畢赤酵母培養(yǎng)基大全Word版

1、畢赤酵母表達(dá)的培養(yǎng)基配制2.1 LB(Luria-Bertani)培養(yǎng)基：Trypton l%Yeast Extract 0.5%NaCl l%PH 7.0制作平板時(shí)加入 2%瓊脂粉。121高壓滅菌 20min?？捎谑覝乇４妗Ｓ糜谂囵B(yǎng)pPICZA原核宿主菌TOP10F時(shí)可加入Zeocin 25ug / ml。2.2 LLB(Low Salt LB)培養(yǎng)基：Trypton l%Yeast Extract 0.5%NaCl 0.5%PH 7.0制作平板時(shí)加入 2%瓊脂粉。121高壓滅菌 20min?？捎谑覝乇４鏀?shù)月。用于培養(yǎng)pPICZA原核宿主菌TOP10F時(shí)，加入Zeocin 25ug / ml

2、，可以4條件下保存12周。2.3 YPD (又稱YEPD)Yeast Extract Peptone Dextrose Medium，(Yeast Extract Peptone Dextrose Medium，酵母浸出粉/胰蛋白胨/右旋葡萄糖培養(yǎng)基)Trypton 2%dextrose (glucose) 2%+agar 2%+Zeocin 100 g/ml液體YPD培養(yǎng)基可常溫保存;瓊脂YPD平板在4可保存幾個(gè)月。加入Zeocin 100ug / ml，成為YPDZ培養(yǎng)基，可以4條件下保存12周。2.4 YPDS + Zeocin 培養(yǎng)基(Yeast Extract Peptone Dex

3、trose Medium)：yeast extract 1%peptone 2%dextrose (glucose) 2%sorbitol (山梨醇)1 M+agar 2%+ Zeocin 100 g/ml不管是液體 YPDS培養(yǎng)基，還是YPDS + Zeocin 培養(yǎng)基，都必須存放4條件下，有效期12周。2.5 MGYMinimal Glycerol Medium (最小甘油培養(yǎng)基)(34%YNB;1%甘油;4*10-5%生物素)。將800ml滅菌水、100ml的 10*YNB母液、2ml的500*B母液和100ml的10*GY母液混勻即可，4保存，保存期為2個(gè)月。2.6 MGYHMinim

4、al Glycerol Medium + Histidine (最小甘油培養(yǎng)基 + 0.004%組氨酸)在1000ml的MGY培養(yǎng)基中加入 10ml的100*H母液混勻，4保存，保存期為2個(gè)月。2.7 RDReGENEration Dextrose Medium (葡萄糖再生培養(yǎng)基)(含有：1mol/L的山梨醇;2%葡萄糖;1.34%YNB;4*10-5%生物素;0.005%氨基酸)1. 將186g的山梨醇定容至700ml，高壓滅菌;2. 冷卻后于45水浴;3. 將100ml的10*D、100ml的10*YNB;2ml的500*B;10ml的100*AA等母液和88ml無菌水混勻，預(yù)熱至45后

5、，與步驟2 的山梨醇溶液混合。4保存。2.8 RDHRegeneration Dextrose Medium + Histidine (葡萄糖再生培養(yǎng)基 + 0.004%組氨酸)在RD培養(yǎng)基配制的第三步中，在加入10ml的100*H母液，同時(shí)無菌水的體積減少至78ml即可，其余配制方法與RD相同。4保存。2.9 RD及RDH平板的制備1. 將186g的山梨醇和15-20g瓊脂粉定容至700ml，高壓滅菌;冷卻后于60水浴;2. 參照RD/RDH液體培養(yǎng)基配制的步驟4，將100ml的10*D、100ml的10*YNB;2ml的500*B;10ml的100*AA等母液、(10ml的100*H母液)

6、和88(78)ml無菌水混勻，預(yù)熱至45后，與步驟1的山梨醇/瓊脂液混勻;3. 迅速制備平板。4可保存數(shù)月。2.10 RD及RDH 的TOP 瓊脂的制備(常用于酵母菌的包被)1.將186g的山梨醇和 7.510g瓊脂粉定容至700ml，高壓滅菌;冷卻后于60水浴;2.參照RD/RDH液體培養(yǎng)基配制的步驟4，將100ml的10*D、 100ml的10*YNB;2ml的500*B;10ml的100*AA等母液、(10ml的100*H母液)和88(78)ml無菌水混勻，預(yù)熱至 45后，與步驟1的山梨醇/瓊脂液混勻;3.將該TOP瓊脂置于45水浴冷卻、保溫，備用。2.11 MD與MDHMinimal

