乳酸菌實驗報告

1、乳酸菌的分離與培養(yǎng)保加利亞乳桿菌組長：王小英組員：王小英鄭春玲闕小琴柳潔實驗?zāi)康模?.學習并掌握普通光學顯微鏡油鏡的使用技術(shù)及微生物形態(tài)觀察；2. 學習微生物制片、染色的基本技術(shù)，掌握乳酸菌的簡單染色法及無菌操作接種技術(shù)；3. 通過對培養(yǎng)基的配制， 了解配制培養(yǎng)基的一般步驟和方法， 掌握微生物實驗常用的器皿的清洗與包扎、培養(yǎng)基的制備、消毒滅菌。4. 了解各種滅菌的基本原理和應(yīng)用范圍，以及實驗室中常用的滅菌方法。5. 了解酸奶中乳酸菌分離原理 , 觀察乳酸菌的基本形態(tài) ,掌握用顯微鏡測微尺測量微生物細胞大小、數(shù)目的測定的方法。6. 了解稀釋平板計數(shù)的原理，熟練掌握混合平板培養(yǎng)法。明確顯微鏡計數(shù)的

2、原理并學習使用血球計數(shù)板進行微生物計數(shù)的方法。7 初步學會乳酸菌培養(yǎng)的基本技術(shù)，了解并掌握細菌鑒定中常用生理生化反應(yīng)的原理和方法，掌握進行微生物大分子水解試驗的原理和方法。8. 了解并掌握微生物菌種保藏的常用方法及其優(yōu)缺點，并了解不同微生物對不同的生物大分子的分解利用情況，認識微生物代謝類型的多樣性。實驗原理：乳酸菌指發(fā)酵糖類主要產(chǎn)物為乳酸的一類無芽孢、革蘭氏染色陽性細菌的總稱，本實驗中用革蘭氏染色法進行染色，革蘭氏染色法是根據(jù)細菌細胞壁成分不同,脫色效果不同從而可以將細菌區(qū)分為 G+ 和 G- 菌。通過革蘭氏染色以及形態(tài)學觀察，乳酸菌呈紫色，為革蘭氏陽性菌；乳酸菌應(yīng)為乳桿菌和乳球菌的混合體。

3、酸奶中含有乳酸菌，而且目前市場上銷售的酸奶中通常含有雙歧桿菌、嗜酸乳桿菌、嗜熱鏈球菌、保加利亞乳桿菌四種菌。細菌及其它一些微生物的大小，通常用測微計來測量，測微計分接目測微計與鏡臺測微計；培養(yǎng)基是按照微生物生長發(fā)育的需要，用不同組份的營養(yǎng)物質(zhì)調(diào)制而成的營養(yǎng)基質(zhì)；滅菌是用物理或化學的方法來殺死或除去物品上或環(huán)境中的所有微生物，包括芽孢；自然條件下，微生物常以群落狀態(tài)存在，這種群落往往是不同種類微生物的混合體，為了研究某種微生物的特性或者要大量培養(yǎng)或者使用某種微生物，必須從這些混雜的微生物群落中獲得純培養(yǎng)，這些獲得純培養(yǎng)的方法稱為微生物的分離和純化。用生化試驗的方法檢測細菌對各種基質(zhì)的代謝作用及其

4、代謝產(chǎn)物，從而鑒別細菌的種屬，稱之為細菌的生化反應(yīng)。實驗器材：樣品：含乳酸菌的酸奶培養(yǎng)基：改良MRS 固體培養(yǎng)基蛋白胨5g牛肉膏5g酵母提取物2.5g檸檬酸二銨 1g水 500mL乙酸鈉 2.5gK2HPO41gMnSO 4· 4H2O0.125吐溫 800.5mL瓊脂12.5gMgSO 4· 7H2O0.29gCaCO35g葡萄糖 10g。儀器用品：500ml燒杯一個100ml量筒一個無菌培養(yǎng)皿 12個250ml容量三角瓶2 個5ml 無菌移液管1ml 無菌移液管6 只15ml 試管 7只高壓滅菌鍋天平1水浴鍋一個玻棒一根旋渦均勻器一臺鏡臺測微尺電磁爐一個棉花紗布目鏡測微

