單克隆抗體技術(shù)的應(yīng)用Word版

1、第三節(jié) 單克隆抗體技術(shù)的應(yīng)用幾十年以來,人們一直嘗試?yán)萌嗣庖呦到y(tǒng)產(chǎn)生人源性單抗來制備特異性強(qiáng)的人源抗體藥物,從而治療腫瘤、感染性疾病及自身免疫性疾病等。根據(jù)用途的不同，單抗大體上可分為三類，即診斷用單抗、治療用單抗、“生物導(dǎo)彈”用單抗。單抗為人類疾病的防治和診斷、腫瘤體內(nèi)定位、靶向藥物的制備、防止移植物的排異反應(yīng)、新型疫苗的研制提供了較為理想的手段。3.1 用于疾病的診斷1、檢測(cè)淋巴細(xì)胞表面分子，用于鑒別淋巴細(xì)胞。它用于區(qū)分細(xì)胞亞群和細(xì)胞的分化階段的淋巴細(xì)胞。例如檢測(cè)CD系列標(biāo)志，有利于了解細(xì)胞的分化和T細(xì)胞亞群的數(shù)量和質(zhì)量變化，這對(duì)多種疾病診斷具有參考意義。細(xì)胞表面抗原的檢測(cè)，將對(duì)白血病患

2、者的疾病分期、治療效果、預(yù)后判斷等方面有指導(dǎo)作用。組織相容性抗原檢測(cè)是移植免疫學(xué)的重要內(nèi)容，應(yīng)用單抗對(duì)其進(jìn)行位點(diǎn)檢測(cè)可得到更可信的結(jié)果。人體內(nèi)的淋巴細(xì)胞分為T細(xì)胞、B細(xì)胞和包括NK細(xì)胞為代表的第三群細(xì)胞，下分若干亞群，各有其特異的表面標(biāo)志和功能，據(jù)此建立許多相應(yīng)的檢測(cè)方法。臨床上各種類型的免疫缺陷癥、自身免疫病以及腫瘤等均可出現(xiàn)不同群淋巴細(xì)胞數(shù)量和功能的變化。因此計(jì)數(shù)外周血和組織內(nèi)淋巴細(xì)胞及其亞群的數(shù)目或比例，以及它們所顯示的功能強(qiáng)弱，可藉此判斷機(jī)體的細(xì)胞免疫水平，對(duì)臨床認(rèn)識(shí)疾病，探討其發(fā)病機(jī)制、觀察病情、判斷預(yù)后、考核療效以及防治疾病等方面可提供極為有用的信息。檢測(cè)人T細(xì)胞的特異性抗原，曾采

3、用抗人腦、抗人胸腺細(xì)胞和抗人T細(xì)胞等抗血清，通過細(xì)胞毒試驗(yàn)或免疫熒光染色加以鑒定。自抗白細(xì)胞分化抗原的單克隆抗體問世以來，上述諸多方法均被新方法取而代之。常用以鑒定和檢測(cè)計(jì)數(shù)T細(xì)胞的表面分化抗原如下表所示。表 T胞表面主要CD抗原及其特異性用單克隆抗體檢測(cè)T細(xì)胞表面抗原的方法有兩大類，一類是用標(biāo)記抗體著染，如免疫熒光法、酶免疫法、生物素親和素（或鏈霉親和素）系統(tǒng)的ABC法以及免疫金銀染色法；另一類是用抗體致敏的紅細(xì)胞作花環(huán)試驗(yàn)。兩類方法各有優(yōu)缺點(diǎn)。以下敘述有代表性的方法。（一）間接免疫熒光法本法是將分離獲得的外周血單個(gè)核細(xì)胞分別與抗相應(yīng)CD的單克隆抗體（如CD2、CD4、CD8）結(jié)合后，洗去游

