中檢院送檢細(xì)胞制劑檢定項(xiàng)目SOP

1、1.2.3.4.5.6.7.8.9.10.11.12.13.14.中檢院送檢細(xì)胞制劑檢定項(xiàng)目 SOP人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞 P4 代成品細(xì)胞質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞流式檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)操作程序逆轉(zhuǎn)錄病毒 PERT 法檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)操作程序細(xì)胞基因組 DNA 提取操作標(biāo)準(zhǔn)流程細(xì)胞基因組 RNA 提取操作標(biāo)準(zhǔn)流程病毒PCR法檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)操作程序I病毒PCR法檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)操作程序nhUC-MSCs 免疫學(xué)反應(yīng)檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)操作程序hUC-MSCs 成骨誘導(dǎo)分化標(biāo)準(zhǔn)操作程序hUC-MSCs 成脂誘導(dǎo)分化標(biāo)準(zhǔn)操作程序細(xì)胞計(jì)數(shù)臺(tái)盼藍(lán)染色法標(biāo)準(zhǔn)操作程序細(xì)胞周期檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)操作程序hUC-MSCs 端粒酶檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)操作程序hUC-MSCs 軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)

2、標(biāo)準(zhǔn)操作程序1012141619212225262831未經(jīng)允許不得復(fù)印19人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞 P4代成品細(xì)胞質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)項(xiàng)目檢測(cè)方法標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定【生物學(xué)屬性】細(xì)胞形態(tài)鏡檢細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)時(shí)，呈梭形， 應(yīng)為成纖維樣細(xì)胞細(xì)胞計(jì)數(shù)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀檢測(cè)標(biāo)示量的90%120%STR圖譜多重PCR復(fù)合擴(kuò)增系統(tǒng)檢測(cè)無(wú)交叉污染細(xì)胞活率細(xì)胞計(jì)數(shù)儀檢測(cè)不低于85%細(xì)胞 表面 抗原 分析CD 90流式細(xì)胞術(shù)（FCM）不低于95%CD 73不低于95%CD 105不低于95%CD44不低于95%CD166不低于95%CD 45不得過(guò)2%CD 34不得過(guò)2%CD19不得過(guò)2%CD 14不得過(guò)2%HLA-DR不得過(guò)2%【微生物學(xué)安全

3、性檢查】尢菌需氧菌及真菌全自動(dòng)血培養(yǎng)儀監(jiān)測(cè) 系統(tǒng)檢測(cè)陰性厭氧菌及真菌陰性內(nèi)毒素凝膠法陰性支原體培養(yǎng)法陰性逆轉(zhuǎn)錄病毒P ERT法檢測(cè)逆轉(zhuǎn)錄酶活性陰性HIV-1熒光PCR核酸檢測(cè)陰性HBV熒光PCR核酸檢測(cè)陰性HCV熒光PCR核酸檢測(cè)陰性HCMV熒光PCR核酸檢測(cè)陰性EBV熒光PCR核酸檢測(cè)陰性HPV熒光PCR核酸檢測(cè)陰性人細(xì)小B19病毒熒光PCR核酸檢測(cè)陰性HHV6/7PCR核酸檢測(cè)陰性HTLVPCR核酸檢測(cè)陰性豬細(xì)小病毒PCR核酸檢測(cè)陰性豬細(xì)環(huán)病毒PCR核酸檢測(cè)陰性豬圓環(huán)病毒PCR核酸檢測(cè)陰性牛副流感病毒PCR核酸檢測(cè)陰性牛腺病毒PCR核酸檢測(cè)陰性牛細(xì)小病毒PCR核酸檢測(cè)陰性牛腹瀉病毒PCR核

4、酸檢測(cè)陰性牛呼腸孤病毒PCR核酸檢測(cè)陰性【生物學(xué)活性檢查】誘導(dǎo)分化能力檢測(cè)成骨成脂誘導(dǎo)分化染色法具有成骨成脂誘導(dǎo)分化潛成瘤性檢測(cè)軟瓊脂克隆生長(zhǎng)試驗(yàn)?zāi)芸寺⌒纬杉?xì)胞流式檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)操作程序目的： 對(duì)細(xì)胞表面抗原進(jìn)行流式鑒定，保證檢測(cè)的準(zhǔn)確性。范圍： 細(xì)胞流式檢測(cè)的全過(guò)程責(zé)任人： 技術(shù)部?jī)?nèi)容4.1 儀器和試劑4.1.1儀器設(shè)備：流式細(xì)胞儀（FACS Calibur）、臺(tái)式離心機(jī)、1000uL微量移液槍、100譏微量移液槍、10uL微量移液槍。4.1.2 試劑以及耗材：FITC單克隆抗體、APC單克隆抗體、PE單克隆抗體、PerCP單克隆抗體、相應(yīng)的同型對(duì)照；1XPBS;鞘液專用流式管、槍頭。4.1.3

5、樣本準(zhǔn)備4.1.3.1將樣本按條碼號(hào)順序排列好，每份樣本按照檢測(cè)抗體種類的需要取流式專用管若干支，分別標(biāo)記好單陽(yáng)管、陰性管、同型對(duì)照管和樣本檢測(cè)管。4.1.3.2各取100 uL羊本加入標(biāo)記好的流式管中，然后根據(jù)流式管標(biāo)記的信息分別添加對(duì)應(yīng)的抗體。充分混勻，置 4 C冰箱避光孵育30分鐘。4.1.3.5孵育結(jié)束以后加入1ml PBS,充分混勻,1200rpm 離心 5 分鐘。4.1.3.7棄上清液，加入 300卩L PBS充分混勻,隨后上機(jī)檢測(cè)。4.2 儀器開機(jī)程序4.2.1 依次打開穩(wěn)壓電源 ,主電源,流式細(xì)胞儀電源,計(jì)算機(jī)。4.2.2開啟電腦，在出現(xiàn)的密碼登錄框中，輸入BDIS，按Ente

6、ro4.2.3打開鞘液筒抽屜,檢查鞘液筒和廢液筒存液情況,鞘液筒空則需要加液,廢液筒滿則取出倒除,檢查管路是否有氣泡,否則應(yīng)排除,沒(méi)有問(wèn)題以后,打開鞘液壓力開關(guān)。4.2.4開機(jī)后，儀器預(yù)熱 5min，即可開始進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。4.2.5實(shí)驗(yàn)之前,儀器清洗,專用流式管裝滿雙蒸水,放置儀器吸液管下,設(shè)備“ run+high情況下，然后PRIME （排空氣）模式運(yùn)行兩次。4.2.6 流式細(xì)胞儀上羊前 FAScomp 質(zhì)控分析4.261標(biāo)準(zhǔn)微球的制備（標(biāo)準(zhǔn)微球“Cal BRITE beads保存4度）三色檢測(cè)： 管 1：1 滴 Unlabeled+0.5ml 鞘液（或者 0.5ml 蒸餾水）管 2：1 滴 u

