低密度脂蛋白膽固醇測定方法進(jìn)展

1、低密度脂蛋白膽固醇測定方法進(jìn)展     摘要 血清或血漿中低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）與冠心?。–DH）發(fā)生和動脈粥樣硬化損傷呈正相關(guān)，而且是美國國家膽固醇教育計(jì)劃（NCEP）作為脂類疾病分類和風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測的一個重要指標(biāo)。LDL-C也是選擇藥物治療和預(yù)后方面的一個十分有意義的臨床指標(biāo)，國內(nèi)外都在研究和開發(fā)行之有效、可靠的標(biāo)準(zhǔn)化測定方法。本文對其有關(guān)的測定方法和研究進(jìn)展作綜述。 關(guān)鍵詞：低密度脂蛋白膽固醇；方法學(xué)；心血管疾病 臨床和流行病學(xué)研究證明血清中LDL-C與冠狀動脈粥樣硬化有密切的正相關(guān)1。在1986年病理學(xué)家們就研究證明LDL-C濃度越高時(shí)動脈粥

2、樣硬化損傷的程度越大，粥樣硬化程度小時(shí)，測到血清中LDL-C也低2,3。 lDL是一組不均一的脂蛋白顆粒，一般認(rèn)為LDL的漂浮密度為1.0061.063，且包括了中間密度脂蛋白（LDL）1.0061.019及Lp(a)1.0501.080。LDL中蛋白含量約為2025，主要是載脂蛋白B-100（ApoB-100），而載脂蛋白E（ApoE）和載脂蛋白C（ApoC）含量很少。膽固醇的含量約是血清中總量的三分之二。LDL是通過受體途徑進(jìn)行降解，如過量時(shí)可以導(dǎo)致巨噬細(xì)胞和其他吞噬細(xì)胞變成泡沫細(xì)胞，這被認(rèn)為是與動脈粥樣硬化有關(guān)的因素。因此，LDL-C的測定結(jié)果直接影響到分類和治療。美國的NCEP專家組以

3、LDL-C濃度將成人、小孩、青少年各分為：成人在3.37mmol/L(1300mg/L)以下為合適水平，在3.374.12mmol/L(13001590mg/L)間作為中危水平，高于4.14mmol/L(1600mg/L)時(shí)作為高危水平；小孩和青少年在2.85mmol/L(1100mg/L)以下為合適水平，在2.853.34 mmol/L(11001290mg/L)為中危水平，高于3.37mmol/L(1300mg/L)為高危水平4。為提高LDL-C測檢水平，國內(nèi)外對LDL-C測定方法進(jìn)行廣泛的研究并不斷改善，現(xiàn)將有關(guān)方法研究進(jìn)展綜述如下： 1 等密度和密度梯度超速離心法 血清中的各種脂蛋白的

4、分離是LDL-C測定的一個重要環(huán)節(jié)。由于各種脂蛋白的大小、密度和組成及功能都有很大的不同。超速離心技術(shù)就是利用脂蛋白各種成分的密度不同將它們分離，是脂蛋白分離的主要方法。 1950年Delalla和Gofman首次報(bào)道等密度超速離心法。在實(shí)驗(yàn)室中一般采用Quantification（Q）法，它利用1.006的臨界分離液，在離心力為10900g時(shí)離心18h，將血漿分成上下兩部分，上清液為VLDL和乳糜顆粒，下面為IDL、LDL和HDL。用試管切開技術(shù)將上下液體分開。下面部分再采用化學(xué)沉淀法將HDL和LDL及IDL分開，分別用酶法測定膽固醇。這方法已被臨床實(shí)驗(yàn)室作為參考方法。而且還可以根據(jù)需要改變

