血紅蛋白的提取和分離經(jīng)典

血紅蛋白的提取和分離經(jīng)典第1頁，共91頁，2023年，2月20日，星期二4、基本組成單位氨基酸5、氨基酸通式RHCCOOHNH26、氨基酸連接方式脫水縮合寫出氨基酸脫水縮合形成二肽示意圖第2頁，共91頁，2023年，2月20日，星期二氨基酸的結(jié)合方式CHCOOHR1CHNH2COOHR2NH2COHNHOH第3頁，共91頁，2023年，2月20日，星期二氨基酸的結(jié)合方式CHR1NH2OHCOH2OCHCOOHR2HNH第4頁，共91頁，2023年，2月20日，星期二氨基酸的結(jié)合方式:CHR1NH2COCHCOOHR2HNH2O二肽肽鍵脫水縮合第5頁，共91頁，2023年，2月20日，星期二氨基酸的結(jié)合方式:脫水縮合肽鍵CHCOOHR3HNOHHCCHR1NH2COCHR2HNO二肽H2OH2O第6頁，共91頁，2023年，2月20日，星期二氨基酸的結(jié)合方式:脫水縮合CCHR1NH2COCHR2HNO肽鍵二肽CHCOOHR3HNH2O肽鍵三肽以此類推，由多個(gè)氨基酸分子縮合而成的含有多個(gè)肽鍵的化合物，叫多肽（鏈狀）。肽鏈盤曲，折疊，形成有一定空間結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)分子。H2O第7頁，共91頁，2023年，2月20日，星期二8、分子結(jié)構(gòu)7、肽鍵CONH氨基酸肽鏈蛋白質(zhì)脫水縮合盤曲折疊（一條或者多條）第8頁，共91頁，2023年，2月20日，星期二10、生理功能細(xì)胞和生物體的結(jié)構(gòu)物質(zhì)，是人體發(fā)育和組織更新的主要原料，具有運(yùn)輸、調(diào)節(jié)、免疫、催化等作用，是一切生命活動(dòng)的主要承擔(dān)者氨基酸的種類不同；數(shù)目成百上千；排列順序變化多端；多肽鏈的空間結(jié)構(gòu)千差萬別9、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的多樣性第9頁，共91頁，2023年，2月20日，星期二①氨基酸間脫水縮合時(shí)，原來的氨基和羧基就不存在了，形成的化合物即多肽的一端只有一個(gè)氨基，另一端只有一個(gè)羧基（不計(jì)R基上的氨基和羧基）。所以對(duì)于一條多肽鏈說，至少應(yīng)有的氨基和羧基都是一個(gè)②若有個(gè)n氨基酸分子縮和成m條肽鏈,則可形成________個(gè)肽鍵,脫去______個(gè)水分子，至有氨基和羧基各____個(gè)11、相關(guān)計(jì)算n-mn-mm第10頁，共91頁，2023年，2月20日，星期二③蛋白質(zhì)可以含有一條或n條肽鏈、肽鏈通過化學(xué)鍵（如二硫鍵）互相連接，具有不同的空間結(jié)構(gòu)第11頁，共91頁，2023年，2月20日，星期二第12頁，共91頁，2023年，2月20日，星期二④關(guān)于蛋白質(zhì)相對(duì)分子量的計(jì)算：n個(gè)氨基酸形成m條肽鏈，每個(gè)氨基酸的平均相對(duì)質(zhì)量為a,那么由此形成的蛋白質(zhì)的相對(duì)分子量為______________n·a-(n-m)·18第13頁，共91頁，2023年，2月20日，星期二第14頁，共91頁，2023年，2月20日，星期二血紅蛋白第15頁，共91頁，2023年，2月20日，星期二思考1

高溫滅菌和酒精滅菌分別利用蛋白質(zhì)的何種作用，作用結(jié)果是什么被破壞？變性、變性、空間結(jié)構(gòu)思考2

人們用雞的紅細(xì)胞提取DNA，用人的紅細(xì)胞提取血紅蛋白的原因是什么？雞的紅細(xì)胞具有細(xì)胞核，含有DNA，便于進(jìn)行DNA的提取，人的紅細(xì)胞無細(xì)胞核，結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，血紅蛋白含量豐富便于提取血紅蛋白。第16頁，共91頁，2023年，2月20日，星期二本課題學(xué)習(xí)目標(biāo)

