藥物定量分析與分析方法驗證課件

1、藥物定量分析與分析方法驗證第四章第四章 藥物定量分析藥物定量分析與分析方法驗證與分析方法驗證藥物定量分析與分析方法驗證第一節(jié)第一節(jié) 定量分析樣品的前處理方法定量分析樣品的前處理方法一、概述一、概述 有機(jī)金屬藥物：有機(jī)金屬藥物：金屬原子直接與碳原子以共價鍵金屬原子直接與碳原子以共價鍵相連，結(jié)合比較牢固，如醋酸苯汞、汞撒利相連，結(jié)合比較牢固，如醋酸苯汞、汞撒利含金屬的有機(jī)藥物含金屬的有機(jī)藥物：金屬原子不與碳原子直接相金屬原子不與碳原子直接相連，通常為有機(jī)酸及酚的金屬鹽或配位化合物連，通常為有機(jī)酸及酚的金屬鹽或配位化合物 。例：例：酒石酸銻鉀、葡萄糖酸銻鈉酒石酸銻鉀、葡萄糖酸銻鈉藥物定量分析與分析方

2、法驗證處理方法主要分為兩大類處理方法主要分為兩大類: : 不經(jīng)有機(jī)破壞的處理不經(jīng)有機(jī)破壞的處理 經(jīng)有機(jī)破壞的處理經(jīng)有機(jī)破壞的處理藥物定量分析與分析方法驗證二、不經(jīng)有機(jī)破壞的分析方法二、不經(jīng)有機(jī)破壞的分析方法( (一一) )直接測定法直接測定法 金屬原子不直接與碳原子相連的含金屬有金屬原子不直接與碳原子相連的含金屬有機(jī)藥物機(jī)藥物 某些某些CMCM鍵結(jié)合不牢固的有機(jī)金屬藥物鍵結(jié)合不牢固的有機(jī)金屬藥物 例：富馬酸亞鐵的含量測定。例：富馬酸亞鐵的含量測定。藥物定量分析與分析方法驗證( (二二) )經(jīng)水解后測定法經(jīng)水解后測定法1 1、堿水解后測定法、堿水解后測定法 適用范圍：適用范圍：含鹵素有機(jī)藥物結(jié)構(gòu)

3、中鹵素原子含鹵素有機(jī)藥物結(jié)構(gòu)中鹵素原子結(jié)合不結(jié)合不牢固牢固的藥物，如鹵素和脂肪碳鏈相連。的藥物，如鹵素和脂肪碳鏈相連。加加NaOHNaOH，加熱回流，加熱回流含有機(jī)結(jié)合的鹵素含有機(jī)結(jié)合的鹵素間接銀量法測定間接銀量法測定有機(jī)藥物有機(jī)藥物方法原理：方法原理：藥物水解藥物水解無機(jī)的鹵素離子無機(jī)的鹵素離子藥物定量分析與分析方法驗證例：三氯叔丁醇的含量測定 藥物定量分析與分析方法驗證2 2、水解后測定法、水解后測定法例：硬脂酸鎂的含量測定例：硬脂酸鎂的含量測定Mg(C17 H35COO)2 + H2SO4 定量、過量定量、過量2NaOH + H2SO4Na2SO4 + 2H2O MgSO4 + 2 C1

4、7 H35COOH過量剩余藥物定量分析與分析方法驗證( (三三) )經(jīng)氧化還原后測定法經(jīng)氧化還原后測定法 例：泛影酸、膽影酸等的含量測定例：泛影酸、膽影酸等的含量測定1 1、酸性或堿性還原后測定、酸性或堿性還原后測定鹵素結(jié)合在芳環(huán)上鹵素結(jié)合在芳環(huán)上藥物定量分析與分析方法驗證例：含銻藥物例：含銻藥物具有氧化性具有氧化性2 2、利用藥物中可游離的金屬離子的氧化性測定含量、利用藥物中可游離的金屬離子的氧化性測定含量 利用藥物中可游離出的金屬離子的利用藥物中可游離出的金屬離子的氧化性氧化性，在酸，在酸性溶液中氧化碘化鉀，性溶液中氧化碘化鉀，析出碘析出碘，再用硫代硫酸鈉滴，再用硫代硫酸鈉滴定析出的碘，以

5、測定含量。定析出的碘，以測定含量。藥物定量分析與分析方法驗證三、經(jīng)有機(jī)破壞的分析方法三、經(jīng)有機(jī)破壞的分析方法 適用于適用于金屬原子與碳原子結(jié)合牢固金屬原子與碳原子結(jié)合牢固的的有機(jī)金屬藥物，使有機(jī)結(jié)合狀態(tài)的金屬有機(jī)金屬藥物，使有機(jī)結(jié)合狀態(tài)的金屬及鹵素轉(zhuǎn)變?yōu)榭蓽y定的及鹵素轉(zhuǎn)變?yōu)榭蓽y定的無機(jī)化合物無機(jī)化合物，再，再選用適當(dāng)?shù)姆椒y定選用適當(dāng)?shù)姆椒y定。藥物定量分析與分析方法驗證（一）濕法破壞（一）濕法破壞（1 1） 硝酸硝酸- -高氯酸法高氯酸法 適用于適用于血、尿、組織血、尿、組織等生物樣品的破壞，等生物樣品的破壞，有機(jī)金屬藥物經(jīng)破壞后，得到的有機(jī)金屬藥物經(jīng)破壞后，得到的無機(jī)金屬離子無機(jī)金屬離子一