7、nlabeled+FITC,PE,Percp 各一滴 +1ml 鞘液四色檢測(cè)： 管 1 ： 1 滴 unlabed+1 滴 APC+0.5ml 鞘液管 2：1 滴 unlabed+FITC,PE,Percp,APC 各一滴 +1ml 鞘液4.2.6.2打開FAScomp軟件，在“ sigh in窗口下，輸入信息，然后“ accept進(jìn)入“ set up ”窗口。4.2.6.3"set窗口下，選擇分選模式：“ Lyse/wash （用于溶血素洗滌樣本）（通常選擇該模式），“Lyse/No wash”、用于溶血處理后的免洗樣），然后輸入 CaliBRITEBeads ”批號(hào)批號(hào)為 6 位

8、編碼，最后一位為大寫字母），選擇存儲(chǔ)文件。4.2.6.4然后點(diǎn)擊“ RUNf,進(jìn)入PMT窗口，在該窗口下，用管1為樣品，選擇“ RUN-/high。點(diǎn)擊“starti動(dòng)調(diào)節(jié)光電倍增管的電壓,屏幕出現(xiàn)閃爍PMTS set successfully 點(diǎn) ”擊 “NEXT。4.265在“COMP窗口下，用 管2”為樣品,選擇 “ RUN/HIGH',點(diǎn)擊“ START,可執(zhí)行自動(dòng)調(diào)節(jié)熒光補(bǔ)償： FL1-%FL2,FL2-%FL1和 FL3-%FL2,屏幕出現(xiàn) “COMPENSATIONSET SUCCESSFULL Y” 便可點(diǎn)擊出 “ NEXT'。4.2.6.6在“ sen窗口下，

9、依然用管 2為樣,點(diǎn)擊“ start可自動(dòng)檢測(cè)各參數(shù)靈敏度。4.2.6.7在“ summary report下得到所有檢測(cè)的結(jié)果。4.2.6.8質(zhì)控完成后，移去標(biāo)準(zhǔn)微球管并插上雙蒸水流式管，在“ summary report 狀態(tài)下，點(diǎn)擊“quit鍵，或從“file menu中選擇“quit退出程序。4.2.7打開cellquest pro軟件，按” common+B組合鍵，連接流式細(xì)胞儀。4.2.8 從 “cytometer菜"單 中選擇 “detectors （或者鍵盤 “common+1、）“threshold （或者“com mon+2”）“ compen sati on 或

10、者鍵盤 “ com mon+3'、）“ status 鍵'"（com mon+4"將出現(xiàn)各自對(duì)應(yīng)的窗口，將其拖至空白處。Cytometer 視窗，觀察軟件與細(xì)胞儀4.2.9 確定軟件與細(xì)胞儀完成連接。如果有必要，可點(diǎn)擊是否完成連接。4.2.10完成連接后，在 Cytometer視窗下方會(huì)顯示 Cytometer Connected。檢視各項(xiàng)試劑液面是否正常。在 Cytometer 視窗右下方會(huì)顯示各項(xiàng)試劑液面高度。視實(shí)驗(yàn)需要補(bǔ)充FACSFlow ，倒除廢液。如果視窗下方顯示 Cytometer Disconnected ，可嘗試重新啟動(dòng)Cellquest p

11、ro 軟件。4.2.11 接著可以開始規(guī)劃實(shí)驗(yàn)擋、或設(shè)置儀器。4.3 上樣檢測(cè)4.3.1在工具板中選擇點(diǎn)圖，在文件的空白區(qū)點(diǎn)擊，然后拖動(dòng)對(duì)角線至所需大小， 出點(diǎn)圖對(duì)話框，點(diǎn)擊“plottype "選擇“acquisition->analysis ; X, Y軸默認(rèn)為FSC、SSC,然后上陰性管，調(diào)節(jié)FSC、SSC電壓，再設(shè)置目標(biāo)細(xì)胞群“ region,該“ region在調(diào)節(jié)熒光探測(cè)器時(shí)使用，在工具板中選擇多邊形“region,”在FSC/SSC散點(diǎn)圖上，設(shè)淋巴細(xì)胞“region,”該 “Region在調(diào)節(jié)熒光探測(cè)器時(shí)使用；在工具板中選擇多邊形的“Region"在FS

12、C/SSC點(diǎn)圖上，設(shè)目標(biāo)細(xì)胞群 “region ”在“region外點(diǎn)擊，將拖至空白區(qū)。然后建立FL1/FL2、FL3/FL2、FL3/FL4 點(diǎn)圖，選擇 “G1=R1 ,在工具板上選擇象限標(biāo)尺，三個(gè)點(diǎn)圖上畫象限，指定陰性/陽(yáng)性區(qū)域，調(diào)節(jié)FL1、FL2、FL3、FL4電壓，使細(xì)胞群調(diào)在各點(diǎn)圖所在圖的左下角，點(diǎn)擊“ Acquisition control 窗 口中的 “ pause移，去陰性對(duì)照管。4.3.2依次上FITC、PE、Percp、APC單陽(yáng)管，必要時(shí),調(diào)節(jié) FL2-%FL1、FL1-%FL2、FL2-%FL3、FL3-%FL2、FL3-%FL4、FL4-%FL3 的補(bǔ)償，調(diào)節(jié)完成后，

13、點(diǎn)擊“ acquisition control窗口”中的“pause abort ”移去單陽(yáng)管。4.3.3插上同型對(duì)照管，刪除FL1/FL2、 FL3/FL2、FL3/FL4點(diǎn)圖，建立FL1、FL2、FL3、FL4 直方圖，點(diǎn)擊 “ acquisition control 窗口中的 “pause abort，” 之后 Setup 之面方框去掉，然后點(diǎn)擊Acquire,收集10000個(gè)細(xì)胞，然后同型管圖型外陽(yáng)性區(qū)域畫直方圖Marker,設(shè)定Marker左右邊界，移去同型對(duì)照管。4.3.4插上樣本檢測(cè)管，點(diǎn)擊“ acquisition control窗口中的 “pause abort "

14、之后Setup之面方框送掉，然后點(diǎn)擊 Acquire,收集10000個(gè)細(xì)胞，結(jié)束以后，移去樣本管，插上雙蒸水管，將 儀器處于“ sta ndby狀態(tài)。4.3.5分析數(shù)據(jù)，選中一個(gè)圖表，點(diǎn)擊菜單中stats,選擇“ Histogram Stats出現(xiàn)該選中圖的數(shù)據(jù)分析結(jié)果，選擇Stats菜單下的“Edit Histogram Stats，岀現(xiàn)對(duì)話框，去掉一些不需要的參數(shù)，點(diǎn)擊OK。4.3.6數(shù)據(jù)儲(chǔ)存，首先在 Cytometer視圖菜單下選擇Instrument Setting保存數(shù)據(jù)條件，然后Files視圖菜單下選擇saveDocument as保存數(shù)據(jù)模板，之后可使用相關(guān)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。4.