體驗(yàn)從復(fù)雜體系中提取生物大分子的基本過程和方法，并了解色譜法、電泳法等分離生物大分子的基本原理。1、主要概念：①凝膠色譜法②電泳法③緩沖溶液④它們?cè)谘t蛋白的提取中分別起到什么作用。2、主要原理：①凝膠色譜法分離蛋白質(zhì)的原理②電泳法分離樣品的原理③緩沖溶液的組成和作用機(jī)理3、課題重點(diǎn)：凝膠色譜法的原理和方法4、課題難點(diǎn)：

①樣品的處理②色譜柱填料的處理和色譜柱的裝填。第17頁，共91頁，2023年，2月20日，星期二

1、凝膠色譜法凝膠色譜法也稱為分配色譜法，它是根據(jù)分子量的大小分離蛋白質(zhì)的方法之一，又稱分子篩層析。凝膠實(shí)際上是一些微小的多孔球體，例如：浮石、瓊脂、瓊脂糖、聚乙烯醇、聚丙烯酰胺、葡聚糖凝膠等一、基本概念及原理第18頁，共91頁，2023年，2月20日，星期二原理：當(dāng)不同的蛋白質(zhì)通過凝膠時(shí)相對(duì)分子質(zhì)量較小相對(duì)分子質(zhì)量較大凝膠內(nèi)部的通道容易進(jìn)入無法進(jìn)入凝膠內(nèi)部的通道只能在凝膠外部移動(dòng)路程較長(zhǎng)移動(dòng)速度較慢路程較短移動(dòng)速度較快相對(duì)分子質(zhì)量不同的蛋白質(zhì)因此得以分離。第19頁，共91頁，2023年，2月20日，星期二4.凝膠色譜法分離蛋白質(zhì)的原理和具體過程第20頁，共91頁，2023年，2月20日，星期二凝膠色譜法分離蛋白質(zhì)過程的動(dòng)畫演示

第21頁，共91頁，2023年，2月20日，星期二第22頁，共91頁，2023年，2月20日，星期二二、緩沖溶液

在一定范圍內(nèi)，能夠抵制

對(duì)溶液PH值的影響，維持PH

不變。1.作用:2.配制:

通常由

溶解于水中配制而成。調(diào)節(jié)緩沖劑

的就可以制得在

使用的緩沖液。3.提問：在本課題中使用的緩沖液是:__________,其目的是:

利用緩沖液模擬細(xì)胞內(nèi)的PH環(huán)境，保證血紅蛋白的正常結(jié)構(gòu)和功能，便于觀察(紅色)和科學(xué)研究(活性)磷酸緩沖液外界的酸和堿基本1~2種緩沖劑使用比例不同PH范圍內(nèi)思考：說出人體血液中緩沖對(duì)。

NaH2PO4/Na2HPO4H2CO3/NaHCO3第23頁，共91頁，2023年，2月20日，星期二三、電泳血紅蛋白的分離鑒定方法1.概念：帶電粒子在

作用下發(fā)生

的過程。2.原理：

許多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有

的基團(tuán)，在一定的PH下，這些基團(tuán)會(huì)帶上

或

。在電場(chǎng)的作用下，這些帶電分子會(huì)向著的

的電極移動(dòng)。電泳利用了待分離樣品中各種分子

以及分子本身的

、

的不同，使帶電分子產(chǎn)生不同的

，從而實(shí)現(xiàn)樣品中各種分子的分離。3.類型:瓊脂糖凝膠電泳、聚丙稀酰胺凝膠電泳。電場(chǎng)遷移可解離正電負(fù)電與其所帶電荷相反帶電性質(zhì)的差異大小形狀遷移速度第24頁，共91頁，2023年，2月20日，星期二