6、般呈高價態(tài)。一般呈高價態(tài)。 本法不能用于本法不能用于含氮雜環(huán)含氮雜環(huán)藥物的破壞藥物的破壞干法灼燒法干法灼燒法藥物定量分析與分析方法驗證（2） 硝酸硝酸- -硫酸法硫酸法 適用于大多數(shù)有機(jī)物質(zhì)的破壞，破壞得到適用于大多數(shù)有機(jī)物質(zhì)的破壞，破壞得到的無機(jī)金屬離子均為的無機(jī)金屬離子均為高價態(tài)。高價態(tài)。 不能用于含堿土金屬有機(jī)藥物的破壞不能用于含堿土金屬有機(jī)藥物的破壞藥物定量分析與分析方法驗證（3） 硫酸硫酸- -硫酸鹽法硫酸鹽法 加入加入濃硫酸濃硫酸作為氧化劑作為氧化劑 加入加入硫酸鹽硫酸鹽提高硫酸的沸點，增強(qiáng)硫酸提高硫酸的沸點，增強(qiáng)硫酸的氧化破壞能力，且防止硫酸的分解損失。的氧化破壞能力，且防止硫酸

7、的分解損失。 用于用于含砷或銻含砷或銻有機(jī)藥物的破壞，破壞有機(jī)藥物的破壞，破壞得到的無機(jī)金屬離子多為低價態(tài)得到的無機(jī)金屬離子多為低價態(tài)藥物定量分析與分析方法驗證注意點：注意點： 破壞操作要放在通風(fēng)櫥中進(jìn)行破壞操作要放在通風(fēng)櫥中進(jìn)行 試劑不含有被測金屬離子或干擾測定的組分試劑不含有被測金屬離子或干擾測定的組分 做空白試驗做空白試驗 破壞在凱氏燃燒瓶（硅或硼玻璃）中進(jìn)行破壞在凱氏燃燒瓶（硅或硼玻璃）中進(jìn)行藥物定量分析與分析方法驗證 ( (二二) )干法破壞干法破壞1 1、高溫?zé)胱品ā⒏邷責(zé)胱品康模耗康模?將有機(jī)物灼燒灰化以達(dá)分解的目的將有機(jī)物灼燒灰化以達(dá)分解的目的適用范圍：適用范圍：濕法不易破壞

8、完全的有機(jī)藥物，以濕法不易破壞完全的有機(jī)藥物，以及某些不能用硫酸進(jìn)行破壞的有機(jī)藥物及某些不能用硫酸進(jìn)行破壞的有機(jī)藥物 限制：限制：對于含易揮發(fā)性金屬（如汞、砷等）有機(jī)對于含易揮發(fā)性金屬（如汞、砷等）有機(jī)藥物不適用藥物不適用 注意事項：注意事項：（1 1）加熱或灼燒時，應(yīng)控制溫度在）加熱或灼燒時，應(yīng)控制溫度在420420以下以下（2 2）一定要灰化完全）一定要灰化完全（3 3）經(jīng)本法破壞后，所得灰分往往不易溶解，但）經(jīng)本法破壞后，所得灰分往往不易溶解，但不要輕易棄去不要輕易棄去藥物定量分析與分析方法驗證2 2、氧瓶燃燒法：、氧瓶燃燒法： 氧瓶燃燒法：將有機(jī)藥物放氧瓶燃燒法：將有機(jī)藥物放在充滿在充

9、滿氧氣氧氣的的密閉密閉的燃燒瓶中進(jìn)的燃燒瓶中進(jìn)行行燃燒燃燒，有機(jī)結(jié)構(gòu)部分分解為，有機(jī)結(jié)構(gòu)部分分解為COCO2 2和和H H2 2O O，用適當(dāng)?shù)奈找海眠m當(dāng)?shù)奈找何瘴杖紵a(chǎn)生待測物質(zhì)（已轉(zhuǎn)化為燃燒所產(chǎn)生待測物質(zhì)（已轉(zhuǎn)化為不同價態(tài)的氧化物）不同價態(tài)的氧化物）, , 然后根據(jù)然后根據(jù)待測物質(zhì)的性質(zhì)待測物質(zhì)的性質(zhì), , 然后采用相應(yīng)然后采用相應(yīng)的方法進(jìn)行鑒別、檢查或測定的方法進(jìn)行鑒別、檢查或測定. .藥物定量分析與分析方法驗證NaClHClOCl-RNaOH2 溶液溶液點燃點燃特點：特點： 適用于適用于含鹵素、硫、氮、硒含鹵素、硫、氮、硒等有機(jī)藥物的分析等有機(jī)藥物的分析 簡便、快速、破壞完

10、全，尤其適用于微量樣品的簡便、快速、破壞完全，尤其適用于微量樣品的分析分析藥物定量分析與分析方法驗證 （1 1）儀器裝置）儀器裝置 燃燒瓶燃燒瓶 一般為不同體積的磨口、硬一般為不同體積的磨口、硬質(zhì)玻璃錐形瓶，瓶塞嚴(yán)密、空質(zhì)玻璃錐形瓶，瓶塞嚴(yán)密、空心、底部熔封一根直徑為心、底部熔封一根直徑為lmmlmm鉑絲，鉑絲下端是網(wǎng)狀或螺旋鉑絲，鉑絲下端是網(wǎng)狀或螺旋狀，長度約為瓶身長度的狀，長度約為瓶身長度的2/32/3藥物定量分析與分析方法驗證 樣品制備：稱樣用材料及稱樣方法樣品制備：稱樣用材料及稱樣方法 無灰濾紙：無灰濾紙：用于固體樣品用于固體樣品 紙袋：紙袋：適用于液體樣品適用于液體樣品藥物定量分析與

11、分析方法驗證 吸收液吸收液A.A.作用：將樣品經(jīng)燃燒分解所產(chǎn)生的各種價態(tài)的作用：將樣品經(jīng)燃燒分解所產(chǎn)生的各種價態(tài)的鹵素、硫、氮、硒等，定量地吸收并轉(zhuǎn)變?yōu)楸沱u素、硫、氮、硒等，定量地吸收并轉(zhuǎn)變?yōu)楸阌跍y定的價態(tài)于測定的價態(tài)藥物定量分析與分析方法驗證B.B.吸收液的選擇吸收液的選擇待測元素待測元素燃燒產(chǎn)物燃燒產(chǎn)物吸收液吸收液氟氟氟化氫氟化氫水水氯氯氯化氫氯化氫水水NaOHNaOH溶液溶液溴溴單質(zhì)溴、溴化氫單質(zhì)溴、溴化氫水水NaOHNaOHSOSO2 2飽和溶液飽和溶液碘碘單質(zhì)碘、單質(zhì)碘、 少量少量I5+、I3+、I-1硝酸銀法：硝酸銀法：I-1，水水NaOHNaOHSOSO2 2飽和溶液飽和溶液間接

