DNA的構(gòu)建和目標(biāo)基因的篩選

1、第十一章 DNA文庫的構(gòu)建和目標(biāo)基因的篩選文庫的英文名稱是Library，指圖書管理系統(tǒng)?；蛭膸欤ㄒ卜QDNA“文庫”）是指某一生物體全部或部分基因的集合，象一個沒有目錄的“基因圖書館”。某個生物的基因組DNA或cDNA片段與適當(dāng)?shù)妮d體在體外通過重組后，轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，并通過一定的選擇機(jī)制篩選后得到大量的陽性菌落（或噬菌體），所有菌落或噬菌體的集合即為該生物的基因文庫。基因文庫（gene library）由外源DNA片段、載體和宿主等三個部分組成。高等生物的基因組十分復(fù)雜，單個基因在基因組中或某個特定發(fā)育階段或特定組織中所占比例很小。哺乳動物單倍體基因組大約含有3´109個堿基對（ba

2、se pairs, bp），一個3 000 bp 的DNA片段只占基因組總DNA的百萬分之一。同樣，一種稀有mRNA可能只占總mRNA的十萬或百萬分之一。因此，要想從龐大的基因組中分離某個特定的未知序列基因并進(jìn)行遺傳操作是很難的，必須構(gòu)建基因文庫對該基因進(jìn)行體外擴(kuò)增，利用一些文庫篩選技術(shù)獲得包含該基因的陽性克隆，然后對陽性克隆進(jìn)行分析。基因文庫構(gòu)建的基本程序包括：提取研究對象基因組DNA，制備合適大小的DNA片段，或提取組織或器官的mRNA并反轉(zhuǎn)錄成cDNA；DNA片段或cDNA與經(jīng)特殊處理的載體連接形成重組DNA；重組DNA轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞或體外包裝后侵染受體菌；陽性重組菌落或噬菌斑的選擇。構(gòu)建

3、基因文庫目的是為了從中篩選出所感興趣的目的基因，常用的篩選方法有核酸探針雜交法、抗體免疫法和差異雜交法等多種方法，必須根據(jù)所研究基因的各種信息如表達(dá)豐度、蛋白質(zhì)特性和DNA序列等以及基因文庫的特點(diǎn)和類型選擇適當(dāng)?shù)暮Y選方法。按照外源DNA片段的來源，可將基因文庫分為基因組DNA文庫（genomic DNA library）和cDNA文庫（complementary DNA library）?；蚪MDNA文庫是指將某生物體的全部基因組DNA用限制性內(nèi)切酶或機(jī)械力量切割成一定長度范圍的DNA片段、與合適的載體體外重組并轉(zhuǎn)化相應(yīng)的宿主細(xì)胞獲得的所有陽性菌落。其實(shí)質(zhì)就是采用不同的“化整為零”策略，將巨大

4、的基因組分解成一段段來研究，而每段包含一個或幾個基因。通常所說的基因組DNA文庫主要針對染色體基因組而言，但基因組DNA文庫通常含有一定比例的重組體，其外源DNA來自染色體以外的DNA，如線粒體和葉綠體等細(xì)胞器DNA以及質(zhì)粒DNA。也可分別提取這些染色體外的DNA構(gòu)建亞基因組文庫。cDNA文庫中的外源DNA片段是互補(bǔ)DNA（complementary DNA, cDNA）。cDNA是由生物的某一特定器官或特定發(fā)育時期細(xì)胞內(nèi)的mRNA經(jīng)體外反轉(zhuǎn)錄后形成的。也就是說，cDNA文庫代表生物的某一特定器官或特定發(fā)育時期細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄水平上的基因的群體。由于基因表達(dá)具有組織特異性和發(fā)育時期特異性，因此cDN

5、A文庫所代表的基因也就具有這樣的時空特性，它僅包含所選材料在特定時期里表達(dá)的基因，并不能包括該生物的全部基因，且這些基因在表達(dá)豐度上存在很大差異。基因組文庫與cDNA文庫最大的區(qū)別在于cDNA文庫具有時空特異性。cDNA文庫反映了特定組織(或器官)在某種特定環(huán)境條件下基因的表達(dá)譜，因此對研究基因的表達(dá)、調(diào)控及基因間互作是非常有用的。但是，由于mRNA是基因轉(zhuǎn)錄加工后的產(chǎn)物，不包含間隔序列及調(diào)控區(qū)。而基因組文庫包含了基因的全部信息，如編碼區(qū)及非編碼區(qū)、內(nèi)含子和外顯子、啟動子及其所包含的調(diào)控序列等，為全方位研究基因的表達(dá)、調(diào)控等提供了信息。由于基因組DNA文庫和cDNA文庫性質(zhì)上的不同，在實(shí)際應(yīng)用

6、中應(yīng)根據(jù)研究的目的選擇構(gòu)建和利用何種文庫。如果研究的目標(biāo)不是表達(dá)的基因，而是控制基因表達(dá)的調(diào)控序列或在mRNA分子中不存在的另外一些特定序列（如內(nèi)含子），則只能選用基因組DNA文庫來研究。而對于原核生物來說，由于沒有內(nèi)含子和mRNA的多聚A尾，因此沒有必要同時也不便于構(gòu)建cDNA文庫，主要通過構(gòu)建基因組文庫來克隆目標(biāo)基因?？偟恼f來，兩種文庫都在基因的分離與克隆領(lǐng)域應(yīng)用廣泛，其中在結(jié)構(gòu)基因組研究中，全基因組物理圖譜構(gòu)建和測序等工作都離不開基因組DNA文庫，而cDNA文庫在注釋基因和研究基因的功能方面應(yīng)用更多。構(gòu)建基因文庫的目的是用來分離克隆目的基因、構(gòu)建覆蓋生物體基因組的物理圖譜、基因組測序以及

7、研究基因的表達(dá)譜。第一節(jié) 基因組DNA文庫的構(gòu)建一、基因組DNA文庫的類型和發(fā)展用于構(gòu)建基因文庫的載體主要有質(zhì)粒、噬菌體、粘粒及人工染色體等，有關(guān)這些載體的知識參見本書第五章和第六章。構(gòu)建大片段基因組DNA文庫使用的載體主要有噬菌體載體、粘粒載體(cosmid)、細(xì)菌人工染色體載體(BAC)、酵母人工染色體載體(YAC)、P1噬菌體載體和P1人工染色體載體(PAC)。根據(jù)特征，這些載體可以分為兩類：一類是基于噬菌體改建的，利用了噬菌體的包裝效率高和雜交篩選背景低的優(yōu)點(diǎn)；另一類是經(jīng)改造的質(zhì)粒載體或人工染色體，其主要優(yōu)點(diǎn)在于可容納超過100 kb以上的外源片段。載體的類型決定了插入片段的大小和用途