15、4儀器關(guān)機(jī)程序4.4.1換上雙蒸水管。4.4.2在High+Run條件下，運(yùn)行3min , 2次，然后PRIME+high進(jìn)行排空氣2次。4.4.3點(diǎn)選 File >> Quit退出軟件。關(guān)閉細(xì)胞儀，關(guān)閉電腦。如有必要，請(qǐng)加入1/10體積漂白水，再倒掉廢液，避免生物性危險(xiǎn)。4.4.4填寫運(yùn)行記錄。5修訂記錄序號(hào)版本號(hào)修訂內(nèi)容摘要修訂人/修訂日期支原體培養(yǎng)法檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)操作程序目的：規(guī)范培養(yǎng)法檢測(cè)支原體的標(biāo)準(zhǔn)操作程序范圍：細(xì)胞產(chǎn)品中支原體的檢測(cè)責(zé)任人：技術(shù)部?jī)?nèi)容4.1實(shí)驗(yàn)試劑耗材4.1.1儀器：生物安全柜，二氧化碳培養(yǎng)箱，電動(dòng)移液器，移液槍4.1.2耗材：EP管，200 1槍頭，5ml移

16、液管，15ml離心管4.1.3試劑：支原體培養(yǎng)法檢測(cè)試劑盒4.2實(shí)驗(yàn)步驟4.2.1用5ml移液管取細(xì)胞培養(yǎng)上清于15ml離心管中備用。4.2.2取出試劑盒的測(cè)試板準(zhǔn)備種樣本，移液槍吸取100UI培養(yǎng)液加入A1-空白對(duì)照孔。4.2.3將100ul細(xì)胞培養(yǎng)上清加到 UU-MH培養(yǎng)瓶中，混勻。4.2.4吸取100ul UU-MH培養(yǎng)瓶中的混合液體分別接種到樣本檢測(cè)的微孔中,所有微孔滴加1-2滴試劑盒中的礦物油。接種標(biāo)本的培養(yǎng)基培養(yǎng)4.2.5將測(cè)試板加蓋后置培養(yǎng)箱中35-37 °C培養(yǎng)24-48小時(shí)，觀察結(jié)果: 后，澄清透明不變色為陰性，澄清透明并呈明顯紅色為陽(yáng)性。4.2.6若偶遇培養(yǎng)基變淺

17、紅色（即變色不明顯），建議延長(zhǎng)1224h培養(yǎng)報(bào)結(jié)果（可能剛感染支原 體，標(biāo)本中支原體數(shù)量過(guò)少或受抗生素抑制作用而使變色不明顯 5記錄5.1試劑盒的支原體鑒定報(bào)告單 6修訂記錄序號(hào)版本號(hào)修訂內(nèi)容摘要修訂人/修訂日期逆轉(zhuǎn)錄病毒PERT法檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)操作程序目的：規(guī)范質(zhì)量檢驗(yàn)中逆轉(zhuǎn)錄病毒PERT法檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)操作程序范圍：細(xì)胞產(chǎn)品中逆轉(zhuǎn)錄病毒的檢測(cè)責(zé)任人：技術(shù)部原理逆轉(zhuǎn)錄病毒是一大類含有逆轉(zhuǎn)錄酶的RNA病毒，分為腫瘤病毒亞科、慢病毒亞科和泡沫病毒亞科。逆轉(zhuǎn)錄病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞后，以RNA為模板逆轉(zhuǎn)錄合成雙鏈 DNA , DNA被整合酶整合至宿 主染色體形成前病毒，建立終生感染并可隨宿主細(xì)胞分裂傳遞給子代細(xì)胞。

18、基于這一共同特點(diǎn)，可MS2噬菌體RNA為模板，在合再以逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液為模板，以MS2通過(guò)檢測(cè)逆轉(zhuǎn)錄酶活性來(lái)檢測(cè)細(xì)胞樣品是否被逆轉(zhuǎn)錄病毒污染。以 適的反應(yīng)條件下，利用待檢細(xì)胞的裂解液或者培養(yǎng)液進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄, 噬菌體基因組特異性引物進(jìn)行 PCR,根據(jù)PCR的結(jié)果即可判斷待檢樣品是否受逆轉(zhuǎn)錄病毒污染。5內(nèi)容5.1實(shí)驗(yàn)物品的準(zhǔn)備5.1.1儀器：Nanodrop微型分光光度計(jì)、離心機(jī)、PCR儀、水平電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)5.1.2 試齊 1：MS2 噬菌體 RNA、去 RNase 水、逆轉(zhuǎn)錄酶、2 X EasyTaq DNA聚合酶、DNA Marker、MS2噬菌體基因組特異性引物、Ribo nuclease

19、 In hibitor、瓊脂糖5.2實(shí)驗(yàn)步驟5.2.1樣品制備收集培養(yǎng)的hUC-MSCs約1X106,加入100卩L PBS置于-20 C冰凍30 min ,然后室溫融化，反復(fù)凍融三次以裂解細(xì)胞,10000g離心10min，取上清液備用。5.2.2對(duì)照設(shè)置 以逆轉(zhuǎn)錄酶為陽(yáng)性對(duì)照，此時(shí)逆轉(zhuǎn)錄酶體積為1 yL,去RNase水的體積相應(yīng) 變化，保持總反應(yīng)體系為 20 uL;以去RNase水為陰性對(duì)照。5.2.3逆轉(zhuǎn)錄體系如下:成分體積（yL）RNase-free water112.5 mM dNT P45X RT Buffer110 mM primer0.5Ribon uclease In hibi

20、tor0.5MS2 RNA2待檢樣品4總體積2042C反應(yīng)30 min , 85C加熱5 min使擬轉(zhuǎn)錄酶滅活。524 PCR體系如下:成分體積（1L）2XEasyTaq DNA poly merase1010M Primer_F110M Primer_R1逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液1ddH207總體積20PCR程序如下:過(guò)程溫度時(shí)間預(yù)變性95 C5 minPCR反應(yīng)（35個(gè)循環(huán)）94 C30 sec59 C30 sec72 C20 sec延伸72 C1 min5.2.5凝膠電泳取5卩LPCR產(chǎn)物，加樣到1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳。電壓為120V，時(shí)間為30 min。電泳結(jié)束,利用凝膠成像儀拍照。預(yù)期PCR產(chǎn)物