5、尺牛皮紙麻繩接種環(huán)一個蓋玻片酒精燈一盞牛角匙pH 試紙血球計數(shù)板載玻片若干恒溫培養(yǎng)箱酸度計擦鏡紙、吸水紙液體石蠟顯微鏡載玻片玻片架、洗瓶、酒精燈火柴、滴管藥品：結(jié)晶紫，乙醇，草酸銨，碘，碘化鉀，番紅，KOH ， NaCl ， 10 NaOH ，2% 氯化鐵。藥品配制結(jié)晶紫 ：結(jié)晶紫乙醇飽和液（結(jié)晶紫2g 溶于 20ml 95%乙醇中） 20ml ， 1g草酸銨于蒸餾水 100ml 。將兩液混勻即成。盧戈氏碘液 ：碘 1g，碘化鉀2g，蒸餾水 300ml 。先將碘化鉀溶于少量蒸餾水中，然后加入碘使之完全溶解，再加入蒸餾水300ml 即成。蕃紅溶液 ：番紅2.5g ， 95% 乙醇 100ml ，

6、溶解后存于密閉的棕色瓶中。用時取10ml與 80ml 蒸餾水混勻即可。0.1% 的呂氏美藍染液 ：A 液：美藍0.3g ，95% 乙醇 300ml ；B 液： 0.01% KOH 100ml?；旌?A和B液即成，按 1 ：100 稀釋即可。生理鹽水 ：稱取0.9 克氯化鈉，溶解在少量蒸餾水中，稀釋到100 毫升。實驗步驟：一、培養(yǎng)基的培養(yǎng)1稱量用天平稱取蛋白胨1g,牛肉膏1g , 酵母提取物0.5g, 檸檬酸二銨0.2g, 乙酸鈉0.5g,K2HPO40.2g,MnSO 4· 4H2O0.025g,MgSO 4· 7H2O0.06g, 葡萄糖 2g ,吐溫 800.1mL,

7、CaCO31g 放入燒杯。2溶解向上述燒杯中加入蒸餾水50 mL 無菌水，用玻璃棒攪勻后，放到酒精燈上加熱, 在石棉網(wǎng)上加熱溶解后 ,加入 2.5g 瓊脂，并繼續(xù)用微火加熱。 在瓊脂溶化的過程中，要控制火力的大小， 并且不斷攪拌，以免培養(yǎng)基溢出或燒焦。待瓊脂完全溶化后，補加蒸餾水至100mL 。3調(diào)節(jié) pH 用滴管逐滴滴入1mol/L 的 NaOH 溶液，邊滴邊攪拌，并隨時用精密的pH 試紙測 pH，直到pH 到 6.8 左右。4過濾要趁熱用四層紗布過濾5培養(yǎng)基的分裝將培養(yǎng)基趁熱分裝到2 個三角瓶里 (一半為宜 )。注意：分裝時不要將培養(yǎng)基沾在管口和試管上段，以免引起污染。6加棉塞培養(yǎng)基分裝完

8、畢以后，在管口上加一個棉塞。棉塞能防止雜菌污染，保證通氣良好。加棉塞時，應(yīng)使棉塞長度的 2/3 在試管口內(nèi)。7包扎 在管口外面包上一層牛皮紙，然后，用線繩扎好。在每捆試管外掛上標簽，注明培養(yǎng)基名稱、配制日期和制作者姓名二、滅菌1打開高壓蒸汽滅菌鍋，將里面的滅菌桶取出，向鍋內(nèi)加水(最好用開水 )，水面與底架平齊為宜（直至高水位燈亮起） 。2將扎好的試管管口向上豎放在滅菌桶內(nèi)，再將滅菌桶放回滅菌鍋。（注意：滅菌桶內(nèi)的物品不能放得2太擠，否則會影響滅菌效果）。3加蓋，并將排氣軟管插入滅菌桶的排氣槽內(nèi)。（以兩兩對稱的方式，同時旋緊相對的兩個緊固螺栓，以防漏氣）同時關(guān)閉滅菌鍋上方的安全閥，打開排氣閥，使