5、分離液密度，當(dāng)密度提高為1.019，可以將IDL與LDL和HDL分開，也可提高到1.21，分離出HDL等。但在選擇脂蛋白分離切點(diǎn)系指它們與緩沖液混和物的密度，而不是脂蛋白自身的密度。 另外有報(bào)道用密度梯度超速離心法5。這種方法是將血清加入到已有不同密度梯度的分離液中，進(jìn)行超速離心后，血清中脂蛋白的各種成份可以轉(zhuǎn)移到各自相等密度的相等的區(qū)域。這種方法可以一次將脂蛋白中的各種成份分離。而不足之處是要求離心時(shí)間很嚴(yán)格，分開各種組份較困難。根據(jù)離心轉(zhuǎn)子的不同，可以分為水平轉(zhuǎn)子，垂直轉(zhuǎn)子以及固定角度轉(zhuǎn)子。水平轉(zhuǎn)子在實(shí)驗(yàn)中已被證明分離效果最好，但要求離心時(shí)間長（1766h）；垂直轉(zhuǎn)子可以縮短時(shí)間（45mi

6、n3h），由于轉(zhuǎn)動距離小，會有微量丟失；在等密度超速離心中首選固定角度轉(zhuǎn)子，如在密度梯度超速離心中使用時(shí)，離心時(shí)間要比垂直轉(zhuǎn)子稍長。 這兩種方法對實(shí)驗(yàn)室要求條件高，一般實(shí)驗(yàn)室都難以應(yīng)用。雖然現(xiàn)在有很多改良方法，克服了傳統(tǒng)方法的部分缺點(diǎn)，但分離的效果仍不能同傳統(tǒng)方法比。所有的超速離心法都有它們的局限性，它們所測得的結(jié)果仍是NCEP作為分類和治療的指標(biāo)。 2譜法 根據(jù)脂蛋白分子的大小和親和性有很大的不同，利用層析技術(shù)對脂蛋白進(jìn)行分離。目前有多種色譜儀和分離柱被用 于脂蛋白的分離。而瓊脂糖層析技術(shù)和Toya soda的高壓凝膠層析技術(shù)使用最普遍。這種方法是非破壞性，可以回收各種成份，有報(bào)道6LDL-

7、C的回收率可以達(dá)到8098，但穩(wěn)定性較差。目前這種技術(shù)也在不斷完善，但要求實(shí)驗(yàn)條件高，操作繁瑣，時(shí)間長，儀器昂貴，難以在臨床實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用。 3電泳 電泳技術(shù)是基于脂蛋白分子所帶的電荷和分子量大小不同進(jìn)行分離，早期這種技術(shù)在臨床實(shí)驗(yàn)室普遍用于定性分析，直接觀察血清脂蛋白譜?，F(xiàn)在已不再推廣使用，大量實(shí)驗(yàn)證明電泳電量法所得的結(jié)果不能令人滿意，并且發(fā)現(xiàn)與常規(guī)實(shí)驗(yàn)測得的結(jié)果有誤差。有報(bào)道7肝硬化膽道阻塞病人的血清脂蛋白譜顯示正常，而血清膽固醇濃度追憶忼于25.9mmol/L(10g/L)。因此還應(yīng)進(jìn)行總膽固醇（TC）測定。因?yàn)橛H脂性染料不能和游離膽固醇以及磷脂結(jié)合。另外，可以與超速離心法和化學(xué)沉淀法聯(lián)合使

8、用，經(jīng)分離后，進(jìn)行某一組份純度分析。免疫與電泳技術(shù)結(jié)合，可以大大提高準(zhǔn)確度；以及全自動電泳分析儀出現(xiàn)，在常規(guī)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行脂蛋白定量分析將成為可能。 4化學(xué)沉淀法 4.1肝素沉淀法肝素在pH值5.12檸檬酸緩沖液中可以沉淀LDL，使LDL與其它脂蛋白分離，然后進(jìn)行膽固醇測定。這種方法pH值很重要。pH值必須使LDL顆粒的脂蛋白所帶電荷剛為正值。由于VLDL和LDL等電點(diǎn)分別為4.7和5.4，pH值5.12±0.02時(shí)LDL剛好可以完全沉淀，而VLDL不沉淀。肝素沉淀法與定量電泳法有很好的一致性，但當(dāng)TG含量大于4.58mmol/L(4000mg/L)時(shí)，一致性相對降低。在型血漿脂蛋白增高