21、陽(yáng)性對(duì)照必須有308 bp條帶出現(xiàn)，陰性對(duì)照必須無(wú)任何擴(kuò)增, 否則實(shí)驗(yàn)無(wú)效。6記錄6.1逆轉(zhuǎn)錄病毒檢測(cè)實(shí)驗(yàn)記錄 7修訂記錄序號(hào)版本號(hào)修訂內(nèi)容摘要修訂人/修訂日期細(xì)胞基因組 DNA 提取操作標(biāo)準(zhǔn)流程目的： 規(guī)范質(zhì)量檢驗(yàn)中從細(xì)胞中提取 DNA 的標(biāo)準(zhǔn)操作范圍： 細(xì)胞基因組 DNA 提取責(zé)任人： 技術(shù)部?jī)?nèi)容4.1 實(shí)驗(yàn)物品的準(zhǔn)備4.1.1 試劑： DNA 快速提取試劑盒、異丙醇4.1.2耗材：10 mL移液管、5 mL移液管、50 mL離心管、10卩L & 200 槍頭、1.5 mL EP管4.1.3儀器：掌上離心機(jī)、混勻儀、電熱恒溫水槽、臺(tái)式離心機(jī)、Nanodrop 微型分光光度計(jì)4.2

22、實(shí)驗(yàn)步驟4.2.1提前打開水浴鍋，設(shè)置為 70 C,預(yù)熱高壓的去離子水（溶解 DNA用），將細(xì)胞沉淀（滴度測(cè)定實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備的新鮮樣品或-80 C凍存樣品）用180L的PBS重懸。4.2.2加入20 uL蛋白酶K溶液（用之前震蕩混勻離心），充分震蕩混勻，瞬離，加入200譏結(jié)合液CB，立刻渦旋震蕩，充分混勻，70C水浴鍋內(nèi)放置20 min （10 min時(shí)震蕩混勻一次）。4.2.3瞬離（為避免管蓋沾有液體），加入 100卩漂異丙醇，立刻渦旋震蕩，充分混勻，此時(shí)可能出現(xiàn)絮狀沉淀。4.2.4瞬離（為避免管蓋沾有液體），將上一步混合物（包括可能有的沉淀）加入一個(gè)吸附柱AC中（吸附柱放入收集管中）（加之前吹打

23、兩下，使之混勻），加入后立即蓋好蓋子，防止異丙醇揮發(fā)，13000 rpm, 1 min , 20C,離心，倒掉收集管中的液體。4.2.5加入500抑制物去除液IR （用之前搖一下混勻）12000 rpm, 1 min, 20 C 離心，棄掉廢液。4.2.6加入500漂洗液WB （檢查已加入無(wú)水乙醇），12000 rpm, 1min , 20 C 離心，棄掉廢液。4.2.7加入500卩漂洗液WB （檢查已加入無(wú)水乙醇），12000rpm, 1 min, 20 C 離心，棄掉廢液。4.2.8將吸附柱AC 放回收集管中, 13000 rpm, 2 min,20 C離心，盡量除去漂洗液，以免漂洗2 m

24、in，使乙醇完全揮發(fā)，如樣50卩預(yù)熱過(guò)的高壓的去離子液中殘留的乙醇抑制下游反應(yīng)。4.2.9 取出吸附柱 AC ，放入一個(gè)干凈的離心管中，打開蓋子靜置品較多，晾干 2分鐘后需蓋上所有管蓋；在吸附膜的中間部位加水，70 eK浴鍋中放置 5 min , 13000 rpm , 1 min , 20 C,離心。4210利用Nanodrop檢測(cè)所提 DNA溶液濃度，要求 A260/A280在1.8-2.0之間，A260/A230大于2.0。DNA溶液儲(chǔ)存于4 G或-20 C待用。5記錄5.1內(nèi)外病毒DNA因子檢測(cè)記錄 6修訂記錄序號(hào)版本號(hào)修訂內(nèi)容摘要修訂人/修訂日期細(xì)胞基因組 RNA 提取操作標(biāo)準(zhǔn)流程目

25、的： 規(guī)范質(zhì)量檢驗(yàn)中從細(xì)胞中提取 RNA 的標(biāo)準(zhǔn)操作 范圍： 細(xì)胞內(nèi) RNA 提取 責(zé)任人： 技術(shù)部 內(nèi)容4.1 實(shí)驗(yàn)物品的準(zhǔn)備4.1.1 試劑：Easy Pure? RNA Purification kit 、70%乙醇、3 -巰基乙醇4.1.2 耗材：10 卩 L & 200 卩 L& 1000 槍頭、1.5 mL EP 管Nanodrop 微型分光光度計(jì)4.1.3 儀器：掌上離心機(jī)、混勻儀、電熱恒溫水槽、臺(tái)式離心機(jī)、4.2 實(shí)驗(yàn)步驟4.2.1 樣品處理收集細(xì)胞，離心得到的細(xì)胞沉淀，去除上清后，輕彈離心管底部，細(xì)胞細(xì)胞沉淀檢散，加入相應(yīng)體積的裂解液 BB4 （每1ml BB

26、4加入10ul 3 -巰基乙醇，現(xiàn)配現(xiàn)用），劇烈渦旋，直至細(xì)胞沉淀分散均勻。（注意：當(dāng)細(xì)胞量1*106,BB4用量0.3ml;當(dāng)細(xì)胞量1*10人65*106,BB4用量0.6ml）4.2.2 均質(zhì)化處理用 RNase-free 的針管反復(fù)吹吸 5-10 次，使溶液合均勻質(zhì)化，然后室溫 12000g 離心 5min,吸上清于一 RNase-free的離心管中。4.2.3 RNA 提取4.2.3.1 向上清中加入 1 倍體積的 70%乙醇，渦旋徹底混勻，分散沉淀，將得到的溶液和沉淀起加入離心柱中，12000g離心30s，棄掉流出液。4.2.3.2向離心柱中加入 500ul CB4,室溫12000g

27、離心30s,棄掉流出液。4.2.3.3去除基因組：向離心柱中英加入80ul的DNase I工作液，室溫放置 15min,向離心柱中再次加入500ul CB4,室溫12000g離心30s棄掉流出液。4.2.3.4離心柱中加入 500ul WB4,室溫12000g離心30s，棄掉流出液；重復(fù)該步驟一次。4.2.3.5室溫12000g離心2min,徹底去除殘留的乙醇，在室溫敞開靜置數(shù)分鐘徹底晾干離心柱。4.2.3.6 將離心柱轉(zhuǎn)入一個(gè)新的 1.5ml RNase-free 的離心管中，并向離心柱中英加入 30-100ul37C預(yù)溫的 RNase-free Water,室溫靜置1min,然后室溫120