4、離的抗體，繼加熒光素標(biāo)記的抗小鼠IgG抗血清，經(jīng)溫育結(jié)合后，洗去多余的標(biāo)記抗體，取樣制片，用熒光顯微鏡觀察并計(jì)數(shù)約200個(gè)單個(gè)核細(xì)胞，以熒光陽性細(xì)胞與計(jì)數(shù)細(xì)胞總數(shù)之比，求得相應(yīng)CD抗原陽性的T百分率。如有條件，細(xì)胞經(jīng)熒光標(biāo)記抗體著染后，用流式細(xì)胞儀計(jì)數(shù)，快速而準(zhǔn)確，但需要較多的投資，難以普及應(yīng)用。（二）免疫細(xì)胞化學(xué)法通常用酶免疫檢測(cè)法，如APAAP酶免疫橋聯(lián)法。為減少非特異性著染，可選用生物素鏈霉親和素系統(tǒng)試劑作ABC法染色。該類方法可用普通顯微鏡觀察，凡呈棕黃色的細(xì)胞為相應(yīng)CD抗原陽性細(xì)胞，計(jì)其占總淋巴細(xì)胞的百分率。本法簡(jiǎn)便易行，不需特殊儀器，一般試驗(yàn)室均可采用。（三）抗體致敏細(xì)胞花環(huán)法用相

5、應(yīng)的CD單克隆抗體致敏醛化的紅細(xì)胞作為指示物，它與受檢的細(xì)胞混勻后，置室溫片刻，繼經(jīng)低速離心，移放室溫作短期溫育或4過夜后，重懸取樣涂片染色鏡檢。凡受檢細(xì)胞周圍粘附有3個(gè)或更多紅細(xì)胞的判為花環(huán)形成細(xì)胞如下圖所示，共計(jì)數(shù)100200個(gè)細(xì)胞，以花環(huán)形成數(shù)與計(jì)數(shù)細(xì)胞總數(shù)之比為相應(yīng)CD抗原陽性細(xì)胞的百分率。本法需有相應(yīng)的致敏紅細(xì)胞試劑，受影響的因素較前兩法多。圖 顯微鏡下的花環(huán)2、鑒定病原體，準(zhǔn)確診斷感染性疾病。將病原體的抗原分離,再同骨髓瘤細(xì)胞雜交建立相應(yīng)的雜交瘤細(xì)胞株,分泌單克隆抗體,可以同病原體發(fā)生特異性的抗原- 抗體反應(yīng),通過免疫熒光試驗(yàn)或ELISA 試驗(yàn)對(duì)疾病進(jìn)行診斷。例如轉(zhuǎn)鐵蛋白、腎素、甲

6、狀腺素(T4)、三碘甲狀腺素(T3)、干擾素、補(bǔ)體成分C3、cAMP、cGMP、生長(zhǎng)素、絨毛膜促性腺激素(HCG)、促性腺激素(FSH)、胰島素、IgG、IgE、地高辛、氨茶堿、苯巴比妥、氨基糖甙類抗生素、維生素B12 等單抗均可作為體內(nèi)激素或藥物等微量成分的測(cè)定。如用于診斷乙肝病毒、丙肝病毒、皰疹病毒、巨細(xì)胞病毒、EB病毒和各種微生物、寄生蟲感染的試劑等。單抗所具有的靈敏度高、特異性好的特點(diǎn)，使其在鑒別菌種的型及亞型、病毒變異株，以及寄生蟲不同生活周期的抗原性等方面更具獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。3、腫瘤的診斷和分型。某些單抗具有在腫瘤部位蓄積的特性，可用于腫瘤的診斷。目前已批準(zhǔn)使用的診斷劑有:用于結(jié)腸癌的v

7、otomab 和arcilumonab,用于探測(cè)感染部位的sulemab, 用于卵巢癌的igovomab, 用于黑色素瘤的tecnemab K- 1。例如：劉瑞振等成功地制備了抗人DcR3 McAb，未來對(duì)于肺癌、胃腸道腫瘤、腦惡性膠質(zhì)瘤和胰腺癌的診斷具有很大的幫助。目前，對(duì)腫瘤相關(guān)抗原(如甲胎蛋白、腫瘤堿性蛋白和癌胚抗原)的單抗早就用于臨床檢驗(yàn)。隨著淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)的應(yīng)用，許多抗人腫瘤標(biāo)記物的雜交瘤細(xì)胞株已經(jīng)建立，這為腫瘤的早期診斷及其闡明腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，了解腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)活性及其定量研究奠定了基礎(chǔ)。用抗腫瘤單抗檢查病理標(biāo)本，可協(xié)助確定轉(zhuǎn)移腫瘤的原發(fā)部位。以放射性核素標(biāo)記單抗可用于體內(nèi)