8、。每類載體適于構(gòu)建不同的基因文庫，滿足不同的研究目的。下面分別描述各類文庫。1. 質(zhì)粒文庫質(zhì)粒是最早用于構(gòu)建基因組文庫的載體，現(xiàn)已發(fā)展了數(shù)十種適用于克隆、表達(dá)和測序等不同目的的質(zhì)粒載體。質(zhì)粒載體所容納的外源DNA片段一般在10 kb以內(nèi)?，F(xiàn)在，這類基因組DNA文庫一般應(yīng)用于“鳥槍法”全基因組測序研究和用于構(gòu)建亞克隆文庫或亞基因組文庫。2噬菌體文庫噬菌體文庫是以細(xì)菌噬菌體經(jīng)改造衍生的一些載體系統(tǒng)構(gòu)建的，常用的有l(wèi)噬菌體載體、M13單鏈?zhǔn)删w載體、P1噬菌體載體及由噬菌體衍生的質(zhì)粒載體(phagemid或phasmid)。M13載體所容納的外源片段較小，一般用于構(gòu)建cDNA文庫或用于構(gòu)建基因組測序

9、的BAC或PAC亞克隆文庫。噬菌體文庫中應(yīng)用最廣的是l噬菌體。由于其有利于利用分子雜交的方法進(jìn)行篩選，用l噬菌體構(gòu)建的基因組DNA文庫在小基因組物種的基因克隆中起著重要的作用。3粘粒文庫粘粒又稱柯斯質(zhì)粒，是由l噬菌體的cos序列、質(zhì)粒的復(fù)制序列及抗生素抗性基因構(gòu)建而成的一類特殊的質(zhì)粒載體。Cosmid載體和噬菌體載體類似，它們主要用于構(gòu)建小基因組物種的基因組DNA文庫。有時也采用這類系統(tǒng)構(gòu)建大基因組物種的基因組DNA文庫，主要用途是利用它們在篩選上的優(yōu)勢來分離一些單個的基因或用來構(gòu)建一定區(qū)間范圍的亞基因組DNA文庫等。4人工染色體文庫 包括酵母人工染色體文庫、細(xì)菌人工染色體文庫和P1人工染色體

10、文庫。其特點(diǎn)是利用了人工染色體的載體類型，可插入大片段的DNA（插入片段大小從100 kb1 Mb），也稱為大片段基因組DNA文庫。主要用于大基因組作物的基因克隆、物理圖譜構(gòu)建和基因組測序等，在基因組研究中應(yīng)用越來越廣泛。5亞基因組文庫 亞基因組文庫是相對于基因組文庫提出的，文庫的對象不是全基因組范圍，而是基因組的某一區(qū)段，如基因組DNA某一特定大小酶切片段的組合、一條染色體或更小的區(qū)段如一個YAC或BAC克隆等。在基因組研究中，有時通過Southern雜交可以判斷出攜帶目標(biāo)基因的DNA片段大小，此時可以利用該酶對基因組DNA進(jìn)行消化并回收這一大小的DNA片段來構(gòu)建文庫進(jìn)行基因的篩選；也有先利

11、用原位雜交等技術(shù)將基因定位于某一條染色體，然后通過顯微切割的方法分離單條的染色體來構(gòu)建亞基因組文庫；還可以先將基因定位于一個YAC或BAC克隆子，再構(gòu)建該克隆的亞基因組文庫來分離目標(biāo)基因。一般而言，亞基因組文庫主要應(yīng)用在基因組較小的物種基因克隆或大基因組物種的后期研究，其構(gòu)建的原理基本相同，構(gòu)建流程快捷，方法更加簡單。6基因組文庫的發(fā)展基因組DNA文庫系統(tǒng)的發(fā)展是基于研究的需要而不斷開發(fā)和改良的，在上世紀(jì)70年代至80年代，多數(shù)的研究者主要興趣是分離自己感興趣的包含一個基因或幾個串聯(lián)在一起的基因，質(zhì)粒、噬菌體和粘粒載體就已經(jīng)可以滿足其要求。由于插入片段小、轉(zhuǎn)化效率高、文庫篩選方便、需要DNA的

12、數(shù)量少而且對質(zhì)量的要求不高等優(yōu)點(diǎn)，一般在很短的時間內(nèi)就可以獨(dú)立完成。正是這樣的高效克隆的優(yōu)點(diǎn)，這類基因組DNA文庫廣泛用于一些類似細(xì)菌、真菌等小基因組物種的研究中。進(jìn)入80年代后期，隨著一些大基因組物種的基因克隆和物理作圖研究的興起，由于裝載的片段小這些載體的弱點(diǎn)就暴露出來。自1976年，包括線蟲、果蠅、擬南芥以及人等染色體物理圖譜的繪制就已經(jīng)開始需要大片段基因組DNA文庫技術(shù)的發(fā)展。這種變化有兩個方面的因素，第一是研究目標(biāo)的變化。當(dāng)目標(biāo)是一個基因或一小段DNA片段時，只要提高總體文庫克隆的數(shù)目，一般可以篩選到目標(biāo)基因。但如果研究的目標(biāo)是一個很大甚至包含百萬級、千萬級堿基對大小甚至是全基因組時

13、，不僅要求篩選到陽性克隆，而且還要包含把篩選到的陽性克隆進(jìn)行拼接組裝成完整的片段，如果插入片段小，由于可用的分子標(biāo)記少，其拼接的工作難度就非常高。同時，對于大基因組物種中的未知基因克隆而言，通常用于篩選的探針不是基因本身而是與基因鄰近的分子標(biāo)記，為克隆目標(biāo)基因可能需要進(jìn)一步進(jìn)行染色體步查。這樣一來大插入片段文庫就具有明顯的優(yōu)點(diǎn)，有利于基因克隆。第二是80年代后期出現(xiàn)了微陣列雜交技術(shù)，它將文庫從隨機(jī)性研究推動到了系統(tǒng)的定位研究上，從而在保證文庫完整性的前提下，插入片段大就意味著所需克隆數(shù)的減少和成本的降低。所以，開發(fā)可容納大片段的載體成了構(gòu)建大片段基因組文庫的開始，先后有YAC、P1、BAC和P

14、AC，它們可以滿足701 000 kb的插入范圍。隨著研究的進(jìn)一步深入，對文庫系統(tǒng)進(jìn)行了一些篩選和改良，BAC和PAC成了目前在基因組研究中最為常用的兩種載體，而P1載體和YAC載體已經(jīng)不再是常用的載體系統(tǒng)。另外，在載體的改良上也有一些變化，如在植物基因組DNA文庫的構(gòu)建過程中，對載體的改良就體現(xiàn)在把轉(zhuǎn)基因所需的T-DNA序列和大片段文庫的載體融合到一起，這樣，構(gòu)建的基因組DNA文庫同時可以直接用作轉(zhuǎn)基因，這類載體出現(xiàn)了很多，如BIBAC和TAC等。二、代表性和隨機(jī)性為保證能從基因組文庫中篩選到某個特定的感興趣的基因，基因組文庫必須具有一定的代表性和隨機(jī)性。所謂代表性是指文庫中所有克隆所攜帶的