28、00g離心2min,洗脫RNA。4.2.3.7利用Nanodrop檢測(cè)所提RNA溶液濃度。RNA溶液儲(chǔ)存于-20 M -80 Q呆存待用。5記錄5.1內(nèi)外病毒 RNA因子檢測(cè)記錄 6修訂記錄序號(hào)版本號(hào)修訂內(nèi)容摘要修訂人/修訂日期病毒PCR法檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)操作程序I目的：規(guī)范質(zhì)量檢驗(yàn)中用 PCR法檢測(cè)病毒核酸的標(biāo)準(zhǔn)操作程序范圍：細(xì)胞產(chǎn)品中內(nèi)外病毒 DNA的檢測(cè)責(zé)任人：技術(shù)部?jī)?nèi)容4.1實(shí)驗(yàn)物品的準(zhǔn)備4.1.1儀器Nanodrop微型分光光度計(jì)、離心機(jī)、PCR儀、水平電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)4.1.2試齊U豬源病毒PCR試劑盒、HHV6/7試劑盒、牛細(xì)小病毒/牛腺病毒PCR試劑盒、瓊脂糖4.2實(shí)驗(yàn)步驟4.2.

29、1樣品DNA的制備用自選方法提取純化樣品的DNA，并檢測(cè) DNA 濃度，要求 A260/A280在1.8-2.0之間;A260/A230 大于 2。4.2.2對(duì)照設(shè)置將試劑盒自帶的陽(yáng)性對(duì)照稀釋1000倍，稀釋后濃度為105拷貝/ uL作為陽(yáng)性對(duì)照。以ddH20作為陰性對(duì)照。4.2.3 PCR 擴(kuò)增PCR體系如下:成分體積（uLL2 XPCR MagicMix 3.010病毒PCR引物混合液2DNA模板1ddH207總體積20PCR程序如下:過(guò)程溫度時(shí)間預(yù)變性95 C5 minPCR反應(yīng)（35個(gè)循環(huán)）最后延伸95 C15 sec55 C15 sec72 C20 sec72 C10 min4.2.

30、4電泳檢測(cè)取5卩L PCR產(chǎn)物，加樣到1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳。電壓為120V，時(shí)間為30 min。電泳結(jié)束，利用凝膠成像儀拍照。預(yù)期PCR產(chǎn)物陽(yáng)性對(duì)照有相應(yīng)的條帶出現(xiàn)，陰性對(duì)照無(wú)任何擴(kuò)增條帶，否則實(shí)驗(yàn)無(wú)效。5記錄5.1內(nèi)外病毒DNA因子檢測(cè)記錄 6修訂記錄序號(hào)版本號(hào)修訂內(nèi)容摘要修訂人/修訂日期病毒PCR法檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)操作程序H目的：規(guī)范質(zhì)量檢驗(yàn)中用 PCR法檢測(cè)病毒核酸的標(biāo)準(zhǔn)操作程序范圍：細(xì)胞產(chǎn)品中病毒 RNA的檢測(cè)責(zé)任人：技術(shù)部?jī)?nèi)容4.1實(shí)驗(yàn)物品的準(zhǔn)備4.1.1儀器Nanodrop微型分光光度計(jì)、離心機(jī)、PCR儀、水平電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)4.1.2試齊U牛病毒性腹瀉病毒/牛副流感/牛呼腸弧病毒P

31、CR試劑盒、瓊脂糖4.2實(shí)驗(yàn)步驟4.2.1樣品RNA的制備用自選方法提取純化樣品的RNA，并檢測(cè)RNA濃度.4.2.2 RNA質(zhì)量鑒定120V，時(shí)間30min.電泳結(jié)果要求濃度為1.5%的瓊脂糖凝膠電泳，電泳條件條件為：電壓28s和18s條帶清晰，且亮度符合 2： 1.表明RNA完整。4.2.3樣品檢測(cè)4.2.3.1逆轉(zhuǎn)錄逆轉(zhuǎn)錄體系:試劑用量（jiL）RNase-free water6.5dNT P( 2.5 mM each)45 X RT buffer4BVDV_F/BVDV_R(10卩Ma各0.5Ribonu clease In hibitor(50U/ 卩 L)0.5RNA b3Reve

32、rse Tran scri ptase1Total20逆轉(zhuǎn)錄程序:溫度（C）時(shí)間（min）25104230855423.2 PCR 擴(kuò)增PCR體系:試劑用里（jiL2 X M ix Taq DNA聚合酶10ddH2O8正向引物BVDV_F （ 10 小0.5反向引物BVDV_R （10 小0.5逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)產(chǎn)物1以含相應(yīng)DNA片段的質(zhì)粒為陽(yáng)性對(duì)照，以出0為陰性對(duì)照。PCR程序:溫度（C）時(shí)間（s）循環(huán)數(shù)953009530355530721072604.2.4電泳檢測(cè)取5卩L PCR產(chǎn)物，加樣到1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳。電壓為120V，時(shí)間為30 min。電泳結(jié)束，利用凝膠成像儀拍照。預(yù)期PCR產(chǎn)物

33、陽(yáng)性對(duì)照有相應(yīng)的條帶出現(xiàn)，陰性對(duì)照無(wú)任何擴(kuò)增條帶，否則實(shí)驗(yàn)無(wú)效。5記錄5.1內(nèi)外病毒 RNA因子檢測(cè)記錄 6修訂記錄序號(hào)版本號(hào)修訂內(nèi)容摘要修訂人/修訂日期未經(jīng)允許不得復(fù)印仃hUC-MSCs 免疫學(xué)反應(yīng)檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)操作程序1目的：規(guī)范質(zhì)量檢驗(yàn)中檢測(cè)hUC-MSCS寸T淋巴細(xì)胞增殖抑制及 Th1/Th17/Treg亞群影響的標(biāo)準(zhǔn)操2范圍：hUC-MSCS寸T淋巴細(xì)胞增殖抑制及 Th1亞群影響3 責(zé)任人： 技術(shù)部4 內(nèi)容4.1 實(shí)驗(yàn)物品的準(zhǔn)備儀器：潔凈工作臺(tái)，倒置相差顯微鏡，細(xì)胞培養(yǎng)箱，酶標(biāo)儀，離心機(jī)，移液槍，流式細(xì)胞儀試劑&耗材：CD3磁珠分選試劑盒， 刀豆蛋白A （ConA） , MTT檢測(cè)