7、Dextrose Medium +(Histidine) 最小葡萄糖培養(yǎng)基 +( 0.004 %組氨酸)(含有：1.34%YNB;4*10-5% 生物素;2%葡萄糖)1. 100ml的10*YNB;2ml的500*B和100ml10*D母液，用800ml的無菌水定容至1000ml即可;2. 如配制MDH，可在上述的MD中加入10ml的100*H即可;3. 如配制平板，可無菌水的滅菌前，加入1520g的瓊脂。4可保存數(shù)月。2.12 SOC培養(yǎng)基：Trypton l%Yeast Extract 0.5%NaCl 0.05%Glucose (1mol / L) 2%121高壓滅菌 20min，冷卻后

8、，4保存2.13 MM培養(yǎng)基：M9母液：64g磷酸氫二鈉，15g磷酸二氫鉀，2.5g氯化鈉，5.0g氯化銨加1L水滅菌取M9母液200ml加水700ml,加2ml1mol/l已滅菌的硫酸鎂，加100微升已滅菌的1mol/l氯化鈣(可加可不加)。注意硫酸鎂和M9母液要分開滅菌不然會(huì)有沉淀。在M9培養(yǎng)基基礎(chǔ)上添加0.5%葡萄糖即為MM培養(yǎng)基。2.14 BMGY /BMMY培養(yǎng)基：酵母粉：1.0克，蛋白胨：2.0克，YNB：1.34克，0.1mol/L pH6.0(或者pH7.0)磷酸緩沖液，甘油：1.0毫升，加蒸餾水到100mL2.15 BMM培養(yǎng)基，全稱：Buffered minimal met

9、hanol 即最小緩沖甲醇培養(yǎng)基，常用于表達(dá)分泌型蛋白的培養(yǎng)基。配制：100mM pH6.0磷酸鉀 1.34%YNB 4×10-5%生物素 0.5%甲醇1. 滅菌700ml 水，2. 冷至室溫，加入下列：100ml 1M pH6.0磷酸鉀緩沖液, 100ml 10×YNB, 2ml 500×B, 100ml 10×M3. 放置于4 度，可放2 個(gè)月10×YNB (13.4%酵母氮源堿(YNB)含硫酸銨不含氨基酸)溶解134gYNB于1000ml水中，過濾除菌，加熱至YNB 完全溶解，存于4 度?；蛘哂?4gYNB(不含硫酸銨不含氨基酸)，100

10、g 硫酸銨進(jìn)行配制，可放1年。注意畢赤酵母在高濃度YNB下生長(zhǎng)更好。YPD：最基本的培養(yǎng)用;BMGY：誘導(dǎo)表達(dá)前培養(yǎng)用;BMMY：誘導(dǎo)表達(dá)用;MD：電轉(zhuǎn)化后篩選his+用。YEPD是不能代替BMGY的，因?yàn)橛衅咸烟?，這樣殘留的葡萄糖會(huì)影響下一步的誘導(dǎo)表達(dá)。不過有一種方法是可行的，就是用YPG培養(yǎng)基代替，只是把YEPD中的葡萄糖用3%的甘油代替，也可以降低成本。搖瓶畢竟不能和發(fā)酵罐比，甘油殘余會(huì)抑制甲醇利用。BMGY、BMMY滅菌后才能加甲醇、磷酸鉀、生物素。配制BMMY時(shí)也沒必要用5%過濾除菌的甲醇，在滅菌后使用前加100%甲醇至你要的濃度。YNB可以高壓滅菌，沒問題的，也可以0.22um過濾

11、處理，天冬氨酸和蘇氨酸要待培養(yǎng)基高壓滅菌后加入;配YPD時(shí)可以加入YPD一起滅菌，但時(shí)間不能太長(zhǎng)，溫度不能太高，一般121-125度12-15分鐘足夠了。若時(shí)間過長(zhǎng)，溫度過高，可能導(dǎo)致YPD焦化。glucose和含氮化合物在一起容易產(chǎn)生美拉德反應(yīng)，這是配制培養(yǎng)基中的禁忌。顏色很深的話，基本不能使用了?；蛘吆衅咸烟呛?或YNB的培養(yǎng)基108度35min高壓滅菌。小量發(fā)酵其實(shí)可以把培養(yǎng)基成分中的YNB和生物素去除，培養(yǎng)基價(jià)格便宜，操作又方便，可以直接滅菌，效果也很好(效果不比含YNB的差)。如果是用自己配置的培養(yǎng)基，如玉米浸提液、麥芽浸提液、麥麩浸提液等等，可以不用換液，采取添料來維持酵母對(duì)培養(yǎng)

