硫丹檢測(cè)試劑盒使用說(shuō)明

1、硫丹檢測(cè)試劑盒使用說(shuō)明1.檢測(cè)原理 該試劑盒基于免疫學(xué)中抗原抗體的反應(yīng)原理制成。硫丹抗體包被于酶標(biāo)板孔中，樣品中存在的硫丹能與硫丹酶標(biāo)記物競(jìng)爭(zhēng)性地結(jié)合板中定量的抗體，采用直接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)硫丹。1.1 含有硫丹的樣品提取液加到包被有抗體的酶標(biāo)板中，同時(shí)加入硫丹酶標(biāo)記物，兩者競(jìng)爭(zhēng)性的結(jié)合抗體結(jié)合位點(diǎn)。1.2 混合物室溫放置60分鐘，然后將未結(jié)合的物質(zhì)洗掉。1.3 將底物溶液加入酶標(biāo)板中，與酶作用后顯色。因?yàn)槊笜?biāo)板每孔包被有相同量的抗體，每孔將會(huì)結(jié)合等量的游離抗原及酶標(biāo)記抗原，當(dāng)樣品中含有較多的硫丹時(shí)，每孔抗體結(jié)合的酶標(biāo)記抗原的量則少，酶顯色后的顏色則淺，反之，顏色深，因此顏色深淺與樣品中

2、待檢抗原的量成一定相關(guān)性。2.產(chǎn)品特性該試劑盒適用于有機(jī)氯農(nóng)藥硫丹的快速檢測(cè)，不能檢測(cè)其他種類農(nóng)藥。適于土壤，水，蔬菜，水果，茶葉，煙草，畜肉，蝦等試樣。3.試劑盒組成硫丹標(biāo)準(zhǔn)溶液(10ug/mL)硫丹酶標(biāo)記物掩蔽劑濃縮液（注：每次使用前需用PBS溶液1：20稀釋得到掩蔽劑稀釋液）酶底物A液、B液5PBS溶液洗滌液（注：每次使用前需用Millipore超純水1：5稀釋）包被有硫丹特異抗體的96孔酶標(biāo)板一個(gè)（12*8）4.試劑盒未提供而檢測(cè)需要的其他試劑及設(shè)備4.1儀器酶標(biāo)儀(含450nm,650nm)單道微量移液器：1-20 uL，2001000 uL 和10005000 uL多道移液器：50

3、200 uL振蕩器：用于樣品提取玻璃器皿：玻璃瓶，試管，量筒洗板機(jī)或洗瓶：用以沖洗酶標(biāo)板渦旋混合器4.2試劑終止液： 1.25M硫酸掩蔽劑稀釋液：將試劑盒提供的掩蔽劑濃縮液用PBS溶液1：20稀釋磷酸鹽緩沖液PBS：13.8g Na2HPO4.12H2O ，1.6 g NaH2PO4.H2O，9.0 g NaCl，溶于1L超純水中，調(diào)pH7.4溶液：含10甲醇的掩蔽劑稀釋液5. 樣品處理5.1前處理干燥產(chǎn)品：將樣品全部磨碎，四分法縮分。水果蔬菜類：如有泥沙，先用水洗掉，然后除去表面附著的水分，取食用部分，沿縱軸剖開(kāi)，切成四等分，取相對(duì)的兩塊，切碎，混勻。5.2提取紅豆，綠豆，芹菜：稱取10g粗

4、粉碎樣品到玻璃瓶中，加入50mL甲醇，機(jī)械振蕩（250rpm/min）提取1小時(shí)。靜置，吸取少量上清液用掩蔽劑稀釋液稀釋20倍后進(jìn)行測(cè)定。水果：稱取10g粗粉碎樣品到玻璃瓶中，加入50mL甲醇，機(jī)械振蕩（250rpm/min）提取1小時(shí)。靜置，吸取少量上清液用掩蔽劑稀釋液稀釋20倍后進(jìn)行測(cè)定。蔬菜（大白菜，蒜，蔥，茼蒿，小松菜，甘藍(lán)，蘆筍）：稱取5g粗粉碎樣品到玻璃瓶中，加入25mL甲醇，機(jī)械振蕩（250rpm/min）提取過(guò)夜。靜置，吸取少量上清液用掩蔽劑稀釋液稀釋10倍后進(jìn)行測(cè)定。胡蘿卜：稱取5g粗粉碎樣品到玻璃瓶中,加入25mL甲醇，機(jī)械振蕩（250rpm/min）提取過(guò)夜。靜置,吸取少