12、碘量法：水間接碘量法：水NaOHNaOH溶液溶液硫硫三氧化硫三氧化硫濃濃H H2 2O O2 2水液水液硒硒SeO2(少量少量SeO3)硝酸溶液硝酸溶液藥物定量分析與分析方法驗證、操作方法、操作方法A A、固定固定已稱好樣品的已稱好樣品的無灰濾紙或紙袋無灰濾紙或紙袋B B、燃燒瓶中加入規(guī)定量、燃燒瓶中加入規(guī)定量及種類的及種類的吸收液吸收液C C、用水把瓶口濕潤，小、用水把瓶口濕潤，小心急速通入氧氣，立即心急速通入氧氣，立即用表面皿蓋好用表面皿蓋好藥物定量分析與分析方法驗證D D、點燃濾紙或紙袋尾部，迅速放入裝、點燃濾紙或紙袋尾部，迅速放入裝有吸收液的燃燒瓶中，擰緊瓶蓋，用有吸收液的燃燒瓶中，擰

13、緊瓶蓋，用少量水封口少量水封口E E、待燃燒完全、無黑色、待燃燒完全、無黑色碎片后，充分混合，使碎片后，充分混合，使生成的煙霧被完全吸收生成的煙霧被完全吸收后，放置后，放置1515分鐘，再用分鐘，再用少量水沖洗瓶塞和鉑絲，少量水沖洗瓶塞和鉑絲，合并洗液和吸收液。合并洗液和吸收液。 用同樣的方法作空白用同樣的方法作空白試驗試驗藥物定量分析與分析方法驗證（2 2）注意事項）注意事項按規(guī)定方法操作按規(guī)定方法操作 根據(jù)供試品的取用量選擇不同的燃燒瓶根據(jù)供試品的取用量選擇不同的燃燒瓶 待分解樣品量待分解樣品量 燃燒瓶的體積燃燒瓶的體積 3 35mg5mg（微量分析）（微量分析） 150 150 250m

14、l250ml 20 20 30mg30mg（半微量分析）（半微量分析） 300 300 500ml500ml 50 50 60mg60mg 1000ml 1000ml 0.6 0.6 0.7g0.7g或更多或更多 2000ml 2000ml或特殊結(jié)構(gòu)或特殊結(jié)構(gòu)的燃燒瓶的燃燒瓶藥物定量分析與分析方法驗證藥物定量分析與分析方法驗證燃燒瓶要潔凈，不能殘留有機(jī)溶劑，不能用有燃燒瓶要潔凈，不能殘留有機(jī)溶劑，不能用有機(jī)潤滑劑涂抹瓶塞機(jī)潤滑劑涂抹瓶塞要有防爆措施要有防爆措施氧氣要充足，確保燃燒完全，產(chǎn)物不能有黑色氧氣要充足，確保燃燒完全，產(chǎn)物不能有黑色炭化物炭化物燃燒產(chǎn)生的煙霧要被完全吸收燃燒產(chǎn)生的煙霧要被

15、完全吸收 充分振搖和放置充分振搖和放置都是為了保證吸收完全都是為了保證吸收完全例：碘產(chǎn)生紫色煙霧；氯、氟產(chǎn)生白色煙霧，煙例：碘產(chǎn)生紫色煙霧；氯、氟產(chǎn)生白色煙霧，煙霧顏色完全消失后，即表示吸收完全霧顏色完全消失后，即表示吸收完全測定含氟有機(jī)化合物時要用石英燃燒瓶測定含氟有機(jī)化合物時要用石英燃燒瓶藥物定量分析與分析方法驗證4 4、應(yīng)用、應(yīng)用 含含鹵素、硫、磷、氟及硒鹵素、硫、磷、氟及硒等有機(jī)藥物的鑒別、等有機(jī)藥物的鑒別、雜質(zhì)的檢查及含量測定雜質(zhì)的檢查及含量測定例例 碘苯酯的含量測定碘苯酯的含量測定 ChPChP（20052005）原理原理 碘苯酯為有機(jī)碘化物，用氧瓶燃燒分解，碘苯酯為有機(jī)碘化物，用

16、氧瓶燃燒分解，轉(zhuǎn)變?yōu)榈饣?，繼而氧化為游離的碘，并被定轉(zhuǎn)變?yōu)榈饣?，繼而氧化為游離的碘，并被定量地吸收于吸收液（氫氧化鈉），生成碘化物量地吸收于吸收液（氫氧化鈉），生成碘化物與碘酸鹽，加入溴與碘酸鹽，加入溴- -醋酸溶液，使全部轉(zhuǎn)變?yōu)榈獯姿崛芤?，使全部轉(zhuǎn)變?yōu)榈馑猁}，過量的溴以甲酸及通空氣去除。加入碘酸鹽，過量的溴以甲酸及通空氣去除。加入碘化鉀，使與碘酸鹽反應(yīng)析出游離碘，用硫代硫化鉀，使與碘酸鹽反應(yīng)析出游離碘，用硫代硫酸鈉液滴定，碘與淀粉結(jié)合所顯的藍(lán)色消失即酸鈉液滴定，碘與淀粉結(jié)合所顯的藍(lán)色消失即為終點為終點藥物定量分析與分析方法驗證碘苯酯（有機(jī)碘化物）碘苯酯（有機(jī)碘化物）氧瓶燃燒氧瓶燃燒碘化物

