耗盡、代謝廢物的堆積，細(xì)胞分裂與死亡速度相當(dāng)

7、，故其數(shù)目不增加。4. 死滅期 (death phase)：細(xì)胞快速死亡，數(shù)目呈幾何級(jí)數(shù)下降。b. 生長(zhǎng)曲線之測(cè)量：可用 pour plate 法，直接求得活細(xì)胞數(shù)目，或是用分光光度計(jì)讀值法，間接推測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)量。之後在半對(duì)數(shù)方格紙上作圖。c. generation time 的計(jì)算：1. 較粗略的計(jì)算 (分光光度計(jì)結(jié)果)：GT t (O.D. 2n) t (O.D. n)GT：generation time2. 直接細(xì)胞數(shù)目的計(jì)算 (pour-plate 之結(jié)果)：t log 2log b log BGT B：在 log phase 上一點(diǎn)的細(xì)胞數(shù)目。b：在 log phase 上另一點(diǎn)的細(xì)胞

8、數(shù)目。t：B 點(diǎn)與 b 點(diǎn)的間隔時(shí)間。三、器材：1. culture：(每組)12 hr Escherichia coli2. medium：100 ml BHI 1 瓶 (棉花頭三角瓶)99 ml 無菌水 18 瓶 (稀釋牛奶瓶)400 ml NA 1瓶 (放於 50 Water Bath 中)3. Equipment ：(每組)37 shaker incubatorU-2001 spectrophotometerpetri dishes 24 個(gè)micropipettes1 ml 與 200µl micropipette tips (滅菌盒中)滅菌空試管 6 支cuvette 1

9、 支安全吸球10 ml sterilized pipettes 6 支計(jì)時(shí)器(自備)、廢菌液杯、拭鏡紙、裝蒸餾水的洗瓶、振盪培養(yǎng)箱。四、實(shí)驗(yàn)步驟1. 標(biāo)示工作：(班別、實(shí)驗(yàn)組別、日期)a. 無菌水：t0，t30，t60，t90，t120，t150 (每個(gè) t 有 3 個(gè)稀釋度即 10-2，10-4，10-6 故共有 6×3 = 18 瓶)b. petri dishes：每個(gè) t 標(biāo)示有 10-4，10-5，10-6，10-7 故共有 24 個(gè)。2. 流程：(參照 Fig. 21.1)1a. 取 5 ml 的 log phase E. coli culture 到 100 ml BHI

10、 broth，測(cè) 600 nm 下之 O.D. 值，記錄之並登錄於黑板。(為t0)1b. 取 1a. 0.1 ml 到 9.9 ml 無菌水稀釋瓶中 t0，10-2。1c. 取 1b. 0.1 ml 到 9.9 ml 無菌水稀釋瓶中 t0，10-4。1d. 取 1c. 0.1 ml 到 9.9 ml 無菌水稀釋瓶中 t0，10-6。 1b. 1d. mixing sample 的方法請(qǐng)參考課本 Figure 21.3, p. 89。 使用安全吸球請(qǐng)小心，玻璃 pipettes 及pipette tips 用完後請(qǐng)分別丟入回收桶中，待下課後一併滅菌清洗或丟棄。2a. 取 1c. 1 ml 做 p

11、our plate 1 t0，10-4。0.1 ml 做 pour plate t0，10-5。2b. 取 1d. 1 ml 做 pour plate t0，10-6。0.1 ml 做 pour plate t0，10-7。 完成 2a.的 plate 待凝固倒置培養(yǎng) 37，24hr 後記錄菌數(shù)並登錄於黑板2。3. 當(dāng) 1a. 已做完 1b. 放入 shaker 120 rpm 37，30 分鐘 (為t30)3。4. 測(cè) O.D.。(記錄之並登錄於黑板) 45. 重覆 1b.2b. 6. 重覆 3.(為t60)7. 其它 t90，t120，t150 依此類推。 100 ml BHI 三角瓶，每

12、一次完成 30 分鐘的培養(yǎng)後，於測(cè) O.D. 前，可先取出 5 ml 於滅菌空管中，三角瓶馬上再放入 shaker incubator 中培養(yǎng)，以節(jié)省時(shí)間，之後再分別進(jìn)行測(cè) O.D. 及稀釋工作。廢液丟在稀釋過不用的牛奶瓶中。1 倒 plate 時(shí)，培養(yǎng)基量約 2/3 圓面積，倒完馬上蓋蓋子並前後左右各輕搖 3 次，使 培養(yǎng)基充滿於 petri dish 底部，但需小心勿將培養(yǎng)基 搖出碰 到蓋壁。2 菌數(shù)若為 TNTC 或 TFTC 也請(qǐng)算出約略菌數(shù)。 (一個(gè) plate 可接受菌落菌數(shù)在 30 - 300 個(gè)之間)3 100 ml BHI 三角瓶的 culture，需於放入 shaker i

13、ncubator 後才能開始計(jì)時(shí)。4 O.D.若 0.6 請(qǐng)稀釋再測(cè)，稀釋倍數(shù)需記錄。 (O.D. 值在 0.10.6 之間較可信，為在線性範(fàn)圍內(nèi)) 5 cuvette 回收。 實(shí)驗(yàn)後的觀察注意事項(xiàng)：1. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果之紀(jì)錄法：TNTC (too numerous to count)：每個(gè) plate 菌落數(shù)大於 300 個(gè)，請(qǐng)畫區(qū)域約略算出菌數(shù)，登記如下：TNTC (1256)。TFTC (too few to count)：每個(gè) plate 菌落數(shù)小於 30 個(gè)，請(qǐng)算出菌數(shù)，登記如下：TFTC (12)。每個(gè)培養(yǎng)時(shí)間點(diǎn)須至少有一個(gè) plate 菌落數(shù)在 30-300 內(nèi)，如 t30 的 10-6 稀釋度有 40 個(gè)菌落則登記為 40×106，若有二個(gè) plate 菌落數(shù)在 30300 內(nèi)則須明列出，並於括號(hào)內(nèi)記錄平均值。2