最常用的電泳支持介質(zhì)是聚丙烯酰胺和瓊脂糖凝膠。瓊脂糖有一個(gè)相對(duì)較大的孔徑，用來分離大分子例如核酸、大蛋白和蛋白復(fù)合物，聚丙烯酰胺形成孔徑較小的膠，適合于分離大多數(shù)蛋白和小片段核酸。聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）第25頁，共91頁，2023年，2月20日，星期二

在電場(chǎng)的作用下，這些帶電分子會(huì)向著與其所帶電荷相反的電極移動(dòng)瓊脂糖凝膠電泳示意圖第26頁，共91頁，2023年，2月20日，星期二迷你雙垂直電泳槽等電聚焦多用電泳槽臥式電泳槽電泳槽9第27頁，共91頁，2023年，2月20日，星期二

（1）、蛋白質(zhì)在聚丙烯酰胺凝膠中的遷移率取決于

等因素。它所帶靜電荷的多少以及分子的大?。?）、SDS能與各種蛋白質(zhì)形成蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物，SDS所帶負(fù)電荷的量大大超過了蛋白質(zhì)分子原有電荷量。因而掩蓋了不同種蛋白質(zhì)間的電荷差別，使電泳遷移率完全取決于（）。分子的大小SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS）第28頁，共91頁，2023年，2月20日，星期二聚丙烯酰胺凝膠圓盤電泳示意圖

（A為正面，B為剖面）

1：樣品膠pH6.72：濃縮膠pH6.7

3：分離膠pH8.9

4：電極緩沖液pH8.310第29頁，共91頁，2023年，2月20日，星期二①瓊脂糖凝膠電泳操作簡(jiǎn)單，電泳速度快，樣品不需要事先處理；電泳后區(qū)帶易染色，樣品極易洗脫，便于定量測(cè)定。②測(cè)定蛋白質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量常用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，這是因?yàn)樵摲椒ǚ蛛x蛋白質(zhì)完全取決于分子的大小，而非所帶電荷的性質(zhì)和分子的大小、形狀。第30頁，共91頁，2023年，2月20日，星期二【典例1】有關(guān)凝膠色譜法和電泳法的說法正確的是A.它們都是分離蛋白質(zhì)的重要方法B.它們的原理相同C.使用凝膠色譜法需要使用緩沖溶液而電泳不需要D.以上說法都正確

【解題關(guān)鍵】解答本題的關(guān)鍵應(yīng)明確以下兩點(diǎn)：(1)凝膠色譜法的原理；(2)電泳法的原理。A第31頁，共91頁，2023年，2月20日，星期二二、實(shí)驗(yàn)步驟蛋白質(zhì)的提取和分離一般分為四步：樣品處理——粗分離——純化——純度鑒定（電泳）第32頁，共91頁，2023年，2月20日，星期二實(shí)驗(yàn)操作樣品處理（一）蛋白質(zhì)提取和分離步驟（二）操作過程紅細(xì)胞的洗滌粗分離：血紅蛋白的釋放分離血紅蛋白溶液純化：純度鑒定透析—去除樣品中分子量較小的雜質(zhì)用凝膠色譜法除去相對(duì)分子質(zhì)量較大的雜質(zhì)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳第33頁，共91頁，2023年，2月20日，星期二血液血漿水分其他物質(zhì)：血漿蛋白、無機(jī)鹽、磷脂、葡萄糖等血細(xì)胞白細(xì)胞血小板紅細(xì)胞（最多）血紅蛋白（90％）兩個(gè)α－肽鏈兩個(gè)β一肽鏈四個(gè)亞鐵紅素基團(tuán)2.血液有哪些成分？

