基因工程的常規(guī)技術(shù)課件

1、基因工程的常規(guī)技術(shù)第三節(jié)第三節(jié) 基因工程的常規(guī)技術(shù)基因工程的常規(guī)技術(shù) 雜交技術(shù)雜交技術(shù) PCR技術(shù)技術(shù)n 凝膠電泳技術(shù)凝膠電泳技術(shù) 基因文庫構(gòu)建基因文庫構(gòu)建基因工程的常規(guī)技術(shù)一一 凝膠電泳技術(shù)凝膠電泳技術(shù)凝膠電泳：凝膠電泳：用用瓊脂糖凝膠瓊脂糖凝膠或或聚丙烯酰胺凝膠聚丙烯酰胺凝膠等作為等作為介質(zhì)的區(qū)帶電泳法稱為凝膠電泳技術(shù)。介質(zhì)的區(qū)帶電泳法稱為凝膠電泳技術(shù)。凝膠電泳的原理：凝膠電泳的原理： 分離原理分離原理- -在電場的作用下，在電場的作用下，DNADNA分子在瓊脂糖凝膠中移分子在瓊脂糖凝膠中移動時，有電荷效應(yīng)和分子篩效應(yīng)。動時，有電荷效應(yīng)和分子篩效應(yīng)。 檢測原理檢測原理- -溴化乙錠（溴化乙

2、錠（EBEB）在紫外光照射下能發(fā)射熒光，）在紫外光照射下能發(fā)射熒光，當(dāng)用當(dāng)用EBEB對對DNADNA樣品染色時，加入的樣品染色時，加入的EBEB就插入就插入DNADNA分子中，熒光分子中，熒光強(qiáng)度與強(qiáng)度與DNADNA含量成正比。含量成正比。基因工程的常規(guī)技術(shù)影響瓊脂糖凝膠電泳的因素：影響瓊脂糖凝膠電泳的因素：nDNA片段的大小片段的大小n凝膠的類型凝膠的類型n凝膠的濃度凝膠的濃度n電泳緩沖液電泳緩沖液n電壓電壓基因工程的常規(guī)技術(shù)瓊脂糖凝膠電泳裝置：瓊脂糖凝膠電泳裝置： 基因工程的常規(guī)技術(shù)瓊脂糖凝膠電泳裝置：瓊脂糖凝膠電泳裝置：基因工程的常規(guī)技術(shù)凝膠成像分析系統(tǒng)：凝膠成像分析系統(tǒng)： 基因工程的常

3、規(guī)技術(shù)DNA電泳圖譜電泳圖譜 RNA電泳圖譜電泳圖譜 基因工程的常規(guī)技術(shù)n重組子：重組子： 2.7 kb + 4.0 kbn非重組子：非重組子： 2.7 kbpUC18 2.7kbHindIII SphI PstI SalI BamHI SmaI KpnI EcoRIAprlacZori4.0 kb2.7 kb5.4 kbL1 L24.0 kbPH基因工程的常規(guī)技術(shù)聚丙烯酰胺凝膠電泳裝置及其原理示意圖聚丙烯酰胺凝膠電泳裝置及其原理示意圖 基因工程的常規(guī)技術(shù)SDS-PAGE電泳圖譜電泳圖譜 基因工程的常規(guī)技術(shù)n1975，Edwen Southern提出分子印跡概念。n概念：將存在于凝膠中的生物大

4、分子轉(zhuǎn)移（印跡）于固定化介質(zhì)上并加以檢測分析的技術(shù)。目前主要應(yīng)用于DNA，RNA，蛋白質(zhì)的檢測。二二 雜交技術(shù)雜交技術(shù)基因工程的常規(guī)技術(shù)基因工程的常規(guī)技術(shù)核酸分子雜交的基本原理：核酸分子雜交的基本原理：n具有互補(bǔ)序列兩條單鏈核酸分子在一定條件下具有互補(bǔ)序列兩條單鏈核酸分子在一定條件下按堿基互補(bǔ)配對原則退火形成雙鏈的過程。按堿基互補(bǔ)配對原則退火形成雙鏈的過程。 n雜交的雙方是待測核酸和已知核酸序列，已知雜交的雙方是待測核酸和已知核酸序列，已知核酸序列稱探針。核酸序列稱探針?；蚬こ痰某Ｒ?guī)技術(shù) DNA-DNA雜交雙鏈分子雜交雙鏈分子基因工程的常規(guī)技術(shù)DNA印跡技術(shù)印跡技術(shù)nSouthern blo