12、基的營養(yǎng)需要。用無機(jī)鹽進(jìn)行大規(guī)模發(fā)酵，更省錢。大規(guī)模發(fā)酵時(shí)，甲醇的流加速度增加不要太快。另外使用純氧并不昂貴，在武漢買個(gè)鋼瓶600元左右，一瓶純氧20元。一個(gè)批次100h左右估計(jì)3-4瓶氧氣。關(guān)于Tryptone和Peptone的選擇：1)用培養(yǎng)E.coli的Tryptone替代Peptone對(duì)有些酵母菌可以,例如一般的表達(dá)酵母.但是對(duì)有酵母菌些絕對(duì)不行.例如做雙雜交的AH109,Y187之類表達(dá)酵母，根本就長(zhǎng)不好.2)Tryptone和Peptone雖然都是營養(yǎng)胨，但營養(yǎng)成分不一樣.即使是一般的表達(dá)酵母可以在Tryptone生長(zhǎng)，生長(zhǎng)狀態(tài)也沒有在Peptone中好.但tryptone和pep

13、tone就是含量上有點(diǎn)不同外，其他沒什么區(qū)別，用peptone的目的不是為了提供氮源，提供氮源的是培養(yǎng)基里面的YNB。3)如果要求不高，一般使用也還湊合.盡可能的用Peptone，difco公司的，晶美公司代理的，甚至是其它國產(chǎn)的蛋白胨都可以很正常的培養(yǎng)絕大多數(shù)酵母菌.4)用含Peptone的培養(yǎng)基顏色很深，純化表達(dá)蛋白時(shí)顏色要去掉，所以還要進(jìn)行麻煩的后續(xù)處理。而改用Tryptone后，培養(yǎng)基顏色變得很淺，和LB(液體)顏色差不多，后續(xù)處理要簡(jiǎn)單些。invitrogen說明書說 peptone的作用是防止目的蛋白被一些酶類水解，加入peptone的目的就是競(jìng)爭(zhēng)性抑制目的蛋白的水解，因?yàn)閜ept

14、one是一些小的短肽，是一些酶作用的底物。培養(yǎng)畢赤酵母,書上說BIOTIN儲(chǔ)液是水溶液,但事實(shí)上BIOTIN很難溶于水, 可以稍稍水浴加熱一下。配制500×BIOTIN stock solution(0.02%)有這么3種方案：1)、懶人是將Biotin直接溶在去離子水中，放過夜，基本就能溶;2)、急性子是將溶液配成0.02N的NaOH，就很容易溶解了;3)、水浴加熱，溫度不能高于50度。D-生物素是具有生物活性的生物素，也就是vitaminH。在畢赤酵母代謝過程中，作為多種酶的輔基起作用。天然培養(yǎng)基中一般可以不單獨(dú)添加，因?yàn)閅NB中、酵母粉、蛋白胨中均含有一定量的生物素，但是做高密

15、度發(fā)酵還是必須要添加的。MD、MM屬于基礎(chǔ)培養(yǎng)基，沒有哪種成分會(huì)含有微量生長(zhǎng)因子(如生物素)。所以肯定要加的。附：無機(jī)培養(yǎng)基配方BSM無機(jī)培養(yǎng)基：85% H3PO4 26.7ml/LCaSO4 ?2H2O 0.93g/LK2SO4 18.2g/LMgSO4?2H2O 14.9g/LKOH 4.13g/L甘油 40g/LPMT1 4.0ml/L100%氨水調(diào)pH5.0(1瓶50ml加800ul氨水)或10g/L硫酸銨調(diào)pH5.0，氨水用于上罐調(diào)pH(便宜，方便)。誘導(dǎo)表達(dá)前調(diào)pH6.0。pH5.0是為了防止BSM形成磷酸鈣沉淀，pH6.0是表達(dá)HSA融合蛋白的最適pH。BSM高壓滅菌后再加4.0ml/L 過濾除菌的PTM1(微