15、DNA片段重新組合起來可以覆蓋整個基因組，也就是說，可以從該文庫中分離任何一段DNA。代表性是衡量文庫質(zhì)量的一個很重要的指標(biāo)。在實(shí)際應(yīng)用過程中，由于基因組的巨大和未知性，無法考察文庫的完整性。所以在文庫的構(gòu)建過程中引用了兩個策略，一是采用部分酶切或隨機(jī)切割的方法來消化染色體DNA，以保證克隆的隨機(jī)性，保證每段DNA在文庫中出現(xiàn)的頻率均等；二是提高文庫所含基因組DNA的總?cè)萘浚簿褪俏膸熘兴兄亟M克?。ɑ蚩寺∽樱┌耐庠碊NA片段的總和，通常用覆蓋基因組的倍數(shù)來衡量。文庫總?cè)萘坑赏庠雌蔚钠骄L度和重組克隆的數(shù)量共同決定，外源片段的長度受所選用的載體系統(tǒng)限制。從經(jīng)濟(jì)的角度考慮，重組克隆的數(shù)量并

16、不是越多越好，因此選用一個合適的重組克隆數(shù)量是很有必要的。為預(yù)測一個完整基因組文庫應(yīng)包含克隆的數(shù)目，Clark 和Carbon于1975年提出如下的計算公式：N=ln(1-p)/ln(1-f)式中: N代表一個完全基因組文庫所應(yīng)該包含的重組克隆個數(shù) p表示所期望的目的基因在文庫中出現(xiàn)的幾率f表示重組克隆平均插入片段的大小和基因組DNA大小的比值以大腸桿菌基因組為例，其基因組大小約為4.6 Mb，若p=99%，平均插入片段大小為20 kb時，f=20kb/4 600kb，則N=1 057，即當(dāng)期望從一個平均插入片段為20kb的大腸桿菌基因組文庫中篩選到任意一個感興趣的基因的概率達(dá)到99，該基因組

17、文庫至少應(yīng)包含1 057個重組克隆。高等哺乳動物如人的基因組達(dá)到3×109bp，如果以同樣要求來構(gòu)建一個基因組文庫，則需要克隆數(shù)N=6.9´105。由此可以看出，當(dāng)基因組較小時，只需要較少數(shù)目的克隆即可篩選到目的基因；而當(dāng)基因組很大時，所需要的克隆數(shù)是一個天文數(shù)字，在實(shí)際操作中是存在很大困難的。因此，對于基因組較大的生物，應(yīng)該選擇裝載能力更大的載體系統(tǒng)，這樣可以大大減少所需克隆的數(shù)目。因此，選擇合適的載體系統(tǒng)和挑取一定數(shù)量的陽性克隆是構(gòu)建基因組DNA文庫時首先要考慮的問題。三、基因組DNA文庫的構(gòu)建流程基因組DNA文庫的構(gòu)建流程相對簡單，但需要很多特殊的處理以及必要的儀器設(shè)

18、備，尤其是構(gòu)建插入片段較大的文庫如BAC、PAC和YAC文庫，其成功的關(guān)鍵都體現(xiàn)在操作的細(xì)節(jié)上，這些都將在本節(jié)的后部分加以介紹。基因組DNA文庫的構(gòu)建程序包含5個部分：載體的制備；高純度大分子量基因組DNA（High molecular weight DNA, HMW DNA）的提??；HMW DNA的部分酶切與脈沖電泳分級分離（PFGE size selection）；載體與外源片段的連接與轉(zhuǎn)化或侵染宿主細(xì)胞；重組克隆的挑取和保存。構(gòu)建噬菌體文庫如P1等的程序稍有不同，連接產(chǎn)物不用電轉(zhuǎn)化的方法轉(zhuǎn)化宿主，而是采用包裝蛋白進(jìn)行包裝并侵染宿主。1基因組DNA文庫的載體制備載體的好壞是影響連接成功與否

19、的關(guān)鍵，載體的制備要求兩點(diǎn)：一是純度高；二是去磷酸化好。首先，載體去磷酸化是為了提高連接效率，在同一個連接組分中，載體自身連接速度遠(yuǎn)大于與外源片段的連接速度，如果去磷酸化不好，連接就不充分，影響重組克隆的挑取。第二，如果純度不高，則重組克隆中會出現(xiàn)大量的假陽性菌落，它們中的插入片段并不是來自所用材料的染色體DNA，而是細(xì)菌基因組DNA。在所有載體中，最難制備的是BAC類載體。一是其拷貝數(shù)低，難于提取足量的質(zhì)粒。可喜的是近年來發(fā)展了多拷貝的BAC載體（如pCUGIBAC1等），它將pBeloBAC11載體和常用的多拷貝載體pBluescript融合在一起，而構(gòu)建的文庫質(zhì)量沒有區(qū)別。二是插入片段大

20、，其去磷酸化的要求也更加嚴(yán)格。以BAC載體pBeloBAC11為例，要構(gòu)建一個高質(zhì)量的文庫，需要1mg左右的質(zhì)粒用于氯化銫梯度離心分離超螺旋狀態(tài)的組分，至少要從14升處于對數(shù)生長期的培養(yǎng)物提取質(zhì)粒才能滿足需要。2高質(zhì)量大分子量基因組DNA的提取和部分酶切 構(gòu)建不同大小插入片段的基因組文庫對DNA質(zhì)量要求不同，一般所提取的DNA分子量至少應(yīng)該是文庫最終平均插入片段長度的35倍。噬菌體和Cosmid文庫的最大插入片段分別為23 kb和45 kb，要求所提取的基因組DNA分子量分別在100 kb和200 kb左右才能滿足構(gòu)建文庫的需要。如果要求插入片段達(dá)到100 kb以上，則要求所提取的基因組DNA

21、分子量就要達(dá)到500 kb以上。實(shí)踐表明，提取的基因組DNA分子量越大，所得到的重組克隆的插入片段越大。真核生物基因組DNA提取方法有液相法和固相法。常規(guī)的液相提取方法如CTAB法可以提取100 kb左右的DNA，基本可以滿足構(gòu)建各種小插入片段基因組文庫的要求。大分子量基因組DNA提取方法很復(fù)雜，一般采用的是在固相環(huán)境下對游離的單個細(xì)胞進(jìn)行操作，避免了移液和搖動等造成的剪切力，保護(hù)了DNA的完整。對于不同的生物材料，提取大分子量DNA的方法也略有不同，但制備HMW DNA的過程基本相似，都利用了低熔點(diǎn)瓊脂糖包埋固定的方法。將細(xì)胞固定在低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠中，并浸泡在含有EDTA的緩沖液中。在這中包

22、埋狀態(tài)下對細(xì)胞進(jìn)行破壁、去除蛋白和雜質(zhì)、清洗，之后進(jìn)行酶學(xué)反應(yīng)。在這種情況下可以有效地保護(hù)DNA不被剪切壓力打斷，避免細(xì)胞內(nèi)核酸酶降解。如圖11-1所示，大分子DNA提取有兩個主要步驟：第一是將提供的材料制備成單個細(xì)胞的懸浮液；第二是將DNA包埋并且純化出HMW DNA。除了DNA被固定之外，包埋在低熔點(diǎn)瓊脂糖中的HMW DNA的部分酶切反應(yīng)所需的其它組分和普通的部分酶切沒有什么不同。酶切之后的DNA在連接之前要經(jīng)過分級分離，大片段基因組DNA文庫主要是通過PFGE法回收對應(yīng)大小區(qū)段的DNA，小片段基因組DNA文庫則常用蔗糖密度梯度離心法回收酶切的DNA。培養(yǎng)的單細(xì)胞組織血液收集細(xì)胞破碎濃縮白