9、水沸騰時得以排除鍋內(nèi)的冷空氣。4設(shè)置滅菌溫度和時間。溫度為121,20 分鐘滅菌5排出鍋內(nèi)的冷空氣， 關(guān)上排氣閥， 讓鍋內(nèi)的溫度隨蒸汽壓力增加而逐漸上升，當鍋內(nèi)的壓力上升到98kPa時，控制火力大小，使壓力維持在98kPa 左右 20min 。6滅菌所需時間到后，切斷電源，讓滅菌鍋內(nèi)溫度自然下降，當壓力表的壓力將至0 時，打開排氣閥，旋開蓋子，取出滅菌物品。三、無菌檢查將取出的滅菌培養(yǎng)基放入37 溫箱保溫培養(yǎng)24 小時，經(jīng)檢查若無雜菌生長，即可待用。四、菌懸液的配制先將酸奶樣品攪拌均勻，用無菌移液管吸取樣品10ml 加入盛有 90ml無菌水的三角瓶中，在旋渦均勻器上充分振搖 20分鐘，使樣品均

10、勻分散。用一支1ml 無菌吸管從中吸取1ml酸奶懸液注入9ml 無菌水的試管中，吹息三次，使充分混勻。然后再用一支1ml 無菌吸管從此試管中吸取1ml 注入另一盛有 9ml 無菌水的試管中，以此類推制成10-1 、10-2 、 10-3 、10-4 、 10-5 、 10-6、 10-7各種稀釋度的菌懸液（要取7 只 15ml 試管）。五、倒平板取無菌平板 12個，編號標明10-1 、10-5 、10-6 、10-7 各三套；將經(jīng)高溫消毒的培養(yǎng)基冷卻到50 左右，按無菌操作法倒12 只平板，每皿約 15ml ；平置使培養(yǎng)基均勻分布在皿底，待凝固。六、分離方法A涂布平板法用三支 1ml 無菌吸管

11、分別吸取10-5 、10-6 和 10-7 的稀釋菌懸液各1ml ，對號接種于與之對應(yīng)的3 個無菌平板中，每個平皿放0.2ml ；盡快用無菌玻璃涂棒將菌液在平板上涂布均勻，平放與試驗臺上20 Min ；然后倒置于40 恒溫箱中培養(yǎng)48 小時。B 平板劃線1、劃線在近火焰處，左手拿皿底，右手拿接種環(huán)，按無菌操作對標有 10-的 3 個平板進行劃操作。常用的劃線方法有;(a)用接種環(huán)以無菌操作挑取菌液一環(huán)，先在平板培養(yǎng)基的一邊作第一次平行劃線3-4條，再轉(zhuǎn)動培養(yǎng)皿約 70 °角，并將接種環(huán)上剩余物燒掉，待冷卻后通過第一次劃線部分做第二次平行劃線，再用同法通過第二次平行劃線部分做第三次平行

12、劃線和通過第三次平行劃線部分作第四次平行劃線。劃線完畢后，蓋上皿蓋，倒置于放在40恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 小時。（ b ）將挑取有樣品的接種環(huán)在平板培養(yǎng)基上作連續(xù)劃線。劃線完畢后，蓋上皿蓋，倒置于放在40 恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 小時。C稀釋混合平板法先分別吸取 1ml 的 10-5 、 10-6 、10-7 稀釋度的菌懸液對號放入平板中，然后再倒入經(jīng)高溫消毒的并冷卻到 50 左右培養(yǎng)基中，邊倒入邊搖勻，使樣品中的微生物與培養(yǎng)基混合均勻，到冷凝成平板后，倒置于 40 恒溫箱中培養(yǎng) 48 小時。七、菌落特征的觀察恒溫培養(yǎng) 48 小時過后，取出培養(yǎng)平板；選擇菌落分布較好的平板，先對其菌落形態(tài)（如菌落的

