微生物的接種、分離純化與培養(yǎng)方法

1、微生物的培養(yǎng)方法實驗目的：學習掌握無菌操作技術；學習接種方法；學習常用的分離、純化菌 種的方法。一、接種將微生物接到適于它生長繁殖的人工培養(yǎng)基上或活的生物體內的過程叫做 接種。1、接種工具和方法在實驗室用得最多的接種工具是接種環(huán)、接種針。由于接種要求或方法的不 同，接種針的針尖部常做成不同的形狀，有刀形、耙形等之分。有時滴管、吸管 也可作為接種工具進行液體接種。在固體培養(yǎng)基表面要將菌液均勻涂布時，需要 用到涂布棒。（圖1）圖1接種和分離工具1.接種針2.接種環(huán)3.接種鉤4.5.玻璃涂棒6.接種圈7.接種鋤8.小解剖刀常用的接種方法有以下幾種：1）劃線接種這是最常用的接種方法。即在固體培養(yǎng)基表面

2、作來回直線形 的移動，就可達到接種的作用。常用的接種工具有接種環(huán)，接種針等。在斜面接 種和平板劃線中就常用此法。2 ）三點接種在研究霉菌形態(tài)時常用此法。此法即把少量的微生物接種在 平板表面上，成等邊三角形的三點，讓它各自獨立形成菌落后，來觀察、研究它 們的形態(tài)。除三點外，也有一點或多點進行接種的。3 ）穿刺接種 在保藏厭氧菌種或研究微生物的動力時常采用此法。做穿刺 接種時，用的接種工具是接種針。用的培養(yǎng)基一般是半固體培養(yǎng)基。它的做法是: 用接種針蘸取少量的菌種，沿半固體培養(yǎng)基中心向管底作直線穿刺， 如某細菌具 有鞭毛而能運動，則在穿刺線周圍能夠生長。4）澆混接種該法是將待接的微生物先放入培養(yǎng)皿

3、中，然后再倒入冷卻至 45° C 左右的固體培養(yǎng)基，迅速輕輕搖勻，這樣菌液就達到稀釋的目的。待平板凝固之后，置合適溫度下培養(yǎng)，就可長出單個的微生物菌落。5）涂布接種與澆混接種略有不同，就是先倒好平板，讓其凝固，然后再 將菌液倒入平板上面，迅速用涂布棒在表面作來回左右的涂布，讓菌液均勻分布，就可長出單個的微生物的菌落。6）液體接種 從固體培養(yǎng)基中將菌洗下，倒入液體培養(yǎng)基中，或者從液體 培養(yǎng)物中，用移液管將菌液接至液體培養(yǎng)基中，或從液體培養(yǎng)物中將菌液移至固體培養(yǎng)基中，都可稱為液體接種。7）注射接種該法是用注射的方法將待接的微生物轉接至活的生物體內， 如人或其它動物中，常見的疫苗預防接種，

4、就是用注射接種，接入人體，來預防某些疾病。8）活體接種 活體接種是專門用于培養(yǎng)病毒或其它病原微生物的一種方法， 因為病毒必須接種于活的生物體內才能生長繁殖。所用的活體可以是整個動物；也可以是某個離體活組織，例如猴腎等；也可以是發(fā)育的雞胚。接種的方式是注射，也可以是拌料喂養(yǎng)。2、無菌操作培養(yǎng)基經高壓滅菌后，用經過滅菌的工具（如接種針和吸管等）在無菌條件下接種含菌材料（如樣品、菌苔或菌懸液等）于培養(yǎng)基上，這個過程叫做無菌接種操作。在實驗室檢驗中的各種接種必須是無菌操作。實驗臺面不論是什么材料，一律要求光滑、水平。 光滑是便于用消毒劑擦洗；水平是倒瓊脂培養(yǎng)基時利于培養(yǎng)皿內平板的厚度保持一致。在實驗臺