9、癥的病人血清中加沉淀劑時(shí)VLDL和Lp(a)與LDL發(fā)生共同沉淀，導(dǎo)致結(jié)果出現(xiàn)偏差。這種方法在TG低時(shí)，它有很好的精密度，變異系數(shù)小于3.5。與等密度超速離心法比較，當(dāng)TG濃度大于2.0mmol/L(1750mg/L)時(shí)，肝素法出現(xiàn)結(jié)果偏離4。近年Armstrong等8實(shí)驗(yàn)證明降低pH值到4.85時(shí)Lp(a)沉淀。 4.2聚乙烯硫酸（PVS）沉淀法含有EDTA的PVS可將血清中LDL沉淀。PVS沉淀LDL是非離子相互作用，pH值影響較小，pH值在38范圍內(nèi)均可以沉淀。因此，并不需要精確的pH值。沉淀劑中EDTA與血清中二價(jià)離子結(jié)合，阻止VLDL共同沉淀，而聚乙二醇獨(dú)甲醚（PEGME）加速LDL

10、形成小球，可縮短沉淀時(shí)間。Assmann等9實(shí)驗(yàn)證明PVS法可以將LDL同HDL、VLDL和LpX分離，但Lp(a)則完全同LDL共同沉淀，實(shí)際結(jié)果應(yīng)包括Lp(a)所含的膽固醇。當(dāng)血清中TG濃度小于4.2mmol/L（3680mg/L）時(shí)，與超速離心法有很好的一致性，但當(dāng)TG大于4.6mmol/L(4070mg/L)時(shí)，PVS法所得結(jié)果偏低，且隨TG濃度的升高誤差也隨著增大。當(dāng)血清TG低時(shí)，PVS法與其它所有方法都有很好的一致性，且有好的精確度，變異系數(shù)小于3.0。 4.3 多環(huán)表面活化法 本法采用pH值6.10的異吡唑緩沖液中非特異兩歧性聚合物使LDL沉淀，然后將沉淀物重新溶解直接測定LDL

11、-C或有TC與上清液膽固醇之差計(jì)算出。Moss等報(bào)道10此法與超速離心法和電泳法有很了的一致性，但與其他化學(xué)沉淀法一樣受血清中的TG濃度影響。 5Friedewald公式計(jì)算法 1972年Friedewald和Levy等首次提出用公式計(jì)算：LDLCTC(HDLCVLDLC），而VLDLCTG×0.45(mmol/L)或VLDLCTG×0.20(mg/L)。此公式是基于TG和比率恒定的情況與其它方法有很好的相關(guān)性，并要求空腹血清。如型血漿脂蛋白增高癥的病人血清VLDLC/TG變化很大，且TC、TG、HDLC測定結(jié)果的準(zhǔn)確性直接影響到LDLC結(jié)果。如血活中TG升高時(shí)，LDLC結(jié)

12、果偏低，型血漿脂蛋白增高癥病人的LVDLC/TG的比率高達(dá)到0.947(mmol/L)11,12。因此此公式在臨床上的運(yùn)用要求血清TG的濃度小于4.52mmol/L(4000mg/L)，否則會提供錯誤結(jié)果，會對分類和治療作出誤導(dǎo)。 6免疫結(jié)合分離法 這種方法根據(jù)血清脂蛋白中 所含有載脂蛋白的種類和數(shù)量的差異，制備有關(guān)載脂蛋白的抗體，通過免疫結(jié)合，達(dá)到相應(yīng)物質(zhì)的沉淀，得到所需的結(jié)果。由于LDL含絕大部分ApoB-100，達(dá)到98；而ApoA-I和apoE卻很微量。1993年Leary等13提出采用羊的多克隆抗Apo-A1和ApoE血清與乳膠顆粒結(jié)合，形成致敏劑，然后與脂蛋白的VLDL、HDL、I