17、碘化物氧化氧化碘化物與碘酸鹽碘化物與碘酸鹽游離碘游離碘紫色煙霧紫色煙霧氫氧化鈉吸收液氫氧化鈉吸收液加溴加溴- -醋酸液醋酸液碘酸鹽碘酸鹽過量，以甲酸及通空氣除去碘化鉀碘化鉀游離碘游離碘硫代硫酸鈉硫代硫酸鈉淀粉淀粉 終點終點藍(lán)色消失藍(lán)色消失溶液中要標(biāo)定藥物定量分析與分析方法驗證例：例： 氧瓶燃燒法中的裝置有：氧瓶燃燒法中的裝置有： 磨口硬質(zhì)玻璃錐形瓶磨口硬質(zhì)玻璃錐形瓶 B. B. 磨口軟質(zhì)玻璃錐形瓶磨口軟質(zhì)玻璃錐形瓶C. C. 鉑絲鉑絲D. D. 鐵絲鐵絲E. E. 鋁絲鋁絲藥物定量分析與分析方法驗證例：選擇氧瓶燃燒法所必備的實驗物品例：選擇氧瓶燃燒法所必備的實驗物品磨口硬質(zhì)玻璃錐形瓶磨口硬質(zhì)玻

18、璃錐形瓶 B. B. 鉑絲鉑絲C. C. 普通濾紙普通濾紙D. D. 氫氣氫氣 E. E. 無灰濾紙無灰濾紙藥物定量分析與分析方法驗證第二節(jié)第二節(jié) 定量分析方法的特點定量分析方法的特點一、容量分析法一、容量分析法（一）特點（一）特點原理：原理： aA + xX cC + dD aA + xX cC + dD 標(biāo)準(zhǔn)溶液標(biāo)準(zhǔn)溶液被測物質(zhì)被測物質(zhì)藥物定量分析與分析方法驗證容量分析的化學(xué)反應(yīng)必須滿足的條件：容量分析的化學(xué)反應(yīng)必須滿足的條件：（1 1）反應(yīng)要有一定的化學(xué)計量關(guān)系，并且要能定）反應(yīng)要有一定的化學(xué)計量關(guān)系，并且要能定量地完成量地完成（2 2）反應(yīng)速度要快，即反應(yīng)在瞬間完成）反應(yīng)速度要快，即反

19、應(yīng)在瞬間完成（3 3）必須要有合適的確定滴定終點的方法）必須要有合適的確定滴定終點的方法 滴定分析法滴定分析法: :酸堿滴定法酸堿滴定法; ;沉淀滴定法沉淀滴定法 配位滴定法配位滴定法; ;氧化還原法；氧化還原法； 非水溶液滴定法等非水溶液滴定法等藥物定量分析與分析方法驗證（二）計算（二）計算1 1、滴定度的定義、滴定度的定義 滴定度：滴定度：指每指每1 ml1 ml規(guī)定濃度的滴定液相當(dāng)于規(guī)定濃度的滴定液相當(dāng)于被測物質(zhì)的量，以被測物質(zhì)的量，以 T T 表示，中國藥典以表示，中國藥典以mgmg表表示示 例：每例：每1ml1ml的滴定液（的滴定液（0.5mol/l0.5mol/l）相當(dāng)于）相當(dāng)于7

20、2.06mg72.06mg苯甲酸鈉苯甲酸鈉藥物定量分析與分析方法驗證2 2、滴定度（、滴定度（T T）的計算）的計算aA + bB cC + dD aA + bB cC + dD MbammlmgT )/(待測物待測物滴定液滴定液式中：式中：mm滴定液的摩爾濃度，滴定液的摩爾濃度，mol/lmol/l M- M-待測物的毫摩爾質(zhì)量（分子量）待測物的毫摩爾質(zhì)量（分子量） a a、bb分別為被測物、滴定液的摩爾數(shù)分別為被測物、滴定液的摩爾數(shù)定義定義藥物定量分析與分析方法驗證3 3、 含量計算含量計算（1 1）直接滴定法）直接滴定法%100 WVT藥藥物物的的百百分分含含量量規(guī)規(guī)定定滴滴定定液液濃濃

21、度度得得滴滴定定液液濃濃度度）實實際際滴滴定定液液濃濃度度（標(biāo)標(biāo)定定 F%100%100 WFTVWTV含含量量實際滴定度（或校正滴定度）實際滴定度（或校正滴定度）TT的計算的計算 T=TT=T* *F F 其中其中每每1 ml1 ml標(biāo)準(zhǔn)溶液相標(biāo)準(zhǔn)溶液相當(dāng)于被測物質(zhì)的量當(dāng)于被測物質(zhì)的量藥物定量分析與分析方法驗證%100%100 標(biāo)標(biāo)示示量量平平均均片片重重標(biāo)標(biāo)示示量量平平均均片片重重片片劑劑：標(biāo)標(biāo)示示量量WFTVWTVmlVVFTVVTVOO量取注射劑的體積，標(biāo)示量標(biāo)示量注射劑：標(biāo)示量:%100%1000藥物定量分析與分析方法驗證(2)(2)間接滴定法間接滴定法1 1）生成物滴定法）生成物滴

22、定法 計量滴定液消耗的量，計算供試品的含量計量滴定液消耗的量，計算供試品的含量 計算同直接滴定法計算同直接滴定法 DCBBA化化合合物物滴滴定定液液化化合合物物化化合合物物供供試試品品試試劑劑藥物定量分析與分析方法驗證 2 2）回滴定法（剩余滴定法）回滴定法（剩余滴定法） 原理：先在待測樣品溶液中加原理：先在待測樣品溶液中加定量、過量的滴定量、過量的滴定液定液A A，使它和樣品反應(yīng)，等反應(yīng)結(jié)束后，再，使它和樣品反應(yīng)，等反應(yīng)結(jié)束后，再用另一種用另一種滴定液滴定液B B來回滴剩余的滴定液來回滴剩余的滴定液A A。不做空白的含量計算不做空白的含量計算 %100)( WTFVFVBBAA含含量量特點：