34、試劑盒，DMSO培養(yǎng)基，胰酶,PBS 臺(tái)盼藍(lán)染色液，流式抗體anti-human 丫 -IFN , anti-human CD3 anti-human CD8, anti-丫 -IFN、TNF-a ELISA 試human CD4,anti-human IL-17A,anti-human CD127,anti-human CD25劑盒， 96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板4.2 實(shí)驗(yàn)步驟4.2.1實(shí)驗(yàn)共分為兩批次。第一批次用于檢測(cè)hUC-MSCs對(duì)異體人外周血 T淋巴細(xì)胞的抑制作用，設(shè)4組：陰性對(duì)照組（不同濃度的T淋巴細(xì)胞）；陽(yáng)性對(duì)照組（ConA環(huán)同濃度的T淋巴細(xì)胞）；實(shí)驗(yàn)組（ConA環(huán)同濃度的T淋巴細(xì)胞與h

35、UC-MSC共孵育培養(yǎng)），T淋巴細(xì)胞（T）與hUC-MSCsS S）比例T:S分別為100:1、50:1、10:1、1:1 ;空白對(duì)照組（單獨(dú)hUC-MSCS。接種96孔細(xì)胞培養(yǎng)板,體系為200卩1/孔，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，于37 C、5%a養(yǎng)箱培養(yǎng)3天。通過(guò) MTT法檢測(cè)hUC-MSCs對(duì)異體人外周血 T淋巴細(xì)胞的抑制作用。第二批次用于hUC-MSCs對(duì)異體人外周血 T淋巴細(xì)胞抑制作用后Th1淋巴細(xì)胞的流式檢測(cè)，設(shè)2組：陽(yáng)性對(duì)照組（Co nA環(huán)同濃度的T淋巴細(xì)胞），實(shí)驗(yàn)組（ConA+不同濃度的T淋巴細(xì)胞與hUC-MSCs共孵育培養(yǎng)，T:S比例分別為100:1、50:1、10:1、1:1 ）,培

36、養(yǎng) 3 天后 anti-human丫 -IFN , anti-human CD3 anti-human CD8, anti-human CD4,anti-humanIL-17A,a nti-huma nCD127,a nti-huma n CD25 與各組細(xì)胞結(jié)合，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè) Th1/Th17/Treg淋巴細(xì)胞亞群，培養(yǎng)液用丫 -IFN和TNF-a ELISA試劑盒測(cè)定胞包因子分泌量。每批次實(shí)驗(yàn)重復(fù)次。4.2.2 實(shí)驗(yàn)操作4.2.2.1 hUC-MSCs 鋪層未經(jīng)允許不得復(fù)印23細(xì)胞接種：接種 96 孔培養(yǎng)板，根據(jù)共培養(yǎng)所需接種hUC-MSCs計(jì)算孔數(shù)，每個(gè)不同的比例T：S 設(shè)置 3

37、個(gè)平行孔，共計(jì) 12 孔，接種相同量的 hUC-MSCs貼壁后S 24小時(shí)），經(jīng) 60Co射線12.5Gy(1Gy/min)照射去除其增殖分化能力，去除培養(yǎng)液備用。4.222 人外周血CD3+T淋巴細(xì)胞的制備采集外周血10ml,分離PBMC細(xì)胞。添加CD3磁珠孵育30min，過(guò)柱分選得到 CD3+T淋巴細(xì)胞。室溫1000rpm離心10分鐘，洗2次。以臺(tái)盼藍(lán)染色法進(jìn)行活細(xì)胞計(jì)數(shù)，細(xì)胞活性率需在99%以上。用不含血清的 hUC-MSCs專用培養(yǎng)基培養(yǎng)調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為1 X 106/ml，室溫放置備用。4.2.2.3細(xì)胞增殖抑制檢測(cè)根據(jù)T:S不同的比例，接種 200卩l(xiāng)備好的T淋巴細(xì)胞至hUC-MSC

38、S甫層照射后的96孔板實(shí)驗(yàn)組的各孔，除hUC-MSCs空白對(duì)照組外，根據(jù)實(shí)驗(yàn)組接種不同濃度的T細(xì)胞，對(duì)應(yīng)濃度設(shè)置陰性對(duì)照組和陽(yáng)性對(duì)照組，各孔添加備好的T淋巴細(xì)胞，體系定容至 200ul，然后置于37 C, 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；2小時(shí)后，陽(yáng)性對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組加入Co nA,終濃度為16 g/ml。培養(yǎng)3天后，每孔細(xì)胞加入 MTT( 5 mg/ml ) 50卩l(xiāng)。孵育4小時(shí)，離心棄上清，加入DMSO 10 l 振蕩 10min，充分溶解后上酶標(biāo)儀， A492比色測(cè)OD值。結(jié)果判斷：以各濃度平均OD值計(jì)算增殖抑制率(Supp ressionRate, SR): SR= 1-(實(shí)驗(yàn)組OD值-空白對(duì)

39、照組 OD值-陰性對(duì)照組 OD值)/邙日性對(duì)照組 OD直-陰性對(duì)照組 ODB)X 100%以細(xì)胞增殖抑制率大于 30%且與陽(yáng)性對(duì)照組比較 P<0.05為有抑制作用。4.2.2.4 流式與ELISA檢測(cè)接種200卩l(xiāng)備好的T淋巴細(xì)胞至hUC-MSC鋪層照射后的96孔板實(shí)驗(yàn)組的各孔，同時(shí)設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照組，各孔添加200卩l(xiāng)/孔備好的T細(xì)胞，置于37C, 5% CO2t養(yǎng)箱中培養(yǎng)；2小時(shí)后，各孔加入ConA,終濃度為16 1 g/ml ;培養(yǎng)至第3天，收集細(xì)胞分別加入流式抗體anti-human 丫 -IFN , anti-humanCD3 anti-human CD8, anti-human

40、CD4,anti-human IL-17A,anti-human CD127,anti-human CD25等；室溫孵育30min, PB就滌離心，之后添加固定劑固定 15min,再次用PBS洗滌，接著添加破膜劑及流式抗體anti-human 丫 -IFN再次室溫孵育20min，按照流式細(xì)胞術(shù)標(biāo)準(zhǔn)四色熒光檢測(cè)法上機(jī)檢測(cè);離得到的培養(yǎng)上清，用 ELISA試劑盒分別測(cè)定胞外丫-IFN、TNF-a分泌的含量。5記錄5.1免疫學(xué)反應(yīng)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)記錄6修訂記錄序號(hào)版本號(hào)修訂內(nèi)容摘要修訂人/修訂日期未經(jīng)允許不得復(fù)印25hUC-MSCs成骨誘導(dǎo)分化標(biāo)準(zhǔn)操作程序目的：規(guī)范hUC-MSCs成骨誘導(dǎo)分化標(biāo)準(zhǔn)操作程序范