5、量上清液用掩蔽劑稀釋液稀釋15倍后進(jìn)行測(cè)定。牛肉,羊肉,雞肉：稱取10g粗粉碎樣品到玻璃瓶中，加入20mL甲醇，渦旋劇烈混合2min，過(guò)濾,吸取少量上清液用掩蔽劑稀釋液稀釋10倍后進(jìn)行測(cè)定。姜,毛豆:稱取10g粗粉碎樣品到玻璃瓶中,加入20mL甲醇,機(jī)械振蕩(250rpm/min)提取1小時(shí)。靜置,吸取少量上清液用掩蔽劑稀釋液稀釋50倍后進(jìn)行測(cè)定?；ㄉ悍Q取10g粗粉碎樣品到玻璃瓶中，加入20mL甲醇，機(jī)械振蕩（250rpm/min）提取1小時(shí)。25，4800r/min下離心5min，吸取少量上清液用掩蔽劑稀釋液稀釋100倍后進(jìn)行測(cè)定。菠菜：稱取5g粗粉碎樣品到玻璃瓶中，加入25mL甲醇，機(jī)械

6、振蕩（250rpm/min）提取過(guò)夜。靜置,吸取少量上清液用掩蔽劑稀釋液稀釋80倍后進(jìn)行測(cè)定。茶葉：稱取5g粗粉碎樣品到玻璃瓶中，加入25mL甲醇，機(jī)械振蕩（250rpm/min）提取過(guò)夜。靜置，吸取少量上清液（一般為20uL-50uL）用掩蔽劑稀釋液稀釋900倍后進(jìn)行測(cè)定。煙草：稱取10g粗粉碎樣品到玻璃瓶中,加入50mL甲醇，機(jī)械振蕩（250rpm/min）提取1小時(shí)。靜置,吸取少量上清液用掩蔽劑稀釋液稀釋200倍后進(jìn)行測(cè)定。鰻魚(yú)：取5g 待測(cè)樣，攪碎后加入10ml甲醇，漩渦混勻提取2 min，用濾紙過(guò)濾；取濾液，用掩蔽劑稀釋液稀釋40倍。蝦：稱取10g待測(cè)樣，攪碎后加入20g無(wú)水硫酸鈉攪

7、勻，再加入20ml丙酮和1.04M硫酸鋅溶液、0.36M亞鐵氰化鉀各200l，漩渦混勻提取2 min；25，4800r/min下離心5min。取全部上清液濃縮至干；加入50%甲醇水8ml，充分溶解，濾紙過(guò)濾。注：1.此方法需要陰性樣做標(biāo)準(zhǔn)曲線。陰性樣處理方法同待測(cè)樣，梯度稀釋方法可參考6.1.2硫丹標(biāo)準(zhǔn)溶液的稀釋，以陰性樣品溶液代替溶液。6分析步驟檢測(cè)前將所有的試劑和待測(cè)樣品放置至室溫，在操作過(guò)程中，不要將底物暴露在陽(yáng)光下。6.1試劑準(zhǔn)備6.1.1按4.2中試劑配方配制分析所需的試劑6.1.2硫丹標(biāo)準(zhǔn)溶液的稀釋從10 ug/mL的硫丹標(biāo)準(zhǔn)溶液試劑瓶中取10uL,用990uL溶液稀釋100倍,得