5、上方，空氣流動應緩慢，雜菌應盡量減少，其周圍雜菌也應越少越好。為此， 必須清掃室內，關閉實驗室的門窗，并用消毒劑進行空氣消毒處理，盡可能地減少雜菌的數(shù)量。空氣中的雜菌在氣流小的情況下，隨著灰塵落下，所以接種時，打開培養(yǎng)皿的時間應盡量短。用于接種的器具必須經干熱或火焰等滅菌。接種環(huán)的火焰滅菌方法： 通常接種環(huán)在火焰上充分燒紅（接種柄，一邊轉動一邊慢慢地來回通過火焰三次），冷卻，先接觸一下培養(yǎng)基，待接種環(huán)冷卻到室溫后，方可用它來挑取含菌材料或菌體，迅速地接種到新的培養(yǎng)基上。（圖2）然后，將接種環(huán)從柄部至環(huán)端逐漸通過火焰滅菌，復原。 不要直接燒環(huán)，以免殘留在接種環(huán)上的菌體爆濺而污染空間。平板接種時，

6、通常把平板的面傾斜，把培養(yǎng)皿的蓋打開一小部分進行接種。在向培養(yǎng)皿內倒培養(yǎng)基或接種時，試管口或瓶壁外面不要接觸底皿邊，試管或瓶口應傾斜一下在火焰上通過。圖2斜面接種時的無菌操作（1）接種滅菌（2）開啟棉塞（3）管口滅菌（4）挑起菌苔（5）接種（6）塞好棉塞二、分離純化含有一種以上的微生物培養(yǎng)物稱為混和培養(yǎng)物（Mixed culture）。如果在一個菌落中所有細胞均來自于一個親代細胞，那么這個菌落稱為純培養(yǎng)（ Pure culture）。在進行菌種鑒定時，所用的微生物一般均要求為純的培養(yǎng)物。得到純 培養(yǎng)的過程稱為分離純化，方法有許多種。1、傾注平板法首先把微生物懸液通過一系列稀釋，取一定量的稀釋液

7、與熔化好的保持在 4050。左右的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基充分混合，然后把這混合液傾注到無菌的培養(yǎng)皿 中，待凝固之后，把這平板倒置在包箱中培養(yǎng)。單一細胞經過多次增殖后形成一 個菌落，取單個菌落制成懸液，重復上述步驟數(shù)次，便可得到純培養(yǎng)物。（圖3, a）圖3傾注平板法（a）涂布平板法（b）圖解1.菌懸液2.熔化的培養(yǎng)基3.培養(yǎng)物4.無菌水2、涂布平板法首先把微生物懸液通過適當?shù)南♂?，取一定量的稀釋液放在無菌的已經凝固 的營養(yǎng)瓊脂平板上，然后用無菌的玻璃刮刀把稀釋液均勻地涂布在培養(yǎng)基表面 上，經恒溫培養(yǎng)便可以得到單個菌落。（圖3 5 ,b）3、平板劃線法最簡單的分離微生物的方法是平板劃線法。用無菌的接種環(huán)取

8、培養(yǎng)物少許在 平板上進行劃線。劃線的方法很多，常見的比較容易出現(xiàn)單個菌落的劃線方法有 斜線法、曲線法、方格法、放射法、四格法等。（圖4）當接種環(huán)在培養(yǎng)基表面上往后移動時，接種環(huán)上的菌液逐漸稀釋，最后在所劃的線上分散著單個細胞， 經培養(yǎng)，每一個細胞長成一個菌落。（圖 4） 4、富集培養(yǎng)法富集培養(yǎng)法的方法和原理非常簡單。我們可以創(chuàng)造一些條件只讓所需的微生 物生長，在這些條件下，所需要的微生物能有效地與其他微生物進行競爭，在生長能力方面遠遠超過其他微生物。 所創(chuàng)造的條件包括選擇最適的碳源、 能源、溫 度、光、pH、滲透壓和氫受體等。在相同的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件下，經過多次重 復移種，最后富集的菌株很容易