23、細(xì)胞清洗懸浮細(xì)胞（1）調(diào)整細(xì)胞濃度至確定值（2）低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠固定成塊狀(plug)或粒狀(beads)（4）蛋白酶K或脂酶在EDTA環(huán)境下消化蛋白質(zhì)和脂質(zhì)（5）清洗樣品保存在EDTA溶液存在細(xì)胞壁時需降解處理（3）圖11-1 瓊脂糖包埋法制備HMW DNA的流程圖圖中括號部分標(biāo)注是操作中必須注意的部分：（1）懸浮細(xì)胞必須是單個游離的；（2）包埋之前一定要調(diào)整細(xì)胞濃度；（3）有細(xì)胞壁存在時，一定要清除。（4）包埋用瓊脂糖的質(zhì)量一定要好，否則影響后面的酶切。（5）采用蛋白酶K法后要用蛋白酶抑制劑PMSF抑制殘留蛋白酶活性3文庫的連接轉(zhuǎn)化或包裝侵染 連接反應(yīng)是將部分酶切后回收的DNA同載體在T4

24、 DNA 連接酶的作用下連接在一起的過程。連接的質(zhì)量直接決定著文庫的轉(zhuǎn)效率或包裝效率，在連接體系中同時存在著至少四種連接方式：載體自連、載體和基因組DNA片段之間的連接、基因組DNA片段的自連和基因組DNA片段之間的連接。而其中只有載體和基因組DNA片段之間的連接才是有效的，如何提高它們之間的連接效率是連接反應(yīng)的關(guān)鍵。在連接酶、載體和外源基因組DNA已經(jīng)確定的時候，可通過調(diào)整載體與基因組DNA的比例來達(dá)到較好的效果。一般在構(gòu)建大片段基因組DNA文庫時，大量連接前都要先使用小體系連接來尋找最適的比例。在轉(zhuǎn)化和包裝侵染過程中，最好選擇轉(zhuǎn)化效率高的感受態(tài)細(xì)胞和最佳的轉(zhuǎn)化條件或效價高且質(zhì)量穩(wěn)定的包裝蛋

25、白。4文庫的質(zhì)量檢測 文庫質(zhì)量是由文庫所含克隆的數(shù)目、平均插入片段的長度、插入效率、基因組覆蓋度和覆蓋倍數(shù)等因素決定的?？寺〉臄?shù)量越大，平均插入片段越長，插入的效率和基因組覆蓋度越接近100，就會是一個質(zhì)量好的文庫。而在實(shí)際應(yīng)用中，克隆子數(shù)目的多少是可以通過轉(zhuǎn)化的多少來輕松控制的。但并不是越多越好，而是要比較基因組覆蓋倍數(shù)和基因組覆蓋度，一般達(dá)到46倍覆蓋率就可以了。 在文庫的質(zhì)量檢測中，除了克隆子數(shù)目是可以確定的，其它值都是估算的。文庫的平均插入片段長度是通過PFGE電泳檢測一定數(shù)目的重組子的插入片段大小所得平均值。對于大片段文庫而言，平均插入片段大小是衡量文庫質(zhì)量的一個重要依據(jù)，對BAC文

26、庫，一般要求植物的在130 kb左右，而動物的在150 kb左右。插入效率也是通過此法檢測的，表示有插入片段的克隆在所有檢測的克隆中所占的比例。基因組覆蓋倍數(shù)的計算方法一般有兩種：一種是計算法，基因組覆蓋倍數(shù)平均插入片段長度×克隆數(shù)/基因組DNA的長度（一般是約數(shù)）；另一種算法是結(jié)合基因組覆蓋度的檢測來進(jìn)行的。基因組覆蓋度是指文庫中的克隆覆蓋基因組的范圍，檢測時是通過選擇一定數(shù)目已知的單拷貝基因作探針來篩選文庫，通過能否檢測到陽性克隆來確定文庫中是否含有該基因，如果所有的探針都可從文庫中分離，則說明該文庫覆蓋度很高。由于所使用的每個探針篩選的克隆數(shù)目即表明文庫中對該基因位點(diǎn)的覆蓋倍數(shù)

27、，因此，基因組覆蓋倍數(shù)等于所有探針篩到的陽性克隆的總個數(shù)除以使用的總探針數(shù)。此外，文庫的質(zhì)量檢測還包括其它的特殊要求，如植物基因組BAC文庫，一般需要還檢測葉綠體DNA在文庫中的所占比例，其方法主要是利用葉綠體特異DNA作探針篩選文庫，要求葉綠體DNA在文庫中所占的比例小于5。 綜上所述，基因組DNA文庫的構(gòu)建方法、原理和思路都比較簡單，綜合起來主要是高質(zhì)量的載體、完整的基因組DNA的提取方法和高效的轉(zhuǎn)化或體外包裝體系的結(jié)合。然而，對于實(shí)際操作而言，成功主要取決于嚴(yán)謹(jǐn)、認(rèn)真的操作。對于大片段文庫而言，如何在操作中最大限度的減少DNA片段的外部剪切因素是成功的關(guān)鍵所在。第二節(jié) cDNA文庫的構(gòu)建

28、一、cDNA文庫的特征和發(fā)展將來自真核生物的mRNA體外反轉(zhuǎn)錄成互補(bǔ)雙鏈cDNA，并將它們連接到載體在大腸桿菌中繁殖的過程，稱為cDNA文庫的構(gòu)建。由于真核生物基因組非常巨大，結(jié)構(gòu)復(fù)雜，含有大量的非編碼區(qū)域、基因間間隔序列和重復(fù)序列等，直接利用基因組文庫有時很難分離到目的基因片段。即使分離到DNA片段，也必須同其cDNA序列來進(jìn)行比較，從而確定該基因的編碼區(qū)、非編碼區(qū)、翻譯產(chǎn)物和調(diào)控序列。而mRNA是基因的轉(zhuǎn)錄加工后的產(chǎn)物，不含有內(nèi)含子和其它調(diào)控序列，結(jié)構(gòu)相對簡單，且只在特定的組織器官、發(fā)育時期表達(dá)，并非所有基因組DNA編碼的基因都表達(dá)，從而可以減少研究的對象。因此，在某些情況下運(yùn)用cDNA文

29、庫分離基因比直接從基因組文庫中分離基因更具優(yōu)勢。此外，mRNA決定了功能蛋白的初始肽鏈的翻譯，可以用來研究蛋白質(zhì)的功能，因此自上世紀(jì)70年代中期首次合成cDNA以來，運(yùn)用cDNA文庫來進(jìn)行基因克隆和基因功能分析的研究就得到了快速發(fā)展，cDNA文庫已成為分子生物學(xué)研究的基本工具?；虻谋磉_(dá)具有時空性和表達(dá)量上的差異，時空性決定了cDNA文庫的取材，即mRNA來源于所篩選基因表達(dá)最高的發(fā)育時期或這一時期的特殊組織；而表達(dá)量的差異決定了構(gòu)建的cDNA文庫要具有合適的容量。在一定時期的單個細(xì)胞中，約有500 000個mRNA分子，可能代表了12萬個基因。根據(jù)表達(dá)豐度的不同可以將這些表達(dá)基因的mRNA分