8、到100 ug/L的硫丹標(biāo)準(zhǔn)溶液,進(jìn)一步用溶液進(jìn)行1:3梯度稀釋,得到一系列不同濃度的硫丹標(biāo)準(zhǔn)溶液(100 ug/L,33.3 ug/L, 11.1 ug/L, 3.7ug/L, 1.2 ug/L 0.4 ug/L)。6.1.3硫丹酶標(biāo)記物的稀釋從硫丹酶標(biāo)記物試劑瓶中準(zhǔn)確移取25uL酶標(biāo)記物，加入9975uL PBS（磷酸鹽緩沖液），充分混勻，即為所需濃度的酶標(biāo)記物。6.1.4酶底物液的配置將底物A液和底物B液用前按32：1的體積比例混合得底物液，可據(jù)實(shí)際需要,確定所需底物液量,每孔需加150 uL ,底物液應(yīng)在使用前15min內(nèi)配制完畢。6.2分析操作6.2.1 在微孔中分別加入100 uL

9、不同濃度的硫丹標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品待測(cè)液；6.2.2 當(dāng)測(cè)定的樣品是水樣時(shí)，在空白和對(duì)照微孔中分別加入100 uL的超純水，當(dāng)測(cè)定的樣品是其它樣品時(shí)，在空白和對(duì)照微孔中分別加入100 uL的相應(yīng)的樣品稀釋液，例如：茶葉樣品，應(yīng)在空白和對(duì)照微孔中分別加入100 uL的溶液；6.2.3 除空白微孔外，在每個(gè)微孔中加入100 uL的稀釋的酶標(biāo)記物；空白微孔中則加入100 uL PBS；6.2.4 室溫孵育60分鐘；6.2.5 將板中的液體倒掉，用洗滌液洗滌3次，用吸水紙拍干；6.2.6每個(gè)微孔中加入混合好的酶底物液150 uL，除空白外，其余微孔應(yīng)顯示為藍(lán)色；6.2.7 室溫放置30分鐘后，每個(gè)微孔加入5

10、0 uL的終止液，輕輕晃動(dòng)酶標(biāo)板，使板內(nèi)液體混勻，除空白外，其余微孔應(yīng)顯示為黃色； 6.2.8立即在酶標(biāo)儀上讀出每孔450nm-650nm吸光值，該過(guò)程應(yīng)當(dāng)迅速。7結(jié)果分析7.1抑制率的計(jì)算抑制率×100A是450nm吸光值與650nm吸光值的差值X軸為硫丹濃度，y軸為抑制率，以硫丹濃度對(duì)數(shù)值及相應(yīng)抑制率作圖，標(biāo)準(zhǔn)曲線是典型的S型曲線。7.2硫丹含量計(jì)算根據(jù)樣品孔的抑制率查標(biāo)準(zhǔn)曲線求得實(shí)測(cè)樣中硫丹濃度，根據(jù)公式換算成實(shí)際樣品中硫丹含量。硫丹濃度(ug/kg，ng/g) = C×R×MC 根據(jù)樣品孔的抑制率查得實(shí)測(cè)樣中硫丹濃度(ng/mL)R 某類樣品的換算系數(shù)M

11、調(diào)整待測(cè)液濃度,使其在標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍內(nèi)時(shí)所需對(duì)待測(cè)液稀釋的倍數(shù)不同類樣品的R值牛肉，羊肉，雞肉：20大白菜，蒜，蔥，茼蒿，小松菜，甘藍(lán)，蘆筍：50胡蘿卜：75芹菜，綠豆，紅小豆，毛豆，姜：100水果：100 花生：200菠菜：400 茶葉：4500煙草：1000蝦：0.8鰻魚(yú)：80附：硫丹標(biāo)準(zhǔn)曲線示意圖注意事項(xiàng) 檢測(cè)用水為Millipore 超純水如果不使用試劑盒中推薦的溶液，可能造成實(shí)驗(yàn)結(jié)果的不準(zhǔn)確酶標(biāo)物稀釋8h后不能繼續(xù)使用試劑盒應(yīng)貯存于48試劑盒放置于室溫不要超過(guò)4h試劑盒不能置于0以下使用前，保證試劑盒內(nèi)各溶液達(dá)到室溫操作過(guò)程中請(qǐng)勿將底物液見(jiàn)光試劑盒過(guò)期后請(qǐng)勿使用不同試劑盒中溶液請(qǐng)勿混用技術(shù)咨詢方式：FAX:022