1.用雞的紅細(xì)胞提取DNA，用哺乳動(dòng)物的紅細(xì)胞提取血紅蛋白的原因是什么？

雞的紅細(xì)胞具有細(xì)胞核，含有DNA，便于進(jìn)行DNA的提??；人的紅細(xì)胞無細(xì)胞核，結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，血紅蛋白含量豐富，便于提取血紅蛋白。血紅蛋白第34頁，共91頁，2023年，2月20日，星期二第35頁，共91頁，2023年，2月20日，星期二血紅蛋白兩個(gè)α－肽鏈兩個(gè)β一肽鏈四個(gè)亞鐵紅素基團(tuán)每個(gè)肽鏈環(huán)繞一個(gè)亞鐵血紅素基團(tuán)，此基團(tuán)可攜帶一分子氧或一分子二氧化碳，血紅蛋白因含有血紅素而呈紅色。血紅蛋白的特點(diǎn)：第36頁，共91頁，2023年，2月20日，星期二采集得到血液（加入抗凝血?jiǎng)幟仕徕c）第37頁，共91頁，2023年，2月20日，星期二（1）紅細(xì)胞的洗滌A、洗滌目的:B、分離時(shí)采用

離心，用

洗滌，重復(fù)洗滌

，直至

C、能否用蒸餾水代替生理鹽水？去除雜質(zhì)血漿蛋白，以利于后續(xù)步驟的分離純化低速短時(shí)間五倍體積的生理鹽水三次

上清液不再呈現(xiàn)黃色，表明紅細(xì)胞已洗滌干凈不能，生理鹽水能保持紅細(xì)胞的滲透壓而不至于破裂，若紅細(xì)胞提前破裂，使血紅蛋白與雜質(zhì)血漿蛋白混在一起，加大分離難度。第38頁，共91頁，2023年，2月20日，星期二初次離心后的結(jié)果3次洗滌后的結(jié)果第39頁，共91頁，2023年，2月20日，星期二（2）釋放血紅蛋白思考：釋放血紅蛋白過程中，在洗滌好的紅細(xì)胞加入了哪些物質(zhì)？為了加速釋放過程，采取了什么措施？

（使用磁力攪拌器充分?jǐn)嚢瑁┠康姆治觯赫麴s水的作用是______________________________。加入甲苯的作用是____________________________。充分?jǐn)嚢璧哪康氖莀___________________________。使紅細(xì)胞大量吸水脹裂溶解紅細(xì)胞的細(xì)胞膜加速紅細(xì)胞的破裂第40頁，共91頁，2023年，2月20日，星期二磁力攪拌器第41頁，共91頁，2023年，2月20日，星期二攪拌器轉(zhuǎn)子第42頁，共91頁，2023年，2月20日，星期二攪拌器正在工作第43頁，共91頁，2023年，2月20日，星期二（3）分離血紅蛋白溶液：

用濾紙過濾，除去脂溶性沉淀層，于分液漏斗中靜置片刻后，分出下層的紅色透明液體。第44頁，共91頁，2023年，2月20日，星期二甲苯層（無色透明）白色薄層固體紅色透明液體雜質(zhì)沉淀層（暗紅色）試管中溶液層次第45頁，共91頁，2023年，2月20日，星期二柜式離心機(jī)第46頁，共91頁，2023年，2月20日，星期二

2.粗分離透析（去除分子量較小的雜質(zhì)）（1）用

方法進(jìn)行粗分離，透析袋由半透膜制成，常用。將透析袋放入

溶液中進(jìn)行透析。（2）透析的原理是（3）透析的目的是

。

透析玻璃紙、腸衣、膀胱膜

透析袋能使小分子自由進(jìn)出，而將大分子保留在袋內(nèi)去除樣品中分子量較小的雜質(zhì)磷酸緩沖第47頁，共91頁，2023年，2月20日，星期二第48頁，共91頁，2023年，2月20日，星期二透析過程動(dòng)畫演示第49頁，共91頁，2023年，2月20日，星期二（1）凝膠色譜柱的制作①取長(zhǎng)40厘米，內(nèi)徑1.6厘米的玻璃管，兩端需用砂紙磨平。②底塞的制作：打孔挖出凹穴安裝移液管頭部覆蓋尼龍網(wǎng)，再用100目尼龍紗包好。

3、純化（凝膠色譜）去除相對(duì)分子量較大的雜質(zhì)蛋白

第50頁，共91頁，2023年，2月20日，星期二凝膠色譜柱的制作第51頁，共91頁，2023年，2月20日，星期二（2）凝膠色譜柱的裝填①凝膠的選擇：A、材料：交聯(lián)葡聚糖凝膠（G-75）。