13、大小、表面狀況、透明度、色澤、邊緣、隆起度、透光性、是否分泌色素等特點）進行觀察，初步找出乳酸菌菌落。乳酸菌的菌落很小，大約 13 mm ，園形隆起，表面光滑或稍粗糙，呈乳白色、灰白色或暗黃色；在產(chǎn)酸菌落周圍還能產(chǎn)生 CaCO3 的溶解圈。八、乳酸菌的形態(tài)觀察及保加利亞乳桿菌的形態(tài)觀察（一）普通光學顯微鏡的使用31.取鏡從顯微鏡箱中取出顯微鏡時，用一手握鏡臂，一手托鏡座，直立移動，輕放在平穩(wěn)的實驗臺上，使用前首先要熟悉顯微鏡的結(jié)構(gòu)和性能，檢查各部零件是否齊全，鏡頭是否清潔，做好必要地清潔和調(diào)整工作。2.調(diào)節(jié)光照1)用粗調(diào)節(jié)器提升鏡筒，將低倍物鏡旋到鏡筒下方，使鏡頭和載物臺距離約為5mm 左右。

14、2)上升聚光器，使之與載物臺表面相距1 毫米左右。3) 插上電源，開開電源開關(guān)。左眼看目鏡調(diào)節(jié)反光鏡鏡面角度（在天然的光線下觀察，一般用平面反鏡；若以燈光為光源，則一般多用凹面反光鏡）。4) 開閉光圈，調(diào)節(jié)光線強弱，直至視野內(nèi)得到最均勻最適宜的光度為止。3.低倍鏡觀察1) 將載片標本（涂面朝上）置于載物臺的標本夾上，并將標本部位處于物鏡的正下方，轉(zhuǎn)動粗調(diào)節(jié)器，使鏡頭下降至鏡面距離檢視物大約5mm 處。2) 然后以左眼看目鏡，另一眼睜開，一邊觀察視野，一邊扭動粗調(diào)節(jié)器使鏡頭緩慢地升高，至視野內(nèi)出現(xiàn)物像后，改用細調(diào)節(jié)器上下微微轉(zhuǎn)動，仔細調(diào)節(jié)焦距和照明，直至視野內(nèi)獲得清晰的物像，選擇適宜部位，移到視

15、野中心。3) 移動推動器，換高倍鏡觀察。4.高倍鏡觀察將高倍物鏡轉(zhuǎn)至鏡筒下方，調(diào)節(jié)光圈和聚光鏡，使光線亮度適中，再仔細反復(fù)轉(zhuǎn)動微調(diào)螺旋，調(diào)節(jié)焦距，獲得清晰物象，再移動推動器選擇最滿意的鏡檢部位將染色標本移至視野中央，待油鏡觀察。5.油鏡觀察1)先用粗調(diào)節(jié)旋鈕將鏡筒提升（或?qū)⑤d物臺下降）約2cm ，轉(zhuǎn)動轉(zhuǎn)換器將油鏡轉(zhuǎn)至鏡筒正下方。在玻片標本的鏡檢部位滴上一滴香柏油。從側(cè)面注視，用粗調(diào)節(jié)旋鈕將載物臺緩緩地上升，使油浸物鏡浸入香柏油中，使鏡頭幾乎與標本接觸。2) 左眼看目鏡，右手反時針方向微微轉(zhuǎn)動粗調(diào)螺旋，下將載物臺，當視野中有模糊地標本物象時，改用細調(diào)螺旋，并移動標本直至標本物象清晰為止。3) 觀

16、察完畢，下降載物臺，將油鏡頭轉(zhuǎn)出，先用擦鏡紙擦去鏡頭上的油，再用擦擦鏡紙蘸少許二甲苯或乙醚酒精混合液（乙醚2 份，純酒精3 份），擦去鏡頭上殘留油跡，最后再用擦鏡紙擦拭23 下即可，（注意向一個方向擦拭）。4) 將各部分還原：下降載物臺最低處；轉(zhuǎn)動物鏡轉(zhuǎn)換器，使物鏡鏡頭轉(zhuǎn)成八字形，再向下旋轉(zhuǎn)至最低處；將調(diào)節(jié)光源亮度的旋鈕最小化；關(guān)掉電源；用柔軟紗布清潔載物臺等機械部分，放好顯微鏡，蓋上罩。（如果是自然采光顯微鏡，降下聚光器，反光鏡與聚光器垂直）。6.換片另換新的標本片，必須從第三條開始操作。7.用后必須清潔、復(fù)原觀察完畢，上旋鏡筒，先用擦鏡紙擦去鏡頭上的油，然后再用擦鏡紙沾取少許二甲苯（香柏油