23、特點：A A、B B兩種滴定液均需標(biāo)定兩種滴定液均需標(biāo)定藥物定量分析與分析方法驗證做空白的含量計算方法做空白的含量計算方法%100)( WFTVVBASBOB含含量量 特點：僅需標(biāo)定滴定液特點：僅需標(biāo)定滴定液B B的濃度的濃度藥物定量分析與分析方法驗證例例1：酸堿滴定法測定煙酸：酸堿滴定法測定煙酸片片含量。取本品（規(guī)格：含量。取本品（規(guī)格：0.1g/片）片）10片，精密稱定為片，精密稱定為1.584 0g，研細(xì)，精密稱取片粉，研細(xì)，精密稱取片粉0.332 9g,（約相當(dāng)于煙酸（約相當(dāng)于煙酸0.2g），加新沸過的冷蒸餾水），加新沸過的冷蒸餾水50mL，置水浴上加熱，并時時振搖，使煙酸溶解后，置水

24、浴上加熱，并時時振搖，使煙酸溶解后，冷卻至室溫，加酚酞指示劑冷卻至室溫，加酚酞指示劑3滴，用氫氧化鈉滴定液滴，用氫氧化鈉滴定液（0.100 5 mol/L)滴定，消耗滴定，消耗16.90mL。 1mL氫氧化鈉滴定液（氫氧化鈉滴定液（ 0.1mol/L）相當(dāng)于）相當(dāng)于12.31mgC6H5NO2。問：本品是否符合。問：本品是否符合中國藥典中國藥典規(guī)規(guī)定的含量限度（定的含量限度（中國藥典中國藥典規(guī)定，本品含規(guī)定，本品含C6H5NO2應(yīng)為標(biāo)示量的應(yīng)為標(biāo)示量的95.0%105.0%)藥物定量分析與分析方法驗證二、光譜分析法二、光譜分析法紫外紫外可見分光光度法可見分光光度法1 1、比耳、比耳朗伯定律（朗

25、伯定律（BeerLambertBeerLambert定律）定律）A=EA=E* *C C* *L L BeerBeer定律說明吸收和濃度的關(guān)系定律說明吸收和濃度的關(guān)系 LambertLambert定律說明吸收和厚度的關(guān)系定律說明吸收和厚度的關(guān)系吸收系數(shù)：吸收系數(shù)：一定波長下，溶液濃度為：一定波長下，溶液濃度為1mol/l1mol/l，液層厚，液層厚度為度為1cm1cm時，物質(zhì)的吸收度時，物質(zhì)的吸收度-定性依據(jù)定性依據(jù) 10104 4，物質(zhì)有強(qiáng)吸收，物質(zhì)有強(qiáng)吸收 10102 210104 4 ，物質(zhì)具有中等強(qiáng)度吸收，物質(zhì)具有中等強(qiáng)度吸收 100100，物質(zhì)有弱吸收，物質(zhì)有弱吸收藥物定量分析與分析

26、方法驗證 ：一定波長下，溶液濃度為：一定波長下，溶液濃度為1%1%（W/VW/V），），液層厚度為液層厚度為1cm1cm時，物質(zhì)的吸收度時，物質(zhì)的吸收度- - -定量依據(jù)定量依據(jù) 兩者間的關(guān)系：兩者間的關(guān)系： 或或 %11cmE%1110cmEMMEcm10%11藥物定量分析與分析方法驗證2 2、對溶劑的要求、對溶劑的要求 溶劑的截止波長：使用范圍不能小于截止溶劑的截止波長：使用范圍不能小于截止使用波長使用波長 溶劑的純度：檢查所用溶劑在檢測波長處溶劑的純度：檢查所用溶劑在檢測波長處是否符合要求是否符合要求藥物定量分析與分析方法驗證3 3、含量測定、含量測定 測定要求測定要求: :空白對照：配

27、制供試品溶液的同批溶劑空白對照：配制供試品溶液的同批溶劑吸收池：吸收池：1cm1cm石英吸收池石英吸收池吸收波長：該品種項下規(guī)定波長吸收波長：該品種項下規(guī)定波長2nm2nm之內(nèi)之內(nèi)吸收值吸收值:0.3:0.30.7 (0.20.7 (0.20.8)0.8)藥物定量分析與分析方法驗證（1 1）對照品比較法）對照品比較法供試品的濃度為：供試品的濃度為：rrXXCAAC %100%100% WADCAWDCrrxX含含量量原料藥：原料藥：藥物定量分析與分析方法驗證%100% 標(biāo)標(biāo)示示量量平平均均片片重重片片劑劑：標(biāo)標(biāo)示示量量WADCArrx%100% 標(biāo)標(biāo)示示量量液液體體制制劑劑：標(biāo)標(biāo)示示量量VAV

28、DCArrx藥物定量分析與分析方法驗證（2 2）吸收系數(shù)法）吸收系數(shù)法 按規(guī)定方法配制供試品，在規(guī)定的波長按規(guī)定方法配制供試品，在規(guī)定的波長及吸收厚度下，測定吸收度，計算及吸收厚度下，測定吸收度，計算再按在相同條件下，標(biāo)準(zhǔn)對照品測到的再按在相同條件下，標(biāo)準(zhǔn)對照品測到的 計算含量：計算含量：%100%11%11rcmxcmEE含量xcmE%11rcmE%11注意：此法對儀器要求高，必須注意校正和檢定注意：此法對儀器要求高，必須注意校正和檢定 吸收系數(shù)吸收系數(shù) 100 100藥物定量分析與分析方法驗證（3 3）計算分光光度法）計算分光光度法 一般不宜用作含量一般不宜用作含量 測定（當(dāng)測定波長處于測

29、定（當(dāng)測定波長處于吸收曲線陡升或陡降部位時，對測定影響大）吸收曲線陡升或陡降部位時，對測定影響大）（4 4）比色法）比色法 供試品本身無吸收或有吸收但干擾大，可加供試品本身無吸收或有吸收但干擾大，可加入適當(dāng)?shù)娘@色劑后測定。入適當(dāng)?shù)娘@色劑后測定。 此法影響因素較多，實驗平行操作此法影響因素較多，實驗平行操作藥物定量分析與分析方法驗證例：對照品比較法測定卡馬西平含量。精密稱取本例：對照品比較法測定卡馬西平含量。精密稱取本品品0.050 3g,置置100mL量瓶中，加乙醇溶解并稀釋量瓶中，加乙醇溶解并稀釋到刻度，搖勻，精密量取到刻度，搖勻，精密量取2mL，置，置100mL量瓶中，量瓶中，加乙醇稀釋到

