褪黑素對睡眠的調節(jié)作用及與腦內氨基酸遞質的關系

1、    褪黑素對睡眠的調節(jié)作用及與腦內氨基酸遞質的關系        摘要目的：研究褪黑素促眠、晝夜節(jié)律作用及其與腦內氨基酸遞質的關系。方法：以翻正反射為指標研究褪黑素對小鼠睡眠及其晝夜節(jié)律的影響。采用紙電泳-雙波長掃描法，測定褪黑素對小鼠不同腦區(qū)中-氨基丁酸(GABA)和谷氨酸(Glu)含量的影響。結果：褪黑素能明顯促進小鼠睡眠，其藥效強度依賴于給藥的時辰。褪黑素可使小鼠下丘腦內-氨基丁酸含量明顯升高。但對谷氨酸水平無明顯影響。結論：褪黑素促眠作用可能與小鼠下丘腦中-氨基丁

2、酸含量升高有關。關鍵詞褪黑素；睡眠；晝夜節(jié)律；-氨基丁酸；谷氨酸The effects of melatonin on sleep and its relationship with amino acid neurotransmitters in brain in miceWang Fang(Wang F),Li Jingcai(Li JC),Xu Feng(Xu F),et al(Shenyang Pharmaceutical University Chronobiology Laboratory,Shenyang 110016)ABSTRACTOBJECTIVE：To study the

3、effects of melatonin(MT) on sleep and amino acid neurotransmitters in brain.METHODS:To determine the sleep time and circadian sleep rhythm by observing the loss of the righting reflex method in mice.The concentration of amino acid neurotransmitters(GABA,Glu) in brain was determined by the paper elec

4、trophoretic and dual wavelength thin layer scanning method.RESULTS:Melatonin could significantly prolong sleep time induced by sodium pentobarbital and markedly elevate the level of GABA but not of Glu in hypothalamus.CONCLUSION:It supposed that the effect of melatonin on sleep might be related to e

5、levated level of GABA which is one of its mechanisms in mice.KEY WORDSmelatonin,sleep,circadian rhythm,GABA,glutamic acid褪黑素(melatonin,MT)主要由松果腺分泌，具有多種生物活性。自其人工合成并作為保健食品上市以來，國內外掀起褪黑素研究熱潮。在褪黑素諸多功能中，其誘導自然生理性睡眠，矯正紊亂的睡眠-覺醒節(jié)律的作用尤為引人注目。但也有些實驗發(fā)現(xiàn)某時間點或某種實驗條件下，褪黑素并未起到促眠作用，人們對褪黑素是否具有直接促眠作用仍存在爭議。目前關于褪黑素通過何種途徑來調

6、節(jié)睡眠尚不甚清楚。本文通過褪黑素誘導睡眠的晝夜節(jié)律性及褪黑素與不同腦區(qū)中氨基酸類神經遞質含量的關系來探討其促眠作用。1材料與方法1.1藥品與儀器褪黑素(江蘇常州醫(yī)藥技術開發(fā)公司，純度99.5%),戊巴比妥鈉(上海行知化工廠),-氨基丁酸(上海試劑三廠),L-谷氨酸(上?？颠_氨基酸廠),DYY-3型電泳儀(北京六一儀器廠),CS-910雙波長薄層掃描儀(日本島津制作所)。1.2實驗動物昆明種雄性小鼠,1822g(沈陽藥科大學動物室，動物合格證號：遼實動字第003號)。1.3統(tǒng)計處理各組計量資料以均數(shù)±標準差(±s)表示，組間比較采用t檢驗，各組質反應采用2檢驗顯著性。1.4褪

7、黑素對戊巴比妥鈉閾下催眠劑量的影響小鼠po褪黑素30min后，再ip戊巴比妥鈉25mg/kg,以翻正反射消失為指標,15min內翻正反射消失達1min以上的小鼠為發(fā)生睡眠的小鼠。同時做溶媒對照。實驗在安靜、室溫25左右進行，于08:00開始進行實驗。1.5褪黑素延長戊巴比妥鈉睡眠時間小鼠po褪黑素30min后，再ip戊巴比妥鈉40mg/kg。以翻正反射消失到恢復之間的時間為睡眠期。同時做溶媒對照。實驗在安靜、室溫25左右進行，于08:00開始實驗。1.6褪黑素對小鼠睡眠晝夜節(jié)律的影響于08:00,12:00,16:00,20:00,00:00,04:00六個時間點，分別觀察褪黑素延長小鼠戊巴比