30、成三類：高豐度、中等豐度和的低豐度。其中，高豐度的mRNA約有幾十種，每個細(xì)胞中可能含有5 000個拷貝；中等豐度的mRNA分子可能含有1 0002 000種，每個細(xì)胞含有約200300個拷貝；低等豐度的mRNA種類最多，但每個細(xì)胞僅含有115個拷貝左右。根據(jù)Clarke-Carbon的計算公式，如果要從文庫中篩到類似每個細(xì)胞只含一個拷貝的mRNA分子cDNA克隆（期望值p=0.99），需要cDNA文庫的容量為5 000 00010 000 000個重組子，而對于高豐度或中等豐度的mRNA編碼基因來說，文庫容量為105個就已足夠了。早期的cDNA文庫主要用于篩選單個目標(biāo)基因，由于噬菌斑原位雜交

31、背景比較低，因此，這一階段的 cDNA文庫多以噬菌體為克隆載體。在這個時期，還沒有發(fā)展有效的富集目標(biāo)mRNA的方法。不加修飾的cDNA文庫中的基因拷貝數(shù)與其mRNA相似，高豐度的mRNA在文庫中出現(xiàn)的頻率會高，低豐度的在文庫中出現(xiàn)的頻率會低。據(jù)估計復(fù)雜組織如腦組織中，高豐度表達(dá)的mRNA分子可能有36種，中等豐度表達(dá)的mRNA分子約2 150種，其它低豐度表達(dá)的mRNA分子約45 000種，它們分別占總mRNA數(shù)量的16、46和38，也就是說前兩種類型的mRNA分子在表達(dá)總量上占有62，這種比例也大約就是它們在cDNA文庫中所占的比例。隨著分子生物學(xué)研究的發(fā)展，構(gòu)建cDNA文庫的目的發(fā)生了重大

32、轉(zhuǎn)變。目前，構(gòu)建cDNA文庫的一個重要目的是研究特定器官或組織或發(fā)育時期基因的表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)新基因。通過大規(guī)模測定cDNA文庫中基因的序列獲得表達(dá)序列標(biāo)簽（Expressed sequence tag，EST）等，這些研究都是規(guī)模大、成本高的研究，因此對文庫在如何節(jié)約成本上提出了新的要求。希望降低高豐度表達(dá)基因在文庫中的冗余度（redundancy），同時提高低豐度表達(dá)基因在文庫中的代表性，要求在構(gòu)建文庫時對cDNA進(jìn)行一些處理。這些處理包括均一化、差減雜交和選擇性分離全長cDNA等技術(shù)。90年代初就開始出現(xiàn)均一化cDNA文庫（normalized cDNA library），這類文庫就是通過一

33、定的策略和方法，將構(gòu)建好的獨(dú)立cDNA文庫進(jìn)行一定的處理，將其中表達(dá)豐度高或較高的組分部分去除，從而達(dá)到文庫中各克隆出現(xiàn)的隨機(jī)性相對一致。在一個經(jīng)過均一化處理的cDNA文庫中，前兩種類型mRNA分子對應(yīng)的cDNA克隆的比例之和僅為4.6%，相當(dāng)于降低了13.5倍，低豐度表達(dá)的克隆在文庫中的比例高達(dá)95.4%，相當(dāng)于提高了2.5倍。這樣在EST測序和cDNA芯片的研究中，不僅可以很大的節(jié)約成本，而且可以相對提高一些極低豐度表達(dá)基因的出現(xiàn)頻率。由此，到了近幾年，由于很多大基因組物種的全基因組測序的完成，普通方法構(gòu)建的cDNA文庫中由于含有很多非全長的cDNA不利于對基因組內(nèi)的基因進(jìn)行準(zhǔn)確的注釋，因

34、此在基因的注釋上又進(jìn)一步開始了全長cDNA文庫的要求，本節(jié)將就這幾類文庫的構(gòu)建原理和方法進(jìn)行比較詳細(xì)的介紹。二、cDNA文庫的構(gòu)建 cDNA文庫的構(gòu)建共分四步：細(xì)胞總RNA的提取和mRNA分離；第一鏈cDNA合成；第二鏈cDNA合成；雙鏈cDNA克隆進(jìn)質(zhì)?；蚴删w載體并導(dǎo)入宿主中繁殖（如圖11-2）。圖11-2 cDNA文庫的構(gòu)建流程圖1RNA的分離cDNA文庫構(gòu)建是以mRNA為起始材料的。總RNA中絕大多數(shù)是tRNA和rRNA，而mRNA只占總RNA的15，mRNA的含量取決于細(xì)胞類型和細(xì)胞的生理狀態(tài)。在單個哺乳動物細(xì)胞中，大約有360 000個mRNA分子，約12 000種不同的mRNA，

35、有些mRNA分子占細(xì)胞mRNA的3，而有些mRNA分子只占不到0.01%。，這些“稀有”或“低豐度”mRNA在每個細(xì)胞中只有515個分子，但卻形成多達(dá)11 000種不同的mRNA分子，占基因總數(shù)的45。由于mRNA在總RNA中所占比例很小，因此從總RNA中富集mRNA是構(gòu)建cDNA文庫和其它應(yīng)用所必需進(jìn)行的步驟。通過降低rRNA和tRNA含量，可大大提高篩選到目標(biāo)基因的可能性。真核生物mRNA的3末端都含有一段Poly(A)尾巴，這是真核生物mRNA的一個重要特征。目前各種分離純化mRNA的方法正是利用了mRNA這一特征。目前純化mRNA的方法都是在固體支持物表面共價結(jié)合固定一段由脫氧胸腺嘧啶

36、核苷組成的寡聚核苷酸oligo(dT)鏈，由它與mRNA的Poly(A)尾巴雜交，從而吸附固定住mRNA，進(jìn)而將mRNA從其它組分中分離出來的。由于oligo(dT)鏈和Poly(A)都不長，其雜交后形成的雜合雙鏈在高鹽離子濃度下可以保持，在低鹽離子濃度下或較高溫度下就會分開，利用這一性質(zhì)從RNA組分中分離純化出mRNA。2cDNA第一鏈的合成由mRNA到cDNA的過程稱為反轉(zhuǎn)錄，由反轉(zhuǎn)錄酶催化。常用的反轉(zhuǎn)錄酶有兩種，即AMV（來自禽成髓細(xì)胞瘤病毒）和Mo-MLV（來自Moloey鼠白血病病毒），二者都是依賴于RNA的DNA聚合酶，有5®3DNA聚合酶活性。目前構(gòu)建cDNA文庫中常用