17、溶于二甲苯）擦去鏡頭上的殘留油跡，最后再用擦鏡紙擦去殘留的二甲苯。機械部件用細軟布擦去灰塵和冷凝水，下降鏡筒，將接物鏡轉(zhuǎn)成八字形置于載物臺上。下降聚光鏡，（切勿使接物鏡與聚光鏡相碰受損），反光鏡垂直于鏡座。放進顯微鏡箱中鎖好，并放入指定的面微鏡柜中。（二） 鏡檢（革蘭氏染色方法）1.涂片取干凈載玻片一塊，在載玻片中央加一滴蒸餾水，將培養(yǎng)的乳酸菌作涂片（注意涂片切不可過于濃厚），干燥、固定。固定時通過火焰1 2 次即可，不可過熱，以載玻片不燙手為宜。2.染色(1) 初染 加草酸銨結(jié)晶紫染色液一滴，約1 一 2 分鐘，傾去染色液，用自來水小心地沖洗。(2) 媒染滴加盧哥氏碘液沖去殘水，并覆蓋約1

18、一 2 分鐘，水洗。(3) 脫色 將載玻片上面的水甩凈，并襯以白背景，用 95 酒精滴洗至流出酒精剛剛不出現(xiàn)紫色時為止，約 20 30 秒鐘，立即用水沖凈酒精，以終止脫色。4(4) 復(fù)染 滴加番紅液，染色 2 3 分鐘，水洗。最后用吸水紙輕輕吸干。(5) 鏡檢 干燥后，置油鏡觀察。革蘭氏陰性菌呈紅色，革蘭氏陽性菌呈紫色。以分散開的乳酸菌的革蘭氏染色反應(yīng)為準，過于密集的細菌，常常呈假陽性。其中保加利亞乳桿菌呈桿狀，成單桿、或雙桿菌或長絲狀；嗜熱鏈球菌，呈球狀，成對、或短鏈、或長鏈狀。十、保加利亞乳桿菌的細胞大小測定1、目鏡測微尺的校正把目鏡的上透鏡旋下，將目鏡測微尺的刻度朝下輕輕地裝入目鏡的隔板

19、上，把鏡臺測微尺置于載物臺上，刻度朝上。先用低倍鏡觀察，對準焦距，視野中看清鏡臺測微尺的刻度后，轉(zhuǎn)動目鏡，使目鏡測微尺與鏡臺測微尺的刻度平行，移動推動器，使兩尺重疊，再使兩尺的 “0刻”度完全重合，定位后，仔細尋找兩尺第二個完全重合的刻度，計數(shù)兩重合刻度之間目鏡測微尺的格數(shù)和鏡臺測微尺的格數(shù)。因為鏡臺測微尺的刻度每格長 l0 m，所以由下列公式可以算出目鏡測微尺每格所代表的長度。例如目鏡測微尺5 小格正好與鏡臺測微尺5 小格重疊，已知鏡臺測微尺每小格為l0 m，則目鏡測微尺上每小格長度為 =5×10m/5 10m2、菌體大小的測定取下鏡臺測微尺，將保加利亞乳桿菌染色標本片置于載物臺上

20、，先在低倍鏡和高倍鏡下找到目的物。然后在高倍鏡下轉(zhuǎn)動目鏡測微尺，測出保加利亞乳桿菌的長和寬各占幾格（不足一格的部分估計到小數(shù)點后一位），測出的格數(shù)乘上目鏡測微尺每格的長度，即等于該菌的大小。同法在油鏡下轉(zhuǎn)動目鏡測微尺測出保加利亞乳桿菌的長和寬各占幾格（不足一格的部分估計到小數(shù)點后一位），測出的格數(shù)乘上目鏡測微尺每格的長度，即等于該菌的大小。例如目鏡測微尺在顯微鏡下經(jīng)過校正，當使用油鏡時，每格相當于1.3 m。如果測量菌體的長度相當于目鏡測微尺的兩格，則菌體長度應(yīng)為1.3 m×2 = 2.6m。一般測定微生物細胞大小時，通常測量10 20 個菌體左右，求出平均值，才能代表該菌的大小。用