5、tting 基因組基因組DNA經(jīng)限制性內(nèi)切酶消化后，進(jìn)行瓊脂糖經(jīng)限制性內(nèi)切酶消化后，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，將含有凝膠電泳，將含有DNA片斷的凝膠放入變性溶液變性片斷的凝膠放入變性溶液變性后，將硝酸纖維膜后，將硝酸纖維膜(NC)膜放在膠上，上面放吸水紙巾，膜放在膠上，上面放吸水紙巾，利用毛吸作用使膠利用毛吸作用使膠DNA轉(zhuǎn)移質(zhì)轉(zhuǎn)移質(zhì)NC膜上，然后利用雜膜上，然后利用雜交技術(shù)檢測交技術(shù)檢測NC膜上的膜上的DNA片斷。片斷?；蚬こ痰某Ｒ?guī)技術(shù)Southern Blotting: Gel Transfer基因工程的常規(guī)技術(shù)基因工程的常規(guī)技術(shù)Southern blot基因工程的常規(guī)技術(shù)RNA印跡技術(shù)印跡技

6、術(shù)nNorthern blotting 與與Southern blotting相似，但不需要限制性相似，但不需要限制性內(nèi)切酶切割。用于基因表達(dá)的特異性分析和定量內(nèi)切酶切割。用于基因表達(dá)的特異性分析和定量分析。分析。 基因工程的常規(guī)技術(shù)酵母轉(zhuǎn)化子酵母轉(zhuǎn)化子Northern雜交結(jié)果雜交結(jié)果基因工程的常規(guī)技術(shù)蛋白質(zhì)免疫印跡法蛋白質(zhì)免疫印跡法nWestern blotting: 免疫印跡法是檢測蛋白質(zhì)混合溶液中某種特定目的蛋免疫印跡法是檢測蛋白質(zhì)混合溶液中某種特定目的蛋白質(zhì)的定性方法，也可以作為確定同一蛋白質(zhì)在不同細(xì)胞白質(zhì)的定性方法，也可以作為確定同一蛋白質(zhì)在不同細(xì)胞或者同一種細(xì)胞不同條件下的相對含量

7、的半定量方法。由或者同一種細(xì)胞不同條件下的相對含量的半定量方法。由于其檢測往往需要抗體，所以也被稱為免疫印跡技術(shù)。于其檢測往往需要抗體，所以也被稱為免疫印跡技術(shù)。n應(yīng)用應(yīng)用 1 檢測樣品中特異蛋白存在與否檢測樣品中特異蛋白存在與否 2 細(xì)胞中特異蛋白的半定量分析細(xì)胞中特異蛋白的半定量分析 3 蛋白質(zhì)分子相互作用的研究蛋白質(zhì)分子相互作用的研究基因工程的常規(guī)技術(shù)原理：蛋白質(zhì)組分經(jīng)原理：蛋白質(zhì)組分經(jīng)SDS-PAGE分離后，平行轉(zhuǎn)分離后，平行轉(zhuǎn)移到固相支持體（移到固相支持體（NC膜或膜或PVDF膜）上，通過免疫膜）上，通過免疫試劑來檢測靶蛋白。試劑來檢測靶蛋白。靶蛋白的檢測通常采用兩步法或間接法，用一

8、抗結(jié)靶蛋白的檢測通常采用兩步法或間接法，用一抗結(jié)合靶蛋白，再用過氧化物酶（合靶蛋白，再用過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的二抗）標(biāo)記的二抗結(jié)合一抗，然后結(jié)合一抗，然后HRP催化化學(xué)顯色反應(yīng)或化學(xué)發(fā)催化化學(xué)顯色反應(yīng)或化學(xué)發(fā)光反應(yīng)。光反應(yīng)。基因工程的常規(guī)技術(shù)基因工程的常規(guī)技術(shù)三三 PCR技術(shù)技術(shù)基因工程的常規(guī)技術(shù)PCRPCR技術(shù)的創(chuàng)建技術(shù)的創(chuàng)建Kary B. Mullis（穆利斯（美）Khorana(1971)Khorana(1971)等提出在體外經(jīng)等提出在體外經(jīng)DNADNA變性變性, ,與適當(dāng)引物雜交與適當(dāng)引物雜交, ,再再用用DNADNA聚合酶延伸聚合酶延伸, ,克隆克隆DNADNA的設(shè)想。的設(shè)想。1