8、診斷，再結(jié)合X-線斷層掃描技術(shù)，可對(duì)腫瘤的大小及其轉(zhuǎn)移灶作出定量診斷。4、機(jī)體微量成分的測(cè)定。應(yīng)用單抗結(jié)合其它技術(shù)，可對(duì)機(jī)體的多種微量成分進(jìn)行測(cè)定。如放射免疫分析，即是利用了同位素的靈敏性和抗原-抗體反應(yīng)的特異性而建立起來的方法，它可以測(cè)至10-910-12g，使原來難以測(cè)定的激素能夠進(jìn)行定量分析。這種激素類單抗可用于測(cè)定體內(nèi)激素水平，判斷內(nèi)分泌的功能狀態(tài)。除了激素，還可檢測(cè)諸多酶類、維生素、藥物和其它生化物質(zhì)。這對(duì)受檢者健康狀態(tài)判斷、疾病檢出、指導(dǎo)診斷和臨床治療均具有實(shí)際意義。3.2 用于疾病的治療1、抗腫瘤單抗,可用于腫瘤的導(dǎo)向治療。抗腫瘤單抗利妥昔單抗（rituximab）( 美羅華)

9、是第一個(gè)被批準(zhǔn)用于臨床治療的單抗; 它是一種針對(duì)CD20 抗原的人鼠嵌合型單克隆抗體,進(jìn)入人體后可與CD20特異性結(jié)合導(dǎo)致B 細(xì)胞溶解,從而抑制B 細(xì)胞增殖,誘導(dǎo)成熟B 細(xì)胞凋亡,但不影響原始B 細(xì)胞。隨后上市的適用于乳腺癌治療的曲妥珠單抗為一種針對(duì)HER22/neu 的重組人源化IgG 單克隆抗體, 能特異性識(shí)Her22 調(diào)控的細(xì)胞表面蛋白HER22,使其通過內(nèi)吞噬作用離開胞膜進(jìn)入核體內(nèi),抑制其介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo),從而起到治療腫瘤的作用。表 抗體類藥物及其靶分子 而阿倫珠單抗（Alemtuzumab）是人源化、非結(jié)合型單抗,作用靶點(diǎn)為正常與異常B 淋巴細(xì)胞的CD52 抗原, 對(duì)源于B 和T 細(xì)胞

10、的各種惡性腫瘤具有很好的治療作用。西妥昔單抗（Cetuximab）和貝伐單抗（如下表所示其獨(dú)特的作用機(jī)理）是針對(duì)大腸癌的治療。曲妥珠單抗在乳腺癌的治療中起著重要的作用; 西妥昔單抗已被證實(shí)它對(duì)頭頸部癌，非小細(xì)胞肺癌和結(jié)腸癌等多種腫瘤有效。最新發(fā)表的EXTREME（愛必妥）一線治療復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移性頭頸部癌的研究表明，采用西妥昔單抗聯(lián)合順鉑或卡鉑+氟尿嘧啶作為一線治療方案，患者的總生存期（OS）及無進(jìn)展生存期（PFS）均顯著延長(zhǎng)如下圖所示。 美國(guó)Genentech和Biogen Idec公司宣布2011年1月28日美國(guó)食品和藥品監(jiān)督管理局(FDA)批準(zhǔn)美羅華（Rituxan，rituxima

11、b，利妥昔單抗)作為對(duì)初始治療用美羅華加化療(誘導(dǎo)治療)有療效的晚期濾泡淋巴瘤一種維持治療如下圖所示。美羅華（Rituxan，rituximab），利妥昔單抗圖 EXTREME研究單純化療組和化療+西妥昔單抗組的OS圖 EXTREME研究單純化療組和化療+西妥昔單抗組的PFS貝伐單抗獨(dú)特的作用機(jī)制2、抗細(xì)胞表面分子單抗,可抑制同種免疫反應(yīng)主要用于移植排斥反應(yīng)的防治。抗人T淋巴細(xì)胞單抗(McAb)作為一種新型免疫抑制劑，已廣泛應(yīng)用于臨床治療自身免疫疾病和抗器官移植的排斥反應(yīng)。其作用機(jī)理有賴于McAb的種類及其免疫學(xué)特性。注射抗小鼠Thy-1抗原的單抗，可以抑制小鼠同種皮膚移植的排斥反應(yīng)。此外，對(duì)