8、妥鈉睡眠時間的變化，實驗方法同1.5。1.7褪黑素對小鼠不同腦區(qū)-氨基丁酸(GABA)和谷氨酸(Glu)的影響小鼠ip褪黑素30min后，斷頭處死，迅速取出下丘腦、大腦皮層或腦干。用三氯乙酸制成10%的勻漿,3000r/min離心10min，取上清液，加入正丁醇-石油醚振蕩，靜置數(shù)分鐘，在層析紙上點樣，然后在吡啶-醋酸-水電泳液中電泳30min。茚三酮-丙酮顯色后，用雙波長薄層掃描儀在510/700nm處掃描，與同時點樣的標準品對比，計算每克腦組織中GABA和Glu含量。于08:00開始實驗。2結果2.1褪黑素對戊巴比妥鈉閾下催眠劑量的影響小鼠隨機分為4組，戊巴比妥鈉閾下催眠劑量為25mg/k

9、g。由表1可見,po褪黑素120mg/kg可明顯增加小鼠入睡只數(shù)，對戊巴比妥鈉閾下催眠劑量有協(xié)同作用。表1褪黑素對戊巴比妥鈉閾下催眠劑量的影響/n=10組別劑量/mgkg-1入睡只數(shù)對照組-0安定58*1MT600MT1205*2注：與對照組比較,*1P0.01;*2P0.05 2.2褪黑素延長戊巴比妥鈉睡眠時間小鼠隨機分為4組。戊巴比妥鈉劑量為40mg/kg。由表2可見,po褪黑素30和15mg/kg均可顯著延長戊巴比妥鈉睡眠時間。表2褪黑素對戊巴比妥鈉睡眠時間的影響/±s,n=1012組別劑量/mgkg-1睡眠時間/min對照組-安定5*1MT30*1MT15*2注：與對照組比較

10、,*1P0.01;*2P0.05 2.3褪黑素對戊巴比妥鈉誘導睡眠晝夜節(jié)律的影響由1可見，對照組戊巴比妥鈉睡眠時間呈現(xiàn)節(jié)律性變化，峰值出現(xiàn)在12:00時，谷值在20:00時。施用褪黑素15mg/kg后可延長戊巴比妥鈉的睡眠時間，但延長的程度依賴于給藥時間，可見節(jié)律位相提前，峰值出現(xiàn)在08:00,谷值出現(xiàn)在16:00。褪黑素延長戊巴比妥鈉睡眠時間的作用因晝夜時辰而異。1褪黑素對小鼠睡眠晝夜節(jié)律的影響注：1-對照組；2-褪黑素；與對照組比較,*1P0.05;*2P0.01(n=10)2.4褪黑素對小鼠下丘腦、大腦皮層、腦干GABA含量的影響小鼠隨機分為3組。由表3可見，褪黑素15mg/kg能明顯升

11、高下丘腦中GABA的含量，但對其它腦區(qū)GABA含量的升高無明顯影響。表3褪黑素對不同腦區(qū)-氨基丁酸含量的影響/±s,n=68組別劑量/mgkg-1下丘腦/molg-1大腦皮層/molg-1腦干/molg-1對照組-MT15*MT5注：與對照組比較，*P0.05 2.5褪黑素對小鼠下丘腦、大腦皮層、腦干Glu含量的影響小鼠隨機分為3組。由表4可見，褪黑素15或5mg/kg對小鼠各腦區(qū)Glu含量無明顯影響。表4褪黑素對不同腦區(qū)谷氨酸含量的影響/±s,n=68組別劑量/mgkg-1下丘腦/molg-1大腦皮層/molg-1腦干/molg-1對照組-MT15MT53討論 內源性褪黑