30、刻度，搖勻，作為供試品溶液；另加乙醇稀釋到刻度，搖勻，作為供試品溶液；另精密稱取卡馬西平對照品適量，用乙醇制成精密稱取卡馬西平對照品適量，用乙醇制成1mL中含中含10.3g的溶液，作為對照品溶液。取上述兩的溶液，作為對照品溶液。取上述兩種溶液，用種溶液，用1cm吸收池在吸收池在285 nm波長處測定，測波長處測定，測得供試品溶液吸光度為得供試品溶液吸光度為0.435，對照品溶液，對照品溶液A值為值為0.440。問本品是否符合。問本品是否符合中國藥典中國藥典規(guī)定的含量規(guī)定的含量限度（限度（中國藥典中國藥典規(guī)定，本品按干燥品計算，規(guī)定，本品按干燥品計算，含含C15H12N2O應(yīng)為標(biāo)示量的應(yīng)為標(biāo)示量

31、的97.0%103.0%)藥物定量分析與分析方法驗證三、色譜分析法三、色譜分析法（一）高效液相色譜法（一）高效液相色譜法1、對儀器的一般要求、對儀器的一般要求 固定相種類固定相種類 流動相組成：流動相組成： 注意：注意：使用使用C18時，流動相中含有的有機(jī)溶劑比時，流動相中含有的有機(jī)溶劑比例應(yīng)不低于例應(yīng)不低于5 檢測器檢測器 藥典中規(guī)定的固定相種類、流動相組成及藥典中規(guī)定的固定相種類、流動相組成及檢測器類型不能隨意改變檢測器類型不能隨意改變 藥物定量分析與分析方法驗證2、系統(tǒng)適用性試驗、系統(tǒng)適用性試驗 試驗指標(biāo)：試驗指標(biāo)：理論塔板數(shù)、分離度、理論塔板數(shù)、分離度、 重復(fù)性、拖尾因子重復(fù)性、拖尾因

32、子（1）色譜柱的理論塔板數(shù)）色譜柱的理論塔板數(shù)(n)（2）分離度）分離度(R) 注意：峰寬的概念注意：峰寬的概念（3）重復(fù)性：）重復(fù)性： 5次連續(xù)進(jìn)樣，次連續(xù)進(jìn)樣，RSD應(yīng)不應(yīng)不大于大于2.0藥物定量分析與分析方法驗證（4）拖尾因子（）拖尾因子（T）用峰高法定量：用峰高法定量：0.951.05用峰面積法定量：用峰面積法定量：105. 02dWTh 藥物定量分析與分析方法驗證3 3、測定法（大多數(shù)采用峰面積法）、測定法（大多數(shù)采用峰面積法）（1 1）內(nèi)標(biāo)法加校正因子測定供試品中主成分含量）內(nèi)標(biāo)法加校正因子測定供試品中主成分含量按各品種項下的規(guī)定，精密稱?。ɑ蛄咳。┧幬锇锤髌贩N項下的規(guī)定，精密稱取

33、（或量?。┧幬飳φ掌泛蛢?nèi)標(biāo)物質(zhì)，分別配成溶液，對照品和內(nèi)標(biāo)物質(zhì)，分別配成溶液，精密量取精密量取中在所配溶液，配制成測定校正因子中在所配溶液，配制成測定校正因子用的藥品對照品（含內(nèi)標(biāo)）用的藥品對照品（含內(nèi)標(biāo)）進(jìn)樣，記錄譜圖，得峰高（進(jìn)樣，記錄譜圖，得峰高（H H）或峰面積（）或峰面積（A A）RRSSCACAf校正因子R R表示藥物對照品表示藥物對照品 S S表示內(nèi)標(biāo)物表示內(nèi)標(biāo)物藥物定量分析與分析方法驗證配制含有內(nèi)標(biāo)的供試品溶液，進(jìn)樣，記錄譜圖，得峰配制含有內(nèi)標(biāo)的供試品溶液，進(jìn)樣，記錄譜圖，得峰面積（或峰高）面積（或峰高） SSXXCAAfC供試品濃度特點：特點：如果在配制測定校正因子和供試品溶

34、液時如果在配制測定校正因子和供試品溶液時用同一份內(nèi)標(biāo)物溶液，內(nèi)標(biāo)物質(zhì)不必精密稱定或用同一份內(nèi)標(biāo)物溶液，內(nèi)標(biāo)物質(zhì)不必精密稱定或量取。量取。 內(nèi)標(biāo)物不易尋找內(nèi)標(biāo)物不易尋找藥物定量分析與分析方法驗證%100 WCADAfSSX原原料料：含含量量%100 標(biāo)標(biāo)示示量量平平均均片片重重片片劑劑：標(biāo)標(biāo)示示量量WCADAfSSX藥物定量分析與分析方法驗證2 2、外標(biāo)法測定供試品中主成分含量、外標(biāo)法測定供試品中主成分含量兩種方法：標(biāo)準(zhǔn)曲線法和單點外標(biāo)法兩種方法：標(biāo)準(zhǔn)曲線法和單點外標(biāo)法（1 1）標(biāo)準(zhǔn)曲線法）標(biāo)準(zhǔn)曲線法 藥物定量分析與分析方法驗證注意兩點：注意兩點： 理論上講標(biāo)準(zhǔn)曲線應(yīng)該過原點，但由于存在理論上講