12、用于同種骨髓移植的供體骨髓，在體外經(jīng)抗T細(xì)胞單抗加補(bǔ)體處理，能減輕移植物抗宿主病的發(fā)生。如莫羅單抗(muromonab- CD3, CD3-單克隆抗體，Orthoclone，OKT3)是FDA 批準(zhǔn)用于腎移植患者防止異體排斥反應(yīng)的第一個(gè)鼠源型McAb。此外，人-鼠嵌合抗體Basiliximab、人源化McAb Daclizumab 在器官移植排斥反應(yīng)的治療上也取得了良好的效果。莫羅單抗(muromonab- CD3, CD3-單克隆抗體，Orthoclone，OKT3)3、單克隆抗體在其它疾病中的應(yīng)用單克隆抗體藥物不只在腫瘤的治療中取得了很好療效,在其他疾病的治療中也取得了一些療效,例如:奧馬

13、珠單抗(omalizumab) 通過與游離IgE 結(jié)合而顯著降低游離IgE 的水平, 阻斷IgE 與肥大細(xì)胞、嗜堿粒細(xì)胞結(jié)合,防止炎癥介質(zhì)的釋放。可顯著改善哮喘病人的癥狀、肺功能及生活質(zhì)量,減少哮喘惡化的發(fā)作次數(shù),減少糖皮質(zhì)激素的用量,使用安全,具有很好的耐受性。Mab03.2C1C2 在體外能抑制白念珠菌芽管的形成, 從而抑制白念珠菌對(duì)上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞的粘附,降低白念珠菌的侵襲力。圖 奧馬珠單抗治療慢性蕁麻疹?yuàn)W馬珠單抗（Omalizumab)是人源化DNA單克隆抗體，具有：選擇性與血液中游離IgE結(jié)合，阻斷IgE與FcRI或FcRII結(jié)合，從而阻斷肥大細(xì)胞或嗜堿性粒細(xì)胞釋放組胺；當(dāng)游離Ig

14、E濃度降到“0'時(shí)，能下調(diào)嗜堿性粒細(xì)胞或肥大細(xì)胞表面FcR I的表達(dá)，降低效應(yīng)細(xì)胞對(duì)過敏原的反應(yīng)性；IgE奧馬珠單抗復(fù)合物在循環(huán)和組織中積聚，對(duì)新進(jìn)入的過敏原分子具有清道夫的作用;馬珠單抗與表達(dá)IgE受體的B細(xì)胞結(jié)合，抑制抗原遞呈。近年來，奧馬珠己被FDA批準(zhǔn)用于治療成人中重度持續(xù)性過敏性哮喘和12歲以上兒童患者，對(duì)過敏性關(guān)節(jié)炎和類似抗IgE復(fù)合物引起的疾病。Blune JW等首先報(bào)告1例患有中等度持續(xù)性哮喘、結(jié)節(jié)病伴有復(fù)發(fā)性水腫8年的61歲高家索患者，經(jīng)過奧馬珠治療后血管水腫很快意外消失。SpeclDr SL等報(bào)告3例經(jīng)傳統(tǒng)方法不能控制的慢性蕁麻疹患者，其中1例IgE水平低下，抗Ig

15、E受體的抗體水平升高；1例IgE水平升高但抗IgE受體的抗體水平正常；另1例IgE水平非常高，抗IgE受體的抗體水平也高。3例均按推薦方案給藥，結(jié)果：2例在治療1周后癥狀完全消失，另1例在6周內(nèi)消失，治療后異常的抗IgE受體的抗體水平均恢復(fù)正常。Sha iro CA等報(bào)告6例嚴(yán)重性蕁麻疹伴有或不伴有水腫病例，這些患者或者對(duì)免疫抑制劑無效或者拒絕，按照哮喘的方法和劑量給藥，間隔時(shí)間依據(jù)蕁麻疹或水腫的復(fù)發(fā)情況而定，5/6的患者在治療1周內(nèi)所有癥狀被控制，逐漸停用其它藥物，1例無效，絕大多數(shù)患者在6個(gè)月后停藥無復(fù)發(fā)。另有研究顯示,輸注英夫利昔單抗（Infliximab）可快速、顯著緩解頑固性銀屑病、