37、的反轉(zhuǎn)錄酶多是通過點(diǎn)突變?nèi)サ袅薘NA酶H活性的Mo-MLV。反轉(zhuǎn)錄酶是依賴RNA的DNA聚合酶，合成DNA時需要引物引導(dǎo)。目前常用的引物主要有兩種，即Oligo(dT)和隨機(jī)引物。Oligo(dT)引物一般包含1020個脫氧胸腺嘧啶核苷和一段帶有稀有酶切位點(diǎn)的片段，隨機(jī)引物一般是包含610個堿基的寡核苷酸短片段。Oligo(dT)引導(dǎo)的cDNA合成是在cDNA的合成過程中加入高濃度的Oligo(dT)引物，Oligo(dT)引物與mRNA的3末端的poly(A)配對，引導(dǎo)反轉(zhuǎn)錄酶以mRNA為模板合成第一鏈cDNA。這種cDNA合成的方法在cDNA文庫構(gòu)建中應(yīng)用極為普遍，其缺點(diǎn)主要是由于cDNA

38、末端存在較長的poly(A)而影響cDNA測序。隨機(jī)引物引導(dǎo)的cDNA合成是采用610個隨機(jī)堿基的寡核苷酸短片段來錨定mRNA并作為反轉(zhuǎn)錄的起點(diǎn)。由于隨機(jī)引物可能在一條mRNA鏈上有多個結(jié)合位點(diǎn)而從多個位點(diǎn)同時發(fā)生反轉(zhuǎn)錄，比較容易合成特長的mRNA分子的5端序列。隨機(jī)引物cDNA合成的方法由于難以合成完整的cDNA片段而不適合構(gòu)建cDNA文庫，一般用于克隆特定mRNA的5-末端，如RT-PCR和5-RACE(見第八章)。3cDNA第二鏈的合成cDNA第二鏈的合成就是將上一步形成的mRNA-cDNA雜合雙鏈變成互補(bǔ)雙鏈cDNA的過程。cDNA第二鏈合成的方法大致有四種，自身引導(dǎo)合成法，置換合成法

39、，引導(dǎo)合成法和引物銜接頭合成法。(1) 自身引導(dǎo)合成法自身引導(dǎo)法合成cDNA的第二鏈的過程見圖11-3，首先用氫氧化鈉消化雜合雙鏈中的mRNA鏈，解離的第一鏈cDNA的3-末端就會形成一個發(fā)夾環(huán)（發(fā)夾環(huán)的產(chǎn)生是第一鏈cDNA合成時的特性，原因至今未知，據(jù)推測可能是與帽子的特殊結(jié)構(gòu)相關(guān)），并引導(dǎo)DNA聚合酶復(fù)制出第二鏈，此時形成的雙鏈之間是連接在一起的，再利用S1核酸酶將連接處（僅該位點(diǎn)處為單鏈結(jié)構(gòu)）切斷形成平端結(jié)構(gòu)可以進(jìn)行連接。這樣的處理要求很高純度的S1核酸酶，否則容易導(dǎo)致雙鏈分子的降解從而喪失部分序列。1982年前，自身引導(dǎo)合成法是cDNA合成中的常用方法，但由于S1核酸酶的操作很難控制，

40、經(jīng)常導(dǎo)致cDNA的大量損失，現(xiàn)在已經(jīng)不常使用。圖11-3 自身引導(dǎo)法合成cDNA第二鏈（Sambrook et al.,1995）(2) 置換合成法置換合成法的過程見圖11-4，它是由一組酶共同控制，包括RNA酶H、大腸桿菌DNA聚合酶I和DNA連接酶。在mRNA-cDNA雜合雙鏈中，RNA酶H在mRNA鏈上切出很多切口，產(chǎn)生很多小片段，大腸桿菌DNA聚合酶I以這些小片段為引物合成第二鏈cDNA片段。這些cDNA片段進(jìn)而在DNA連接酶的作用下連接成一條鏈，即cDNA的第二鏈。遺留在5-末端的一段很小的mRNA也被大腸桿菌DNA聚合酶I的5®3核酸外切酶和RNA酶H降解，暴露出與第一鏈

41、cDNA對應(yīng)的3端部分序列。同時，大腸桿菌DNA聚合酶I的3 ®5核酸外切酶的活性可將暴露出的第一鏈cDNA的3端部分消化掉，形成平端或差不多的平端。這種方法合成的cDNA在5端存在幾個核甘酸缺失，但一般不影響編碼區(qū)的完整。圖11-4 置換合成法合成cDNA第二鏈（Sambrook et al.,1995）(3) 引導(dǎo)合成法引導(dǎo)合成法是Okayama和Berg提出的，其基本過程見圖11-5。首先制備一端帶有Poly(dG)的片段II和帶有Poly(dT)的載體片段I，并用片段I來代替Oligo(dT)進(jìn)行cDNA第一鏈的合成，在第一鏈cDNA合成后直接采用末端轉(zhuǎn)移酶在第一鏈cDNA的

42、3端加上一段Poly(dC)的尾巴，同時進(jìn)行酶切創(chuàng)造出一個粘性末端，與片段II一起形成環(huán)化體，這種環(huán)化了的雜合雙鏈在RNA酶H、大腸桿菌DNA聚合酶I和DNA連接酶的作用下合成與載體聯(lián)系在一起的雙鏈cDNA。其主要特點(diǎn)是合成全長cDNA的比例較高，但操作比較復(fù)雜，形成的cDNA克隆中都帶有一段Poly(dC)/(dA)，對重組子的復(fù)制和測序都不利。圖11-5置換合成法合成第二鏈cDNA原理示意圖 （Sambrook et al.,1995）(4) 引物銜接頭合成法引物銜接頭合成法是通過改進(jìn)引導(dǎo)合成法而來的。第一鏈合成后直接采用末端轉(zhuǎn)移酶（TdT）在第一鏈cDNA的3端加上一段Poly(dC)的

43、尾巴，然后用一段帶接頭序列的Poly(dG) 短核苷酸鏈作引物合成互補(bǔ)的cDNA鏈，接頭序列可以是適用于PCR擴(kuò)增的特異序列或用于方便克隆的酶切位點(diǎn)的序列。這一方法目前已經(jīng)發(fā)展成PCR法構(gòu)建cDNA文庫的常用方法。4. 雙鏈cDNA連接到質(zhì)?；蚴删w載體并導(dǎo)入大腸桿菌中繁殖雙鏈cDNA在和載體連接之前，要經(jīng)過一系列處理，如同聚物加尾、加接頭和分級分離。平端連接的效率低，加尾和加接頭主要為了提高連接效率，其中添加攜帶有酶切位點(diǎn)的接頭是最為常用的方法。一種方式是添加單酶切位點(diǎn)接頭，其在第一鏈合成時不引入接頭，而直接在第二鏈上通過平端連接導(dǎo)入接頭，當(dāng)導(dǎo)入的粘端接頭已經(jīng)去磷酸化，則可以在分級分離后直接

44、用于連接；當(dāng)導(dǎo)入的粘端接頭帶有活性磷酸基團(tuán)時，所加接頭需選擇甲基化敏感的酶且加接頭之前必須對雙鏈cDNA進(jìn)行甲基化處理而保護(hù)其不受限制酶切割，加上接頭后再用該酶進(jìn)行消化，創(chuàng)造用于連接的粘端。另一種方式是雙酶切連接的策略，一般在第一鏈合成時在cDNA的5端引入一稀有酶切位點(diǎn)，如NotI，在雙鏈cDNA平端連接上帶去磷酸化粘端的接頭，如SalI，然后用NotI酶切創(chuàng)造出另一端的粘端，這樣可以與對應(yīng)雙酶切載體連接。同時，雙酶切連接可以對插入的cDNA具有定向的作用。雙鏈cDNA在連接之前最好經(jīng)過cDNA分級分離，回收大于500 bp的cDNA用于連接。在未處理的雙鏈cDNA中，有很多小于500 bp