9、9831983年年,Mullis,Mullis發(fā)明了發(fā)明了PCRPCR技術(shù)技術(shù), ,使使KhoranaKhorana的設(shè)想得到實(shí)現(xiàn)。的設(shè)想得到實(shí)現(xiàn)。19881988年年SaikiSaiki等將耐熱等將耐熱DNADNA聚合酶（聚合酶（TaqTaq）引入了）引入了PCRPCR技術(shù)技術(shù) 19891989年美國年美國ScienceScience雜志列雜志列PCR PCR 為十余項(xiàng)重大科學(xué)發(fā)明之為十余項(xiàng)重大科學(xué)發(fā)明之首首, ,比喻比喻19891989年為年為PCRPCR爆炸年爆炸年,Mullis,Mullis榮獲榮獲19931993年度諾貝爾化學(xué)年度諾貝爾化學(xué)獎。獎。基因工程的常規(guī)技術(shù)http:/基因工

10、程的常規(guī)技術(shù)基因工程的常規(guī)技術(shù)無細(xì)胞分子克隆法：在微量離心管中無細(xì)胞分子克隆法：在微量離心管中, ,加入適量的緩沖液加入適量的緩沖液, , 微量的模板微量的模板DNA,DNA,四種脫氧單核苷酸四種脫氧單核苷酸, ,耐熱性多聚酶耐熱性多聚酶, , 一對一對合成合成DNADNA的引物的引物, ,通過通過高溫變性高溫變性、低溫退火低溫退火和和中溫延伸中溫延伸三三個階段為一個循環(huán)個階段為一個循環(huán), ,每一次循環(huán)使特異區(qū)段的基因拷貝數(shù)每一次循環(huán)使特異區(qū)段的基因拷貝數(shù)放大一倍放大一倍, ,一般樣品是經(jīng)過一般樣品是經(jīng)過3030次循環(huán)次循環(huán), ,最終使基因放大了最終使基因放大了數(shù)百萬倍數(shù)百萬倍; ; 擴(kuò)增了特

11、異區(qū)段的擴(kuò)增了特異區(qū)段的DNADNA帶。帶。基因工程的常規(guī)技術(shù)基因工程的常規(guī)技術(shù)Polymerase Chain Reaction (PCR)基因工程的常規(guī)技術(shù)引物設(shè)計(jì)：引物設(shè)計(jì)：（1)1)序列應(yīng)位于高度保守區(qū)序列應(yīng)位于高度保守區(qū), ,與非擴(kuò)增區(qū)無同源序列。與非擴(kuò)增區(qū)無同源序列。（2 2）引物長度以）引物長度以15-30 bp15-30 bp為宜（為宜（17 1.517 1.510101010bpbp）。）。（3 3）堿基盡可能隨機(jī)分布）堿基盡可能隨機(jī)分布,G+C,G+C占占50-60%50-60%。（4 4）引物內(nèi)部避免形成二級結(jié)構(gòu)。）引物內(nèi)部避免形成二級結(jié)構(gòu)。（5 5）兩引物間避免有互補(bǔ)序

12、列。）兩引物間避免有互補(bǔ)序列。（6 6）引物）引物33端為關(guān)鍵堿基；端為關(guān)鍵堿基；55端無嚴(yán)格限制。端無嚴(yán)格限制。基因工程的常規(guī)技術(shù) 總體積總體積 50-100 l Buffer 緩沖液緩沖液 dNTP 原料原料 Primer 引物（引物（0.1-0.5 mol/L） DNA分子分子 模板模板 （50-100ng ） Taq酶酶 DNA聚合酶（聚合酶（0.5-2.5 U/50 L ）反應(yīng)體系：反應(yīng)體系：基因工程的常規(guī)技術(shù)經(jīng)典循環(huán)參數(shù)：經(jīng)典循環(huán)參數(shù)：94 30s 55 45s72 1min 94 5min30次次72 7min 4基因工程的常規(guī)技術(shù)基因工程的常規(guī)技術(shù)四四 基因文庫構(gòu)建基因文庫構(gòu)建