35、標(biāo)準(zhǔn)曲線應(yīng)該過原點，但由于存在系統(tǒng)誤差，會偏離原點，即系統(tǒng)誤差，會偏離原點，即A=a CA=a CX X +b +b 如果供試品為片劑，則含量應(yīng)該為標(biāo)示量的如果供試品為片劑，則含量應(yīng)該為標(biāo)示量的百分含量，計算方法為百分含量，計算方法為 藥物定量分析與分析方法驗證（2 2）單點外標(biāo)法：）單點外標(biāo)法： RxRxAACC 藥物定量分析與分析方法驗證 特點：特點：簡單，但要求簡單，但要求進(jìn)樣量準(zhǔn)確進(jìn)樣量準(zhǔn)確，操作條，操作條件穩(wěn)定件穩(wěn)定%100%100 標(biāo)標(biāo)示示量量標(biāo)標(biāo)示示量量片片劑劑：標(biāo)標(biāo)示示量量WWDAACWWDCRXRX%100% WDCX原原料料：含含量量藥物定量分析與分析方法驗證(二二)氣相色

36、譜法氣相色譜法1、對儀器的一般要求、對儀器的一般要求 色譜柱色譜柱種類：毛細(xì)管柱或填充柱種類：毛細(xì)管柱或填充柱 載氣：氮氣載氣：氮氣 檢測器：氫火焰離子化檢測器，檢測溫度檢測器：氫火焰離子化檢測器，檢測溫度一般高于柱溫，不得低于一般高于柱溫，不得低于150度度 藥典中規(guī)定的固定液品種、檢測器類型及藥典中規(guī)定的固定液品種、檢測器類型及特殊指定的色譜柱材料不能隨意改變特殊指定的色譜柱材料不能隨意改變藥物定量分析與分析方法驗證2 2、色譜系統(tǒng)適用性試驗：、色譜系統(tǒng)適用性試驗：3 3、測定方法、測定方法（1 1）內(nèi)標(biāo)法加校正因子測定供試品中主成分含量）內(nèi)標(biāo)法加校正因子測定供試品中主成分含量（2 2）外

37、標(biāo)法測定供試品中主成分含量）外標(biāo)法測定供試品中主成分含量（3 3）標(biāo)準(zhǔn)加入法測定供試品中主成分含量標(biāo)準(zhǔn)加入法測定供試品中主成分含量藥物定量分析與分析方法驗證 精密稱取待測成分對照品適量，配成對照品精密稱取待測成分對照品適量，配成對照品溶液，精密量取一定量加入到供試品溶液中，根溶液，精密量取一定量加入到供試品溶液中，根據(jù)外標(biāo)法或內(nèi)標(biāo)法測定含量。據(jù)外標(biāo)法或內(nèi)標(biāo)法測定含量。1 xisxxxxxxisAACCCCCAA注意：注意： 采用手工方式進(jìn)樣，建議使用內(nèi)標(biāo)法定量采用手工方式進(jìn)樣，建議使用內(nèi)標(biāo)法定量 采用自動進(jìn)樣，可用內(nèi)標(biāo)法或外標(biāo)法采用自動進(jìn)樣，可用內(nèi)標(biāo)法或外標(biāo)法 采用頂空進(jìn)樣，用標(biāo)準(zhǔn)加入法定量，

38、可消除基質(zhì)采用頂空進(jìn)樣，用標(biāo)準(zhǔn)加入法定量，可消除基質(zhì)效應(yīng)的影響效應(yīng)的影響藥物定量分析與分析方法驗證例：例：HPLC外標(biāo)法測定阿司匹林泡騰片含量。外標(biāo)法測定阿司匹林泡騰片含量。測定方法：取本品（規(guī)格：測定方法：取本品（規(guī)格：0.1g）10片，精密稱定為片，精密稱定為1.576 0g ,研細(xì)，精密稱取研細(xì)，精密稱取0.041 2g(約相當(dāng)于阿司匹林約相當(dāng)于阿司匹林25mg)，置，置100mL具塞錐形瓶中，精密加乙腈甲醇甲酸（具塞錐形瓶中，精密加乙腈甲醇甲酸（40 : 59 : 1）溶液）溶液50mL，強(qiáng)力振搖，強(qiáng)力振搖10min使阿司匹林溶解，迅速濾過，使阿司匹林溶解，迅速濾過，取續(xù)濾液作為供試品

39、溶液，精密量取取續(xù)濾液作為供試品溶液，精密量取10L注入液相色譜儀，注入液相色譜儀，記錄色譜圖；另取阿司匹林對照品適量，精密稱定，加乙記錄色譜圖；另取阿司匹林對照品適量，精密稱定，加乙腈甲醇甲酸（腈甲醇甲酸（40:59 : 1）溶液溶解制成）溶液溶解制成1mL中含有中含有0.52mg的溶液，作為對照品溶液，同法測定。測得供試品的溶液，作為對照品溶液，同法測定。測得供試品溶液峰面積溶液峰面積Ax為為154 756（三次測定均值），對照品溶液峰（三次測定均值），對照品溶液峰面積面積Ar為為155 076 （三次測定均值），按外標(biāo)法以峰面積計（三次測定均值），按外標(biāo)法以峰面積計算本品含量。問本品是否

40、符合算本品含量。問本品是否符合中國藥典中國藥典規(guī)定的含量限規(guī)定的含量限度（度（中國藥典中國藥典規(guī)定，本品含阿司匹林規(guī)定，本品含阿司匹林C9H8O4應(yīng)為標(biāo)示應(yīng)為標(biāo)示量的量的90.0%110.0%)藥物定量分析與分析方法驗證第三節(jié)第三節(jié) 藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗證藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗證目的：目的：證明所采用的分析方法適合于相應(yīng)的檢測證明所采用的分析方法適合于相應(yīng)的檢測要求，方法驗證過程和結(jié)果均應(yīng)記載在藥品標(biāo)要求，方法驗證過程和結(jié)果均應(yīng)記載在藥品標(biāo)準(zhǔn)起草和修訂說明中準(zhǔn)起草和修訂說明中用途：用途： 藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)起草時，分析方法需經(jīng)驗證藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)起草時，分析方法需經(jīng)驗證 藥物合成方法變更、制劑的組分變