13、DL、乳糜顆粒等結(jié)合沉淀，分離出LDL并用酶法測定膽固醇。與Q法作比較，空腹和非空腹血都有很好的一致性，相關(guān)系數(shù)分別為0.96和0.98，日內(nèi)變異系數(shù)小于3，日間變異系數(shù)小于4，后來Castellani等14采用Sigma提供的試劑進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果TG高于4.29mmol/L(3800mg/L)和HDL-C2.55mmol/L(990mg/L)時(shí)不影響LDL-C結(jié)果。而McNamara等15則認(rèn)為上清液放在-80冰凍時(shí)間越長，結(jié)果變化越大，如放置26周后，結(jié)果改變達(dá)-13.66±5.35%。而Pisani等16采用200l試劑加入30l血清或血漿旋轉(zhuǎn)混勻，在室溫放置510min，離心分

14、離上清液作LDL-C測定。且用本方法和Q法分別對177份血清進(jìn)行測定，兩方法的相關(guān)系數(shù)為0.980；分別對29份甘油三酯高于4.52mmol/L(4000mg/L)的血清進(jìn)行測定。相關(guān)系數(shù)為0.927。本方法有很好精密度，日內(nèi)和日間變異系數(shù)均小于3%。這種方法不要求用空腹血清，而且對高乳糜微粒血癥、高TG血癥和型血漿脂蛋白增高癥病人血清一樣可以精確測定。這種方法被美國NCEP專家們推薦為常規(guī)實(shí)驗(yàn)室測定的方法。 由上可知，目前測定LDL-C的各種方法仍存在各自的優(yōu)缺點(diǎn)，密度梯度超速離心法仍是目前認(rèn)定的參考方法，國外也有把等密度超速離心法和化學(xué)沉淀法相互結(jié)合的Q法作為金標(biāo)準(zhǔn)?；瘜W(xué)沉淀法設(shè)備簡單。較

15、易開展，但它們共同的一個特點(diǎn)，結(jié)果的準(zhǔn)確度與TG的水平有關(guān)，而且分離不夠完全。Friedewald公式計(jì)算法，要求空腹血清，且血清的TG、乳糜微粒濃度低時(shí)結(jié)果才能可靠。近年還有報(bào)道17此公式還受其它疾病的影響，化學(xué)沉淀法和Friedewald法得到LDL-CA結(jié)果，還包括Lp(a)-C的濃度，近年有報(bào)道18LDL-C和Lp(a)是反映血管疾病的兩個獨(dú)立因素，并提出應(yīng)分別測定，讓LDL-C和Lp(a)各自更好提供冠心病以及動脈粥樣硬化的臨床意義。免疫結(jié)合分離法是上述各種方法中一種操作和設(shè)備都較簡便的方法，不受血清的來源和血清中TG、乳糜微粒以及其它疾病的干擾，結(jié)果可靠適合于一般實(shí)驗(yàn)室使用，在國外

16、已有試劑盒提供，國內(nèi)由于試劑原因，還有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)推廣。 參考文獻(xiàn) 1 backorilk PS.Ross JW.Clin,1995;41(10):1414 2李健齋，陳曼麗，馬正中，等。中華心血管病雜志，1996；24（4）：278 3俞純山。中國實(shí)驗(yàn)診斷學(xué)雜志，1997；1（6）：13 4 rifai N,Warnick GR,McNamara JR,et al.Clin Chdm,1992;38(1):150 5 belcher JD,Egan JO,Bridgman G,et al.J Lipid Res,1991;32(2):359 6 rudel LL,Marzetta CA,Jo

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