13、n基因文庫的基本概念基因文庫的基本概念n基因文庫的構(gòu)建程序基因文庫的構(gòu)建程序n基因組文庫重組克隆的排序基因組文庫重組克隆的排序基因工程的常規(guī)技術(shù)基因文庫（基因文庫（gene librarygene library）從特定生物個體中分離的全部基因，這些基因以克隆從特定生物個體中分離的全部基因，這些基因以克隆的形式存在（人工構(gòu)建）。根據(jù)構(gòu)建方法的不同，基的形式存在（人工構(gòu)建）。根據(jù)構(gòu)建方法的不同，基因文庫分為：因文庫分為： 基因組文庫（含有全部基因）基因組文庫（含有全部基因）cDNA文庫（含有全部蛋白質(zhì)編碼的結(jié)構(gòu)基因）文庫（含有全部蛋白質(zhì)編碼的結(jié)構(gòu)基因）基因工程的常規(guī)技術(shù)基因文庫構(gòu)建的基本戰(zhàn)略基因

14、文庫構(gòu)建的基本戰(zhàn)略用用cDNA法構(gòu)建法構(gòu)建cDNA文庫，文庫，材料來自材料來自mRNA 在高度分化的生物體中，不同組織和細(xì)胞在不同時在高度分化的生物體中，不同組織和細(xì)胞在不同時段的段的mRNAmRNA種類不同（即基因的表達(dá)譜不同），因此同種種類不同（即基因的表達(dá)譜不同），因此同種生物體的生物體的cDNAcDNA文庫一般還有組織細(xì)胞的界定，如肝組織文庫一般還有組織細(xì)胞的界定，如肝組織cDNAcDNA文庫或胚胎組織文庫或胚胎組織cDNAcDNA文庫等。文庫等。用鳥槍法構(gòu)建基因組文庫，用鳥槍法構(gòu)建基因組文庫，材料來自染色體材料來自染色體DNA基因工程的常規(guī)技術(shù)基因文庫的構(gòu)建程序基因文庫的構(gòu)建程序基因

15、組基因組DNA的制備的制備 為了最大限度地保證基因在克隆過程中的完整性，為了最大限度地保證基因在克隆過程中的完整性， 用用于基因組文庫構(gòu)建的于基因組文庫構(gòu)建的DNADNA在分離純化操作中應(yīng)盡量避免過度在分離純化操作中應(yīng)盡量避免過度的斷裂。制備的的斷裂。制備的DNADNA分子量越大，經(jīng)切割處理后樣品中含有分子量越大，經(jīng)切割處理后樣品中含有不規(guī)則末端的不規(guī)則末端的DNADNA片段的比率就越低，重組率和完備性也就片段的比率就越低，重組率和完備性也就越高。越高。基因工程的常規(guī)技術(shù)基因組基因組DNA的切割的切割 用于基因組文庫構(gòu)建的用于基因組文庫構(gòu)建的DNADNA片段的切割一般采片段的切割一般采用超聲波

16、處理和限制性內(nèi)切酶部分酶切兩種方法，用超聲波處理和限制性內(nèi)切酶部分酶切兩種方法，其目的是：其目的是：第一，保證第一，保證DNA片段之間存在部分重疊區(qū)片段之間存在部分重疊區(qū) 第二，保證第二，保證DNA片段大小均一片段大小均一基因工程的常規(guī)技術(shù)載體和受體的選擇載體和受體的選擇 出于壓縮重組克隆的數(shù)量，用于基因組文庫出于壓縮重組克隆的數(shù)量，用于基因組文庫構(gòu)建的載體通常選裝載量較大的構(gòu)建的載體通常選裝載量較大的-DNA-DNA或考斯質(zhì)或考斯質(zhì)粒；對于大型基因組（如動植物和人類）需使用粒；對于大型基因組（如動植物和人類）需使用YACYAC或或BACBAC載體。載體。 由于絕大多數(shù)真核生物的由于絕大多數(shù)真核生物的mRNAmRNA小于小于10 kb10 kb，因，因此用于此用于cDNAcDNA文庫構(gòu)建的載體通常選質(zhì)粒。文庫構(gòu)建的載體通常選質(zhì)粒。 用于基因文庫構(gòu)建的受體則根據(jù)載體使用大腸桿用于基因文庫構(gòu)建的受體則根據(jù)載體使用大腸桿菌或酵母菌。菌或酵母菌。基因工程的常規(guī)技術(shù)從基因文庫中篩選目的基因從基因文庫中篩選目的基因 大型基因組文庫一般由數(shù)十萬甚至上百萬個大型基因組文庫一般由數(shù)十萬甚至上百萬個重組克隆組成。除了一些具有特殊功能的蛋白質(zhì)重組克隆組成。除了一些具有特殊功能的蛋白質(zhì)編碼