41、圍：hUC-MSCs成骨誘導(dǎo)分化操作責(zé)任人：技術(shù)部?jī)?nèi)容4.1試劑耗材4.1.1儀器:生物安全柜，二氧化碳培養(yǎng)箱，離心機(jī)，細(xì)胞計(jì)數(shù)儀，倒置顯微鏡，冰箱，電動(dòng)移液器，移液槍4.1.2耗材:EP管，1000卩、1 100卩、1 10 移液槍及槍頭,15ml 1 50ml 離心管，5ml、10ml 移液未經(jīng)允許不得復(fù)印29管，24孔板4.1.3試齊1:培養(yǎng)基，成骨分化試劑盒，茜素紅S, PBS,dH204.2實(shí)驗(yàn)步驟4.2.1試劑耗材：實(shí)驗(yàn)前將培養(yǎng)基、誘導(dǎo)成骨完全培養(yǎng)基從4 C冰箱取出，放置室溫。4.2.2 hUC-MSCs懸液計(jì)數(shù)后用培養(yǎng)基緩慢吹打重懸細(xì)胞，根據(jù)鋪板密度35x103 個(gè)/cm2，對(duì)

42、24孔板進(jìn)行鋪板（板底面積2 cm2），即6 x1031 x104個(gè)/孔，培養(yǎng)2-4天，促進(jìn)成骨分化能力，保證細(xì)胞融合度在6080%。4.2.3 48h后從培養(yǎng)箱中取出 24孔板，小心吸去培養(yǎng)基，槍頭勿觸板底，每孔加入1ml PBS，沿板壁緩緩打入后晃動(dòng) 24孔板洗滌細(xì)胞，棄掉 PBS。4.2.4每孔加入1ml常溫預(yù)熱的成骨誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基，放置37 C, 5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。每三天換液，每次加入常溫成骨誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基1ml/孔。4.2.5誘導(dǎo)分化條件下，細(xì)胞成骨誘導(dǎo)分化培養(yǎng)20-28天。4.2.6染色過(guò)程：小心吸去培養(yǎng)基，槍頭勿觸板底，每孔加入1ml PBS洗滌細(xì)胞，棄掉 PBS。重

43、復(fù)洗滌三次。每孔加入 0.5ml 4%多聚甲醛，固定30 min，棄掉4%多聚甲醛，PBS洗滌1-3次。然后每孔加入茜素紅 S,染色完當(dāng)天拍照。5記錄：成骨誘導(dǎo)分化檢測(cè)記錄6修訂記錄序號(hào)版本號(hào)修訂內(nèi)容摘要修訂人/修訂日期PBS4 C冰箱取出，放置室溫。4.2.2 hUC-MSCs懸液計(jì)數(shù)后用培養(yǎng)基緩慢吹打重懸細(xì)胞,根據(jù)鋪板密度35x103 個(gè)/cm2，對(duì) 24孔板進(jìn)行鋪板（板底面積2 cm2），即6 x1031 x104個(gè)/孔,培養(yǎng)2-4天，促進(jìn)成脂分化能力，保證細(xì)胞融合度在6080%。4.2.3 48h后從培養(yǎng)箱中取出 24孔板，小心吸去培養(yǎng)基，槍頭勿觸板底，每孔加入1ml PBS，沿板壁緩

44、緩打入后晃動(dòng) 24孔板洗滌細(xì)胞，棄掉 PBS。4.2.4每孔加入1ml常溫預(yù)熱的成脂誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基ADP1，放置37 C, 5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。誘導(dǎo)3天后換液，吸去原有培養(yǎng)基，每孔加入1ml常溫成脂誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基 ADP2 ; ADP2誘導(dǎo)一天后，吸去 ADP2培養(yǎng)基，更換成脂誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基ADP1繼續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)；試劑盒中ADP1-ADP2交替誘導(dǎo)3-5次后，根據(jù)需求對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色和后續(xù)鑒定。4.2.5 MSC分化條件下，成脂誘導(dǎo)為14-21 天。目的：規(guī)范hUC-MSCs成脂誘導(dǎo)分化標(biāo)準(zhǔn)操作程序范圍：hUC-MSCs成脂誘導(dǎo)分化操作責(zé)任人：技術(shù)部?jī)?nèi)容4.1實(shí)驗(yàn)試劑耗材4.1.1儀器：

45、生物安全柜，二氧化碳培養(yǎng)箱，離心機(jī)，細(xì)胞計(jì)數(shù)儀，熒光倒置顯微鏡，組織倒置 顯微鏡，冰箱，電動(dòng)移液器，移液槍4.1.2耗材：EP管，1000卩、1 100卩、1 10 移液槍及槍頭，15ml、50ml離心管，5ml、10ml移液 管，24孔板,4.1.3試劑：培養(yǎng)基，成脂誘導(dǎo)分化試劑盒，油紅O,4.2實(shí)驗(yàn)步驟4.2.1試劑耗材：實(shí)驗(yàn)前將培養(yǎng)基、誘導(dǎo)成脂完全培養(yǎng)基從1ml PBS洗滌細(xì)胞，棄掉 PBS。重4.2.6染色過(guò)程：小心吸去培養(yǎng)基，槍頭勿觸板底，每孔加入 復(fù)洗滌三次。每孔加入 0.5ml 4%多聚甲醛，固定30 min，棄掉4%多聚甲醛，PBS洗滌1-3次。然后 每孔加入油紅0,染色完當(dāng)天

46、拍照。5記錄：成脂誘導(dǎo)分化檢測(cè)記錄 6修訂記錄序號(hào)版本號(hào)修訂內(nèi)容摘要修訂人/修訂日期hUC-MSCs 成軟骨誘導(dǎo)分化標(biāo)準(zhǔn)操作程序目的： 規(guī)范 hUC-MSCs 成軟骨誘導(dǎo)分化標(biāo)準(zhǔn)操作程序范圍： hUC-MSCs 成軟骨誘導(dǎo)分化操作責(zé)任人： 技術(shù)部?jī)?nèi)容4.1 實(shí)驗(yàn)試劑耗材4.1.14.1.2儀器：生物安全柜，二氧化碳培養(yǎng)箱，離心機(jī)，細(xì)胞計(jì)數(shù)儀，熒光倒置顯微鏡，組織倒置顯微 鏡，冰箱，電動(dòng)移液器，移液槍 耗材：EP管，1000卩1& 100卩I&10 移液槍及吸頭，15ml&50ml 離心管，5ml&10ml移液管,24 孔板，4.1.3試劑：培養(yǎng)基，成軟骨誘導(dǎo)分化