②凝膠的前處理：配置凝膠懸浮液：計(jì)算并稱取一定量的凝膠浸泡于蒸餾水或洗脫液中充分溶脹后，配成凝膠懸浮液。③凝膠色譜柱的裝填方法：

A、固定：將色譜柱裝置固定在支架上。

B、裝填：將凝膠懸浮液一次性緩慢倒入色譜柱內(nèi)，裝填時(shí)輕輕敲動(dòng)色譜柱，使凝膠填裝均勻。注意：1、凝膠裝填時(shí)盡量緊密，以降低凝膠顆粒之間的空隙。2、裝填凝膠柱時(shí)不得有氣泡存在：因?yàn)闅馀輹?huì)攪亂洗脫液中蛋白質(zhì)的洗脫次序，降低分離效果。第52頁，共91頁，2023年，2月20日，星期二教材P70：為什么凝膠的裝填要緊密、均勻？如果裝填不夠緊密、均勻，就會(huì)在色譜柱內(nèi)形成無效的空隙，使本該進(jìn)入凝膠內(nèi)部的樣品分子從這些空隙中通過，攪亂洗脫液中蛋白質(zhì)的洗脫次序，影響分離的效果。思考第53頁，共91頁，2023年，2月20日，星期二裝配好的凝膠柱第54頁，共91頁，2023年，2月20日，星期二(3）樣品加入與洗脫①加樣前打開下端出口，使柱內(nèi)凝膠面上的（）緩慢下降到與（）平齊，關(guān)閉出口緩沖液凝膠面第55頁，共91頁，2023年，2月20日，星期二注意：正確的加樣操作是：1、不要觸及并破壞凝膠面。2、貼壁加樣。3、使吸管管口沿管壁環(huán)繞移動(dòng)。②加透析樣品第56頁，共91頁，2023年，2月20日，星期二第57頁，共91頁，2023年，2月20日，星期二第58頁，共91頁，2023年，2月20日，星期二步驟操作要求①②③④⑤立刻用磷酸緩沖液洗滌平衡12h洗滌平衡一次性緩慢倒入；輕輕敲打裝填懸浮液凝膠顆粒＋蒸餾水→充分溶脹根據(jù)色譜柱體積計(jì)算凝膠用量色譜柱垂直固定在支架上配制懸浮液計(jì)算稱量凝膠固定色譜柱材料：交聯(lián)葡聚糖凝膠G-75

20mmol/L磷酸緩沖液“G”表示什么？75代表什么？第59頁，共91頁，2023年，2月20日，星期二3.樣品的加入和洗脫

1.調(diào)液面2.加樣3.再調(diào)液面

4.洗脫5.收集緩沖液凝膠第60頁，共91頁，2023年，2月20日，星期二①調(diào)整緩沖液面：與凝膠面平齊②滴加透析樣品：加到色譜柱的（）③樣品滲入凝膠床：（）④再調(diào)整緩沖液面洗脫：⑤收集：待（）接近色譜柱底端時(shí)收集頂端樣品完全進(jìn)凝膠層紅色的蛋白質(zhì)色譜柱制作成功的標(biāo)志：紅色區(qū)帶均勻一致的移動(dòng)記第61頁，共91頁，2023年，2月20日，星期二4、純度鑒定（電泳）SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳判斷純化的蛋白質(zhì)是否達(dá)到要求，需要進(jìn)行蛋白質(zhì)的鑒定。1、垂直板電泳裝置2、穩(wěn)流穩(wěn)壓電泳儀；3、微量進(jìn)樣器（可用微量移液器代替）第62頁，共91頁，2023年，2月20日，星期二（1）、膠板的制備：①.將玻璃板用蒸餾水洗凈晾干②.把玻璃板在灌膠支架上固定好第63頁，共91頁，2023年，2月20日，星期二