16、關(guān)節(jié)炎病人的關(guān)節(jié)和皮損癥狀。 圖 幼年脊柱關(guān)節(jié)病使用英夫利昔單抗又如單抗8H8一種抗登革熱病毒核衣殼蛋白( C 蛋白) 的單抗對(duì)登革熱病和登革熱出血熱/失血性休克綜合征的早期診斷和治療均有一定效果。在艾滋病的治療上，利用基因工程手段制備的中和抗體F425-B4e8( B4e8) ，可以中和艾滋病病毒1 上的抗原表位，阻止艾滋病病毒1 對(duì)人體正常組織的感染。對(duì)自身免疫性疾病的治療，單抗藥物能夠與黏附分子、激活標(biāo)記、抗原或受體靶分子結(jié)合，能在分子水平上調(diào)節(jié)免疫病理反應(yīng)，從而干擾炎性反應(yīng)的發(fā)生。還有治療感染性休克和膿毒血癥的單抗，個(gè)別也有治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、型糖尿病和腸炎的單抗。此外，還有臨床試用于

17、預(yù)防器官移植抗排異反應(yīng)、抗血小板凝集和艾滋病的單抗。3.3抗腫瘤單抗偶聯(lián)物（生物導(dǎo)彈）抗腫瘤單抗耦聯(lián)物免疫耦聯(lián)物分子由單抗與兩部分構(gòu)成。可用作“彈頭”的物質(zhì)主要有三類，即放射性核素、藥物和毒素; 與單抗連接分別構(gòu)成放射免疫耦聯(lián)物、化學(xué)免疫耦聯(lián)物和免疫毒素。此外, 酶結(jié)合單抗偶聯(lián)物、光敏劑結(jié)合單抗偶聯(lián)物也已進(jìn)入腫瘤治療的研究范疇。單抗靶向治療作用方式（一）、直接作用：通過抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)細(xì)胞毒（ADCC）、補(bǔ)體依賴細(xì)胞毒（CDC）的細(xì)胞溶解效應(yīng)殺傷腫瘤細(xì)胞。（二）、間接作用：?jiǎn)慰棺鳛榘邢蜉d體，偶聯(lián)細(xì)胞毒藥物（放射性核素、化療藥物、毒素等）。靶向腫瘤后利用細(xì)胞毒殺傷腫瘤細(xì)胞。放射免疫治療的作用機(jī)

18、理主要是間接作用。 1、免疫偶聯(lián)物放射免疫治療(RIT)放射免疫耦聯(lián)物放射性免疫耦聯(lián)物是以單克隆抗體為載體,以放射性核素為彈頭,通過抗體特異性結(jié)合腫瘤細(xì)胞相關(guān)抗原,將產(chǎn)生高能射線的放射性核素靶向到腫瘤細(xì)胞, 借助放射性同位素的電離輻射效應(yīng)殺傷腫瘤細(xì)胞或抑制其生長(zhǎng)，同時(shí)又降低對(duì)正常組織的放射性損傷。實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤的近距離內(nèi)照射治療。RIT 利用攜帶放射性核素的單克隆抗體特異地結(jié)合到病灶部位,減少了對(duì)正常組織的損傷。如在前列腺癌治療中應(yīng)用最廣泛的抗前列腺特異性膜抗原的單抗,其CYT- 356 為最早制備的一種單抗。 圖 放射免疫治療圖 131I-腫瘤細(xì)胞核人鼠嵌合單抗腦膠質(zhì)瘤免疫導(dǎo)向放療2、免疫毒素免疫毒素是用化學(xué)方法或基因工程方法將腫瘤選擇性單抗與經(jīng)修飾的多肽毒素共價(jià)連接而成的腫瘤治療藥物。免疫毒素可與腫瘤細(xì)胞表面受體或與細(xì)胞表面的靶抗原相結(jié)合后內(nèi)化,繼而在胞內(nèi)抑制細(xì)胞蛋白質(zhì)合成,導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞死亡。毒素有很多種,如植物毒素、細(xì)菌毒素、動(dòng)物毒素。國(guó)內(nèi)上海將肺癌單抗與蓖麻毒素、相思子毒素和抗癌藥如阿霉素、絲裂霉素、氨甲喋呤等偶聯(lián)成功。圖 針對(duì)CD25的免疫毒素3、化學(xué)免疫偶聯(lián)物單抗化學(xué)免疫耦聯(lián)物單抗與藥物耦聯(lián)物對(duì)腫瘤靶細(xì)胞顯示選擇性殺傷作用，它是藥物良好的靶向性載體,通過藥物分子上特殊的功能基團(tuán)如:羥基、巰基、氨