9、在固體培養(yǎng)基上長出單菌落。如果要分離一些專 性寄生菌，就必須把樣品接種到相應敏感宿主細胞群體中， 使其大量生長。通過 多次重復移種便可以得到純的寄生菌。圖4平板劃線分離法1.斜線法2.曲線法3.方格法4.放射法5.四格法5、厭氧法在實驗室中，為了分離某些厭氧菌，可以利用裝有原培養(yǎng)基的試管作為培養(yǎng) 容器，把這支試管放在沸水0浴中加熱數(shù)分鐘，以便逐出培養(yǎng)基中的溶解氧。然 后快速冷卻，并進行接種。接種后，加入無菌的石蠟于培養(yǎng)基表面，使培養(yǎng)基與空氣隔絕。另一種方法是，在接種后，利用N2 或 CO2 取代培養(yǎng)基中的氣體，然后在火焰上把試管口密封。有時為了更有效地分離某些厭氧菌，可以把所分離的樣品接種于培

10、養(yǎng)基上，然后再把培養(yǎng)皿放在完全密封的厭氧培養(yǎng)裝置中。.r 、 、j，三、培養(yǎng)微生物的生長，除了受本身的遺傳特性決定外，還受到許多外界因素的影響，如營養(yǎng)物濃度、溫度、水分、氧氣、PH等。微生物的種類不同，培養(yǎng)的方式和條件也不盡相同。1、影響微生物生長的因素微生物的生長，除了受本身的遺傳特性決定外，還受到外界許多因素的影響。影響微生物生長的因素很多，簡要介紹如下。1) 營養(yǎng)物濃度細菌的生長率與營養(yǎng)物的濃度有關：仙=max*C/(K+C)，營養(yǎng)物濃度與生 長率的關系曲線是典型的雙曲線。K 值是細菌生長的很基本的特性常數(shù)。它的數(shù)值很小，表明細菌所需要的營養(yǎng)濃度非常之低，所以在自然界中，它們到處生長。然

11、而營養(yǎng)太低時，細菌生長就會遇到困難，甚至還會死亡。這是因為除了生長需要能量以外，細菌還需要能量來維持它的生存。這種能量稱為維持能。另一方面，隨著營養(yǎng)物濃度的增加，生長率愈接近最大值。2)溫度在一定的溫度范圍內，每種微生物都有自已的生長溫度三基點：最低生長溫度、最適生長溫度和最高生長溫度。在生長溫度三基點內，微生物都能生長，但生長速率不一樣。微生物只有處于最適生長溫度時，生長速度才最快，代時最短。超過最低生長溫度，微生物不會生長，溫度太低，甚至會死亡。超過最高生長溫度，微生物也要停止生長，溫度過高。也會死亡。一般情況下，每種微生物的生長溫度三基點是恒定的。但也常受其它環(huán)境條件的影響而發(fā)生變化。根

12、據(jù)微生物最適生長溫度的不同，可將它們分為三個類型：a.嗜冷微生物：具是適生長溫度多數(shù)在-10C 20c之間b.中溫微生物：其最適生長溫度一般在 20c - 45c之間c.嗜熱微生物：生長溫度在45c以上。3 )水分水分是微生物進行生長的必要條件。芽孢、孢子萌發(fā)，首先需要水分。微生物是不能脫離水而生存的。但是微生物只能在水溶液中生長，而不能生活在純水中。 各種微生物在不能生長發(fā)育的水分活性范圍內，均具有狹小的適當?shù)乃只钚詤^(qū)域。4 )氧氣按照微生物對氧氣的需要情況，可將它們分為以下五個類型。a.需氧微生物：這類微生物需要氧氣供呼吸之用。沒有氧氣，便不能生長，但是高濃度的氧氣對需氧微生物也是有毒的