45、的分子，包括合成用的引物、接頭以及反轉(zhuǎn)錄過程中產(chǎn)生的各種不完整的cDNA產(chǎn)物，這些組分都會影響cDNA文庫的質(zhì)量，如造成很多假陽性的重組子、重組子的插入片段太小。分級分離最簡單的、應(yīng)用最廣的是層析柱法，它可以方便快速的去除組分中小于500 bp的分子，提高文庫的質(zhì)量。cDNA文庫的載體選擇和基因組DNA文庫有些類似，只是不用考慮外源片段的長度，因?yàn)橐话鉩DNA的長度范圍多在0.58 kb之間，常用的質(zhì)粒載體或噬菌體類載體都能滿足要求。一般而言，用噬菌體載體構(gòu)建的cDNA文庫與質(zhì)粒載體構(gòu)建的庫相比有篩選方便的一些優(yōu)點(diǎn)，包括單個平皿內(nèi)的可以鋪展的重組子數(shù)目更多，復(fù)制用于雜交的膜方便快捷，雜交背景低

46、等。但使用質(zhì)粒載體構(gòu)建的文庫在后續(xù)操作上更加方便且用途更廣。三、cDNA文庫均一化處理構(gòu)建均一化cDNA文庫主要有兩條途徑，即基因組DNA飽和雜交法和基于復(fù)性動力學(xué)原理的均一化方法。1基因組DNA飽和雜交法進(jìn)行cDNA均一化盡管細(xì)胞內(nèi)mRNA的豐度差異很大，但是編碼這些mRNA的基因在基因組中對應(yīng)的拷貝數(shù)卻不存在差異或差異很?。O少數(shù)在基因組中存在很高拷貝的基因除外）。利用不同表達(dá)水平的基因?qū)?yīng)的基因組拷貝數(shù)相對一致的特點(diǎn)，可以對cDNA文庫進(jìn)行均一化。用該種方法構(gòu)建均一化cDNA文庫包含三個部分。首先，將基因組DNA消化固定，消化后的基因組DNA為相對較短的單鏈且最大可能地覆蓋基因組；然后，

47、分離純化獨(dú)立cDNA文庫的混合質(zhì)粒；最后，文庫DNA與固定的基因組DNA充分飽和雜交，固定住相應(yīng)的cDNA，并將它洗脫重新轉(zhuǎn)化建庫。理論上，通過cDNA與基因組DNA的飽和雜交，基因組DNA上結(jié)合的cDNA克隆的數(shù)目是一致的，這樣，洗脫下這些固定的克隆重新轉(zhuǎn)化，它們在文庫中出現(xiàn)的頻率基本相近。該法應(yīng)用起來非常簡單，且沒有儀器上的限制，應(yīng)用該法構(gòu)建的水稻品種明恢63全生育期的均一化文庫可以顯示最后殘留的在文庫中的高拷貝克隆在基因組上也對應(yīng)有多個拷貝，對數(shù)以萬計的克隆測序表明，出現(xiàn)頻率最高的克隆也低于1，具有很高的均一化效果。應(yīng)用該法也有不利的地方，一是由于基因組DNA相對很復(fù)雜，很難獲得覆蓋基因

48、組的單鏈DNA片段，當(dāng)其不能覆蓋全基因組時，就會導(dǎo)致文庫內(nèi)基因的丟失。采用不同的限制性內(nèi)切酶消化基因組DNA，構(gòu)建兩個獨(dú)立、互補(bǔ)的均一化文庫可以一定程度地彌補(bǔ)上述不足。二是在基因組DNA與文庫DNA雜交的過程中，文庫DNA自身雜交的速度會很快，可以通過將文庫DNA制備成單鏈后雜交效果會更好。2基于復(fù)性動力學(xué)原理的均一化方法當(dāng)雙鏈DNA在加熱變性后再讓其復(fù)性，其形成雙鏈的速率遵循二次復(fù)性動力學(xué)原理（second-order kinetics），即與組分中的單鏈DNA的濃度相關(guān)，用公式表示就是dC/dt=kC2，其中C（moles of dNTPs/liter）是指在時間t時單鏈DNA的濃度，t

49、(seconds)表示在復(fù)性條件下所花的時間，k（liter/moles-seconds）是復(fù)性速率的常量。將該公式在C0 at t=0和C at t=t之間整合可以得到：C/C0=1/(1+k C0 t)式中，C0表示總的DNA濃度，C/C0表示體系中單鏈DNA在時間t所占的比例。當(dāng)復(fù)性至一半時，即C/C0=1/2，t=t1/2可得1/2=1/(1+ k C0 t1/2) 或 C0 t1/2=1/ k。也就是說，復(fù)性速率常量k與C0 t成倒數(shù)關(guān)系，即濃度越小，復(fù)性所需的時間越長。cDNA文庫中高豐度的cDNA在退火條件下復(fù)性的所需的時間較短，低豐度的cDNA復(fù)性所需的時間較長，通過控制復(fù)性時

50、間可使造成高豐度cDNA成雙鏈狀態(tài)而低豐度的cDNA仍保持單鏈狀態(tài)，利用羥基磷灰石柱很容易將單雙鏈分開。與基因組飽和雜交的方法相比，基于復(fù)性動力學(xué)原理的方法有兩個主要優(yōu)點(diǎn)，一是幾乎不會導(dǎo)致起始文庫中cDNA的丟失，二是均一化的效果更為明顯。但不利之處在于操作更為復(fù)雜，第一種方法成功率很高，而后一種方法由于參數(shù)控制上存在的很多因素，對于初學(xué)者而言可能需要多次的嘗試與摸索方能成功。目前，基于這兩種原理的均一化處理方法應(yīng)用非常廣泛，來自數(shù)據(jù)庫中的EST序列越來越多的來自均一化文庫，但相比較而言后一種方法豐富的程度更廣，在方法和技術(shù)的革新上進(jìn)展快速。四、扣除雜交cDNA文庫在某些情況下，目標(biāo)基因是特有

51、的基因或一定環(huán)境下特異表達(dá)的基因。這些基因的整個mRNA表達(dá)量很少，篩選起來很難。因此普通的cDNA文庫或均一化文庫由于包含了大量的非目標(biāo)序列就不是首選的策略了?？鄢s交文庫是在扣除雜交基礎(chǔ)上構(gòu)建的cDNA文庫?？鄢s交技術(shù)（subtractive hybridization）是將含目標(biāo)基因的組織或器官的mRNA群體作為待測樣本(Tester)，將基因表達(dá)譜相似或相近但不含目標(biāo)基因的組織或器官的mRMA群體作為對照樣本(Driver)，將Tester和Driver的cDNA進(jìn)行多次雜交，去掉在二者之間都表達(dá)的基因，而保留二者之間差異表達(dá)的基因。通過多次雜交從而使差異表達(dá)的基因得以保留，使低豐度