41、更、原分藥物合成方法變更、制劑的組分變更、原分析方法進(jìn)行修訂時，分析方法需經(jīng)驗證析方法進(jìn)行修訂時，分析方法需經(jīng)驗證藥物定量分析與分析方法驗證需驗證的分析項目需驗證的分析項目1. 1. 鑒別試驗鑒別試驗2. 2. 雜質(zhì)定量或限度檢查雜質(zhì)定量或限度檢查3. 3. 原料或制劑中有效成分含量測定原料或制劑中有效成分含量測定4. 4. 制劑中其它成分（降解產(chǎn)物、防腐劑等）制劑中其它成分（降解產(chǎn)物、防腐劑等）的測定的測定5. 5. 溶出度、釋放度等功能檢查中的溶出量等溶出度、釋放度等功能檢查中的溶出量等的測試方法的測試方法藥物定量分析與分析方法驗證藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗證內(nèi)容有驗證內(nèi)容

42、有： 準(zhǔn)確度、精密度（重復(fù)性、中間精密度準(zhǔn)確度、精密度（重復(fù)性、中間精密度和重現(xiàn)性）、專屬性、檢測限、定量限、線和重現(xiàn)性）、專屬性、檢測限、定量限、線性、范圍和耐用性性、范圍和耐用性藥物定量分析與分析方法驗證一、準(zhǔn)確度一、準(zhǔn)確度 定義定義：表示分析結(jié)果與真實值接近的程度。準(zhǔn)：表示分析結(jié)果與真實值接近的程度。準(zhǔn)確度一般以百分回收率表示。確度一般以百分回收率表示。1.1.含量測定方法的準(zhǔn)確度含量測定方法的準(zhǔn)確度 （1 1）原料藥的含量測定）原料藥的含量測定 加入量加入量測得量測得量回收率回收率100 藥物定量分析與分析方法驗證（2 2）制劑的含量測定）制劑的含量測定已已知知制制劑劑各各組組分分加加

43、入入量量測測得得量量回回收收率率100 不不能能獲獲得得制制劑劑各各組組分分加加入入量量測測得得量量本本底底量量回回收收率率100 藥物定量分析與分析方法驗證2 2、雜質(zhì)定量測定的準(zhǔn)確度、雜質(zhì)定量測定的準(zhǔn)確度 可向原料藥或制劑中加入已知量雜質(zhì)進(jìn)行可向原料藥或制劑中加入已知量雜質(zhì)進(jìn)行測定測定 3 3、數(shù)據(jù)要求、數(shù)據(jù)要求 在規(guī)定范圍內(nèi)，至少用在規(guī)定范圍內(nèi)，至少用9 9次次測定結(jié)果進(jìn)行評價測定結(jié)果進(jìn)行評價 例如制備例如制備3 3個不同濃度的樣品，各測定個不同濃度的樣品，各測定3 3次次藥物定量分析與分析方法驗證要求：要求：（1 1）加入的對照品濃度應(yīng)為高、中、低三個濃度，）加入的對照品濃度應(yīng)為高、中

44、、低三個濃度，每個濃度測定三次，每個濃度測定三次，（2 2）UVUV和和HPLCHPLC法：法： 98%-102%98%-102%（3 3）容量分析法：）容量分析法： 99.7%-100.3%99.7%-100.3%藥物定量分析與分析方法驗證二、精密度二、精密度 精密度是指在規(guī)定的條件下，精密度是指在規(guī)定的條件下，同一個均勻同一個均勻樣樣品，經(jīng)過多次取樣測定所得結(jié)果之間的接近程品，經(jīng)過多次取樣測定所得結(jié)果之間的接近程度。度。（一）精密度的表示方法（一）精密度的表示方法 可用可用偏差偏差、標(biāo)準(zhǔn)偏差標(biāo)準(zhǔn)偏差或或相對標(biāo)準(zhǔn)偏差相對標(biāo)準(zhǔn)偏差 ( (變異變異系數(shù)系數(shù)) ) 表示表示藥物定量分析與分析方法驗

45、證1.1.偏差偏差 測量值與平均值的差稱為偏差，用測量值與平均值的差稱為偏差，用D D表示。偏差表示。偏差越大，精密度越低。越大，精密度越低。 XXd 測量值平均值測量值平均值偏差：偏差：%100100 XdRD平均值平均值偏差偏差相對偏差：相對偏差：根據(jù)分析所用的方法不同，允許的相對偏差不同根據(jù)分析所用的方法不同，允許的相對偏差不同藥物定量分析與分析方法驗證2.2.標(biāo)準(zhǔn)偏差標(biāo)準(zhǔn)偏差 標(biāo)準(zhǔn)偏差是偏差平方的統(tǒng)計平均值，又稱標(biāo)準(zhǔn)偏差是偏差平方的統(tǒng)計平均值，又稱為均方根偏差。當(dāng)測定次數(shù)為均方根偏差。當(dāng)測定次數(shù)n n為有限次時，標(biāo)為有限次時，標(biāo)準(zhǔn)偏差（準(zhǔn)偏差（s s）藥物定量分析與分析方法驗證3.3.

46、相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSDRSD） * *容量分析容量分析 法：法：0.2%0.2%（n=5n=5）* *UVUV法：法：1%1%（n=3n=35 5）* *HPLCHPLC法：法：2%2%（n=3n=35 5）變異系數(shù)變異系數(shù), ,通常用百分?jǐn)?shù)表示通常用百分?jǐn)?shù)表示 藥物定量分析與分析方法驗證（二）重復(fù)性、中間精密度和重現(xiàn)性（二）重復(fù)性、中間精密度和重現(xiàn)性1.1.重復(fù)性重復(fù)性 在規(guī)定的范圍內(nèi)，至少用在規(guī)定的范圍內(nèi)，至少用9 9次次測定結(jié)果進(jìn)行評測定結(jié)果進(jìn)行評價（三個不同濃度的樣品，各測定價（三個不同濃度的樣品，各測定3 3次）次）2.2.中間精密度中間精密度3.3.重現(xiàn)性重現(xiàn)性4.4.準(zhǔn)確度和精密度的關(guān)系準(zhǔn)