13、。很多需氧微生物不能在氧氣濃度大于大氣中氧氣濃度的條件下生長。絕大多數(shù)微生物都屬于這個類型。b.兼性需氧微生物：這類微生物在有氧氣存在或無氧氣存在情況下，都能生長， 只不過所進行的代謝途徑不同罷了。在無氧氣存在的條件下，它進行發(fā)酵作用，例如酵母菌的無氧乙醇發(fā)酵。c.微量需氧微生物：這類菌是需要氧氣的，但只在 0.2大氣壓下生長最好。這可能是由一它們含有在強氧化條件下失活的酶，因而只有在低壓下作用。d.耐氧微生物：這類微生物在生長過程中，不需要氧氣，但也不怕氧氣存在， 不會被氧氣所殺死。e.厭氧微生物:這類微生物在生長過程中，不需要分子氧。分子氧存在對它們生長產生毒害，不是被抑制，就是被殺死。2

14、、培養(yǎng)方法1）根據(jù)培養(yǎng)時是否需要氧氣，可分為好氧培養(yǎng)和厭氧培養(yǎng)兩大類。好氧培養(yǎng)：也稱“好氣培養(yǎng)”。就是說這種微生物在培養(yǎng)時，需要有氧氣加入， 否則就不能生長良好。在實驗室中，斜面培養(yǎng)是通過棉花塞從外界獲得無菌的空氣。 三角燒瓶液體培養(yǎng)多數(shù)是通過搖床振蕩，使外界的空氣源源不斷地進入瓶中。厭氧培養(yǎng)：也稱“厭氣培養(yǎng)”。這類微生物在培養(yǎng)時，不需要氧氣參加。在厭氧微生物的培養(yǎng)過程中，最重要的一點就是要除去培養(yǎng)基中的氧氣。一般可采用下列幾種方法：a降低培養(yǎng)基中的氧化還原電位：常將還原劑如谷胱甘肽、硫基醋酸鹽等， 加入到培養(yǎng)基中，便可達到目的。有的將一些動物的死的或活的組織如牛心、羊腦加入到培養(yǎng)基中，也可適

15、合厭氧菌的生長。b.化合去氧：這也有很多方法，主要有：用焦性沒食子酸吸收氧氣；用磷吸收氧氣；用好氧菌與厭氧混合培養(yǎng)吸收氧氣；用植物組織如發(fā)芽的種子吸收氧氣；用產生氫氣與氧化合的方法除氧。c.隔絕阻氧：深層液體培養(yǎng)；用石蠟油封存；半固體穿刺培養(yǎng)。d.替代驅氧 用二氧氣碳驅代氧氣；用氮氣驅代氧氣；用真空驅代氧氣；用氫氣驅代氧氣；用混和氣體驅代氧氣。2）根據(jù)培養(yǎng)基的物理狀態(tài)，可分為固體培養(yǎng)和液體培養(yǎng)兩大類。固質培養(yǎng)：是將菌種接至疏松而富有營養(yǎng)的固體培養(yǎng)基中，在合適的條件下進行微生物培養(yǎng)的方法。液體培養(yǎng)：在實驗中，通過液體培養(yǎng)可以使微生物迅速繁殖，獲得大量的培養(yǎng)物，在一定條件下，還是微生物選擇增菌的有效方法。四、常用菌種保藏法菌種的保藏常采用干燥、低溫和隔絕空氣等措施，將其新陳代謝限制在最低范圍內， 使其生命活動處于半永久性的休眠狀態(tài)，使菌種能夠存活、不污染雜菌、不發(fā)生或較少發(fā)生變異，保存菌種原有的各種生物學性狀。較常用的菌種保藏法有斜面或半固體傳代保藏法，以及冷凍真空干燥法和液氮超低溫保藏法等。其它尚有載體保藏法和懸液保藏法等。1 斜面或半固體傳代保藏法此法保藏菌種常用的培養(yǎng)基有普通肉湯瓊脂斜面、血清斜面、血瓊脂斜面、雞蛋斜面和血清肉湯半固體培養(yǎng)基等等。在斜面或半固體培養(yǎng)基表面，往往加入滅菌液體石蠟，用以隔絕空氣。此外