52、表達(dá)的基因在文庫中的比例大大提高，使篩選到差異表達(dá)基因的可能性大大提高。現(xiàn)在，廣泛應(yīng)用的扣除cDNA文庫技術(shù)有兩種。1抑制性扣除雜交抑制性扣除雜交（suppression subtractive hybridization, SSH）方法已開發(fā)出商業(yè)化的試劑盒，即PCR Select cDNA Subtraction Kit。其原理見圖11-6，首先，被研究的帶有差異表達(dá)部分的cDNA稱為“供體(tester)”，作為對照的不帶有差異表達(dá)的部分cDNA成為“驅(qū)動(Driver)”，它們是由其對應(yīng)的mRNA組分在體外獨(dú)立合成的，同時利用識別四個堿基的限制性核酸內(nèi)切酶RsaI將這些cDNA消化成平

53、末端的小片段。將“Tester”一分為二，分別加上兩種不同的接頭（Adapter1和Adapter2R，其序列和組成見圖11-6A）。由于接頭是去磷酸化的，所以只有長鏈才可以與cDNA的5端連接成功。在第一輪雜交中，用過量的Driver cDNA分別與帶兩種不同接頭的Tester雜交，在兩個獨(dú)立的雜交體系中，Tester 與Driver cDNA就會形成等四種類型的cDNA片段（如圖所示的a、b、c、d）。其中(a)代表Tester中既沒有與Tester雜交，又沒有與Driver雜交的cDNA分子，這些cDNA一般濃度很低，不能和與自己的互補(bǔ)鏈雜交；(b)代表Tester中自身雜交的cDNA分

54、子；(c)代表Tester和Driver中共同表達(dá)的基因雜交形成的雙鏈cDNA分子；(d)代表Driver中自身雜交和不能與自身或Tester雜交的cDNA分子，如同Tester的(a)和(b)。整個雜交（復(fù)性）過程遵循復(fù)性動力學(xué)原理，由于Driver濃度遠(yuǎn)大于Tester的量，Tester中與Driver同源的cDNA理論上全部形成了類型(c)，而(a)中所聚集的主要是差異表達(dá)的基因。然后進(jìn)行第二輪雜交，即將第一輪雜交的兩個體系混合，再加入過量的Driver cDNA，進(jìn)行第二輪雜交。雜交的結(jié)果會進(jìn)一步形成(a)、(b)、(c)和(d)，同時帶不同接頭的（a）會復(fù)性形成新類型（e）。將第二輪

55、雜交的產(chǎn)物進(jìn)行末端補(bǔ)平，再進(jìn)行兩輪PCR擴(kuò)增。在PCR擴(kuò)增過程中，由于(a)和(d)沒有引物結(jié)合位點(diǎn)而不能被擴(kuò)增；由于(b)的兩端帶有相同的接頭序列，大多數(shù)的(b)會形成鍋柄結(jié)構(gòu)而不能進(jìn)行指數(shù)擴(kuò)增；(c)只有一個引物結(jié)合位點(diǎn)，只能被線性擴(kuò)增。只有(e)帶有兩個不同的引物接頭，可以進(jìn)行指數(shù)擴(kuò)增。只有(e)是均一化的、差異表達(dá)的基因。接著用巢式引物進(jìn)行第二輪PCR，降低PCR產(chǎn)物的背景，富集差異表達(dá)的基因。最后，將第二輪PCR產(chǎn)物用T/A克隆載體進(jìn)行克隆，構(gòu)建扣除雜交cDNA文庫。(a)(b)圖11-6 抑制性扣除雜交文庫的構(gòu)建原理(a) 引物以及接頭；(b) 扣除文庫的構(gòu)建流程圖2mRNA-cD

56、NA雜交mRNA-cDNA雜交方法的原理是用過量的Driver mRMA與“Tester”的cDNA文庫質(zhì)粒反復(fù)多輪雜交，去除Driver和Tester共同表達(dá)的基因，構(gòu)建均一化的、扣除雜交cDNA文庫。其實(shí)驗(yàn)原理如圖11-7所示。先用多克隆位點(diǎn)順序相反的質(zhì)粒載體分別構(gòu)建Tester和Driver的cDNA文庫（圖中pSport1和pSport2為多克隆位點(diǎn)順序相反的質(zhì)粒載體，類似的還有pUC18和pUC19）；然后提取Tester cDNA文庫的混合單鏈質(zhì)粒；同時提取“Driver” cDNA文庫的質(zhì)粒，利用生物素標(biāo)記的引物和T7 DNA聚合酶（或SP6 DNA聚合酶），以Driver cD

57、NA文庫的混合質(zhì)粒為模板在體外轉(zhuǎn)錄出對應(yīng)的mRNA，這些mRNA的末端都是生物素標(biāo)記的。然后，將過量的來自“Driver”的mRNA與“Tester”cDNA的單鏈質(zhì)粒雜交，二者共同表達(dá)的基因通過雜交形成cDNAmRNA雜合子，進(jìn)而可以通過結(jié)合了生物素抗體的磁珠將雜合子去除，保留Tester中特異表達(dá)的、沒有雜交的單鏈DNA。經(jīng)過如此多輪雜交，盡可能多地去除Driver和Tester中共同表達(dá)的基因，富集“Tester”中特異表達(dá)的cDNA。最后，將沒有雜交的單鏈質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌即得到扣除雜交的cDNA文庫。圖11-7基于mRNA-cDNA雜交法構(gòu)建扣除cDNA文庫對于上述提及的兩種扣除文庫的

58、構(gòu)建方法，從操作看來，抑制性扣除雜交系統(tǒng)主要依賴PCR反應(yīng)過程，不涉及到體外反轉(zhuǎn)錄和純化的過程，操作起來相對簡單，而且已經(jīng)有成品的試劑盒。但從原理分析，該系統(tǒng)相對比較復(fù)雜，尤其雜交的過程非常靈敏，稍不注意就會導(dǎo)致構(gòu)建的差異文庫中出現(xiàn)大量的“假陽性”克?。ㄖ高@些克隆其實(shí)不是差異表達(dá)基因的克隆），而后一種方法可以通過多次的雜交來克服這一缺點(diǎn)。另外，運(yùn)用前一個系統(tǒng)構(gòu)建的扣除文庫中的cDNA為打斷了的片段，一般比較短，在2 kb以下，而后一種方法獲得cDNA相對比較完整。五、全長cDNA文庫 全長cDNA在基因克隆和基因功能定性研究中有很重要的作用，但用置換合成法、引導(dǎo)合成法以及引物銜接頭法構(gòu)建的cDNA文庫中，全長cDNA克隆的比例比較低，因此提高cDNA文庫中全長cDNA比例即構(gòu)建全長cDNA文庫（Full-length cDNA Library）就顯得非常重要。 導(dǎo)致克隆的cDNA不完整有多方面的原因，cDNA第二鏈合成過程中聚合酶的核酸外切酶活性是一個重要原因。此外，至少還有兩種因素，第一是mRNA的降解。mRNA很容易從5端開始降解，涉及的因素有很多，包括起始的生物材料，抽提