12、素具有獨特的夜高晝低的合成與分泌節(jié)律，這種生理性節(jié)律受光周期控制，由于褪黑素午夜分泌最多，亦稱為“暗激素”1,它在調節(jié)晝夜節(jié)律如睡眠-覺醒方面起著重要的作用2。有些學者認為，褪黑素主要作用是調定睡眠發(fā)生的時間，糾正紊亂的睡眠-覺醒節(jié)律，而無直接催眠作用3。本實驗采用延長戊巴比妥鈉睡眠時間的方法來觀察褪黑素對睡眠的影響，每次實驗均采用專人觀察。結果發(fā)現(xiàn)單次給予褪黑素能提高戊巴比妥鈉閾下催眠劑量小鼠入睡的只數(shù)，延長戊巴比妥鈉睡眠時間，可見，單次給予褪黑素具有直接的催眠作用。多年來大多數(shù)動物及人體實驗肯定了褪黑素對睡眠的調節(jié)作用，但實驗結果并不一致，如James等(1987年)于夜間23:00給健康

13、成人口服褪黑素1,5mg/kg時，未發(fā)現(xiàn)褪黑素的催眠作用。本文通過褪黑素對延長小鼠睡眠的晝夜節(jié)律性實驗發(fā)現(xiàn)，褪黑素延長戊巴比妥鈉睡眠時間呈現(xiàn)晝夜節(jié)律性，褪黑素在不同時間點催眠效果有所不同，曲線峰值在08:00,谷值在16:00,分別為小鼠靜息相開始和后期。提示MT催眠作用具有晝夜時間依賴性。因此，在臨床應用MT時應注意MT的時間藥理特性，以發(fā)揮最佳效果。目前，對于褪黑素通過何種途徑調節(jié)睡眠所知甚少。已發(fā)現(xiàn)，褪黑素的許多中樞作用，如鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛、抗驚厥、抗焦慮等均與GABA能神經系統(tǒng)有關4。GABA是廣泛存在于哺乳類動物中樞神經系統(tǒng)的一種重要的抑制性神經遞質。側腦室注射-氨基丁酸可使貓睡眠時間延長

14、5，給視葉前區(qū)損傷或其它失眠模型的貓注射GABA擬似劑時，可使貓恢復睡眠6。另外，應用微透析技術發(fā)現(xiàn)，在睡眠時下丘腦后部GABA濃度升高6。這些實驗可說明腦內，特別是下丘腦中GABA參與睡眠-覺醒過程的調節(jié)。本實驗發(fā)現(xiàn)，催眠劑量的褪黑素能使下丘腦GABA含量升高，說明褪黑素的睡眠調節(jié)作用與下丘腦GABA含量有關。參與GABA合成的酶是谷氨酸脫羧酶(GAD)，GAD在神經系統(tǒng)中的分布與GABA水平相平行，并且，GAD活性強的部位GABA含量也高，GABA依賴于GAD來維持在神經系統(tǒng)中的穩(wěn)態(tài)水平。褪黑素是否通過增強GAD活力，增加GABA含量來調節(jié)睡眠?值得進一步證實。王芳(沈陽藥科大學時間生物學

15、室沈陽 110016)李經才(沈陽藥科大學時間生物學室沈陽 110016)徐峰(沈陽藥科大學時間生物學室沈陽 110016)何瑜(沈陽藥科大學時間生物學室沈陽 110016)唐超(沈陽藥科大學時間生物學室沈陽 110016)參考文獻1，Li JC,Xu F.Influence of light-dark shifting on the immune system,tumor growth and life span of rats,mice and fruit flies as well as on the counteraction of melatonin.Biol Signals,1997,6(2)77.2，汪曉飛，劉志民，彭樹勛.褪黑素：一個多功能的光周期信號.生理科學進展，1998，29(3)281.3，Tzischinsky O,Lavie P.Melatonin possesses time-dependent hypotic effects.Sleep,1994,17638.4，Golombek DA,Pevet P,Cardinali DP.Melatonin effects on behavior:Possible mediation by the central GAB