47、試劑盒，阿利新藍(lán)染色，4%多聚甲醛， 100% 、95% 、80% 、70% 、30%各不同濃度酒精， PBS，中性樹脂。未經(jīng)允許不得復(fù)印#4.2 實(shí)驗(yàn)步驟4.2.1試劑耗材準(zhǔn)備及溶液配制：實(shí)驗(yàn)前將培養(yǎng)基、誘導(dǎo)成軟骨誘導(dǎo)分化試劑盒和配套因子放置室溫進(jìn)行溫度平衡，根據(jù)試劑盒使用說(shuō)明書，配制預(yù)混液及誘導(dǎo)完全培養(yǎng)基。4.2.2準(zhǔn)備所需誘導(dǎo)分化的 hUC-MSCs ，細(xì)胞沉淀用成軟骨誘導(dǎo)預(yù)混液重懸， 150g 離心 5 min ，沉淀以預(yù)混液重懸，細(xì)胞密度約1 X 106 cells/ml，再次離心，棄上清；沉淀以成軟骨誘導(dǎo)完全培養(yǎng)基重新懸浮，調(diào)整細(xì)胞密度為1 X 106 cells/ml。分別取50

48、0 細(xì)胞懸液接種于15ml離心管中，150g離心5min，旋松離心管蓋，將離心管輕輕豎直置于37 C、5% CO2 培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。4.2.3誘導(dǎo)培養(yǎng) 24 小時(shí)后，輕輕撥動(dòng)離心管底，使細(xì)胞沉淀團(tuán)塊懸浮，重新放回培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。4.2.4誘導(dǎo) 72h 后，細(xì)胞球狀明顯可見(jiàn)，此時(shí)，更換成軟骨誘導(dǎo)完全培養(yǎng)基，同時(shí)小心吸取細(xì)胞球轉(zhuǎn)移至 24 孔板中培養(yǎng)，之后每間隔 2 天更換新鮮完全誘導(dǎo)培養(yǎng)基。換液時(shí)輕輕吸取舊培養(yǎng)基，每孔加新鮮配制的成軟骨分化完全培養(yǎng)基500卩。4.2.5誘導(dǎo)培養(yǎng) 20 天，棄去培養(yǎng)上清， DPBS 洗細(xì)胞兩次， 4%中性多聚甲醛溶液 2 ml/ 孔室溫固定細(xì)胞 1 小時(shí)。4.2

49、.6棄去固定液， DPBS 洗 2 次，脫水、石蠟包埋后切片（此操作外送第三方處理）。4.2.7阿利新藍(lán)染色：將切片進(jìn)行脫臘和復(fù)水，阿利新藍(lán)染液染色30min ，流水沖洗 5min ，脫水、透明、中性樹膠封片，顯微鏡下觀察、拍照。5 記錄： 成軟骨誘導(dǎo)分化檢測(cè)記錄細(xì)胞計(jì)數(shù)臺(tái)盼藍(lán)染色法標(biāo)準(zhǔn)操作程序6修訂記錄序號(hào)版本號(hào)修訂內(nèi)容摘要修訂人/修訂日期未經(jīng)允許不得復(fù)印35目的：規(guī)范細(xì)胞計(jì)數(shù)臺(tái)盼藍(lán)染色標(biāo)準(zhǔn)操作程序范圍：各類細(xì)胞計(jì)數(shù)及活率測(cè)定責(zé)任人：技術(shù)部?jī)?nèi)容4.1試劑耗材4.1.1儀器耗材：CountSTAR計(jì)數(shù)儀、移液槍、計(jì)數(shù)板、無(wú)菌槍頭、EP管等;4.1.2試劑：PBS、臺(tái)盼蘭染色液。4.2實(shí)驗(yàn)步驟4

50、.2.1供試品處理制備細(xì)胞為單細(xì)胞懸液，并且適應(yīng)稀釋。4.2.2染色 細(xì)胞懸液與0.4%臺(tái)盼藍(lán)染色液以9: 1混合均勻，吸取10ul混合液加入計(jì)數(shù)板槽中。4.2.3計(jì)數(shù)計(jì)時(shí)靜置等待2min,通過(guò)CountSTAR計(jì)數(shù)儀讀數(shù)活細(xì)胞、總細(xì)胞及活率。4.2.4統(tǒng)計(jì)計(jì)算總細(xì)胞量：總細(xì)胞 =活細(xì)胞*稀釋倍數(shù)*體積。5記錄5.1細(xì)胞計(jì)數(shù)及活率測(cè)定實(shí)驗(yàn)記錄6修訂記錄序號(hào)版本號(hào)修訂內(nèi)容摘要修訂人/修訂日期細(xì)胞周期檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)操作程序目的： 規(guī)范質(zhì)量檢驗(yàn)中細(xì)胞周期檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)操作范圍： 細(xì)胞培養(yǎng)各階段周期的檢測(cè)責(zé)任人： 技術(shù)部?jī)?nèi)容4.1 實(shí)驗(yàn)物品的準(zhǔn)備4.1.1試劑：胰酶、PBS、培養(yǎng)基、臺(tái)朌蘭染色液、細(xì)胞周期與細(xì)胞

51、凋亡檢測(cè)試劑盒、預(yù)冷PBS 、70% 乙醇4.1.2 耗材：5 mL 移液管、15 mL 離心管、200 卩 L & 1000 槍頭、1.5 mL EP 管、Countstars細(xì)胞計(jì)數(shù)板4.1.3 儀器：混勻儀、電熱恒溫水槽、臺(tái)式離心機(jī)、流式細(xì)胞儀、CountSTAR 計(jì)數(shù)儀、生物安全柜、電動(dòng)移液槍、手動(dòng)微量移液槍4.2 實(shí)驗(yàn)步驟4.2.1 供試品處理4.2.1.1 新鮮培養(yǎng)的 hUC-MSCs 貼壁生長(zhǎng)至第 3天對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期和融合達(dá)到 80%-90% ，以0.125%胰酶消化處理，收集所得細(xì)胞懸液，用 D-PBS 洗滌一遍后，在室溫下以臺(tái)盼蘭染色法進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)并檢測(cè)活率。4.2.1.2 根據(jù)計(jì)數(shù)每個(gè)樣本取約 50 萬(wàn)左右細(xì)胞至 1.5mlEP 管中，加入約 1 毫升冰浴預(yù)冷的PBS，重懸細(xì)胞，再次離心沉淀細(xì)胞，離心結(jié)束后小心吸除上清