21、最大和最小的數(shù)值來表示菌體大小的范圍。例如長為35m，寬為 12m，則其大小為l2 ×35m。3 、取出目鏡測微尺 ，將接目鏡放回鏡筒，再將目鏡測微尺和鏡臺測微尺分別再用擦鏡紙擦拭后，放回盒內(nèi)保存。（二）血球計數(shù)板在顯微鏡下直接計數(shù)保加利亞乳桿菌的數(shù)量如圖 -血球計數(shù)板構(gòu)造上：俯視圖（中間平臺分為兩半，各刻有一個方格網(wǎng)）下：側(cè)面圖（中間平臺與蓋玻片之間有高度為0.1mm 的間隙）5血球計數(shù)板通常是一塊特制的厚載玻片，載玻片上有四條槽而構(gòu)成三個平臺（圖5-2 ）。中間的平臺較寬，其中間又被一短橫槽而隔成兩半，每個半邊上面各刻有一個方格網(wǎng)。每個方格網(wǎng)共分9 大格其中間的 1 大格又稱為計

22、數(shù)室，微生物的計數(shù)就在此大格中進行。常用的血球計數(shù)板的計數(shù)室有兩種規(guī)格的刻度網(wǎng)格。一種是一個大方格分成16 個中方格，而每個中方格又分成25 個小方格，即為16×25 。另一種是一個大方格分成25 個中方格而每個中方格又分成16 個小方格，即25×16 。但是不管計數(shù)室是哪種規(guī)格，其計數(shù)室的小格數(shù)總是相同的，即16×25= 25 ×16= 400 （小格），見下圖。圖 -計數(shù)網(wǎng)的區(qū)分與分格每一個大方格邊長為lmm 、則每一大方格面積為lmm2 。蓋上蓋玻片后， 載玻片計數(shù)室與蓋被片之間的高度為0.1mm，所以每個計數(shù)室（大方格）的體積為0.1mm3。在計

23、數(shù)時，通常數(shù)5 個中方格的總菌數(shù)，求得平均值。 再乘上 16 或 25 就得一大方格中的總菌數(shù)。然后再換算成1mL 菌液中的總菌數(shù)。 （1mL= 1cm3 = 1 000mm3 ）操作步驟 如下：1、取培養(yǎng)后的保加利亞乳桿菌液振蕩混勻，加無菌水適當稀釋（斜面一般稀釋到10-2）。稀釋度選擇以小方格中的分布的菌體清晰可數(shù)為宜。一般以每小格內(nèi)含45 個菌體的稀釋度為宜。2. 取清潔無油的血球計數(shù)板，在計數(shù)室上面加蓋玻片。3.將保加利亞乳桿菌液搖勻，用滴管吸取少許，從計數(shù)板中間平臺兩側(cè)的溝槽內(nèi)沿蓋玻片的下邊緣滴入一小滴（不宜過多），使菌液沿兩玻片間自行滲入計數(shù)室，勿使產(chǎn)生氣泡，并用吸水紙吸去溝槽中流

24、出的多余菌液。也可以將菌液直接滴加在計數(shù)室上，然后加蓋蓋玻片（勿使產(chǎn)生氣泡）。4. 靜置 5min 后，將血球計數(shù)板置于顯微鏡載物臺上，先用低倍鏡找到計數(shù)板的大方格網(wǎng)位置。尋找時光圈要縮小，光線要偏暗些，并將計數(shù)室移至視野中央。5計數(shù)時用由 16 中格的計數(shù)板，要按對角線方位，數(shù)左上、左下、右上、右下的4 個中格（即100 小格）的保加利亞乳桿菌數(shù)。如果是25 個大方格組成的計數(shù)區(qū)，除數(shù)上述四個格外，還需數(shù)中央l 個中格的保加利亞乳桿菌菌數(shù)（即 80個小格）。由于菌體在計數(shù)室中處于不同的空間位置，要在不同的焦距下才能看到，因而觀察時必須不斷調(diào)節(jié)微調(diào)如菌體位于大方格的雙線上，計數(shù)時則數(shù)上線不數(shù)下線，數(shù)左線不數(shù)右線，以減少誤差。6在高倍鏡下計數(shù)：隨機地計數(shù)5 個中格內(nèi)的菌數(shù)，然后求得每個中格的平均值。乘上16（或25）就得出 1