（2）、分離膠的制備：

按下表制備分離膠(T=12%,pH=8.8)試劑雙蒸水分離膠緩沖液丙膠貯液ApTEMED

用量1.65mL1.3mL

2.0mL0.05mL0.002mL

膠灌至距梳子齒下端1cm→灌畢→封上一層水→當(dāng)膠與水出現(xiàn)清晰界限時(shí)表明聚合好。第64頁，共91頁，2023年，2月20日，星期二（3）、濃縮膠的制備：按下表制備濃縮膠(T=4%,pH=6.8)試劑雙蒸水濃縮膠緩沖液丙膠貯液ApTEMED用量1.46mL0.25mL 0.27mL0.02mL0.002mL

用濾紙吸干水→倒入濃縮膠→插入梳子→聚合。第65頁，共91頁，2023年，2月20日，星期二（4）、取樣

取純化后的血紅蛋白樣品10μL加入10μL上樣buffer（內(nèi)含少許溴酚藍(lán)的40％蔗糖）混勻。第66頁，共91頁，2023年，2月20日，星期二（5）裝槽、點(diǎn)樣：

拔出梳子→將膠板固定在電泳槽上（凹板一側(cè)向內(nèi)）→在電泳槽中加入緩沖液→點(diǎn)樣。第67頁，共91頁，2023年，2月20日，星期二第68頁，共91頁，2023年，2月20日，星期二（6）電泳：第69頁，共91頁，2023年，2月20日，星期二（7)、剝膠、染色及脫色

凝膠板剝離：電泳結(jié)束后，撬開玻璃板，將凝膠板做好標(biāo)記后放在大培養(yǎng)皿內(nèi)，加染色液染色，然后用脫色液脫色。第70頁，共91頁，2023年，2月20日，星期二(8)、結(jié)果第71頁，共91頁，2023年，2月20日，星期二

1、由于制備凝膠的丙烯酰胺和雙丙烯酰胺具有很強(qiáng)的神經(jīng)毒性，并且容易被皮膚吸收，因此操作必須在通風(fēng)櫥內(nèi)或通風(fēng)處進(jìn)行。

2、TEMED和過硫酸胺對(duì)黏膜和上呼吸道組織、眼睛、皮膚等有很大的破壞作用，吞服可致命。

3、在進(jìn)行電泳操作時(shí)一定按照實(shí)驗(yàn)要求和步驟完成。操作時(shí)要戴好一次性手套。注意事項(xiàng)：SDS—聚丙烯酰胺凝膠電泳第72頁，共91頁，2023年，2月20日，星期二影響蛋白質(zhì)分子運(yùn)動(dòng)速度的因素

決定運(yùn)動(dòng)方向電場(chǎng)作用力形成阻力決定運(yùn)動(dòng)速率電荷性質(zhì)電荷量分子形狀分子大小√√√√√√√第73頁，共91頁，2023年，2月20日，星期二思考下面的問題：讓血紅蛋白處在穩(wěn)定的pH范圍內(nèi)，維持結(jié)構(gòu)和功能正常。1、在血紅蛋白純化的整個(gè)過程中不斷用磷酸緩沖液處理的目的是什么？2、與其他蛋白質(zhì)相比，血紅蛋白有什么特點(diǎn)？這一特點(diǎn)對(duì)你進(jìn)行血紅蛋白的分離有什么啟示？血紅蛋白是有色蛋白，因此在凝膠色譜分離時(shí)可以通過觀察顏色來判斷什么時(shí)候應(yīng)該收集洗脫液。這使血紅蛋白的分離過程非常直觀，大大簡(jiǎn)化了實(shí)驗(yàn)操作。3、你能描述血紅蛋白分離的完整過程嗎？血紅蛋白提取和分離的程序可分為四大步，包括：樣品處理、粗分離、純化和純度鑒定。首先通過洗滌紅細(xì)胞、血紅蛋白的釋放、分離血紅蛋白溶液（離心）等操作收集到血紅蛋白溶液，即:樣品的處理；再經(jīng)過透析去除分子量較小的雜質(zhì)，即樣品的粗分離；然后通過凝膠色譜法將相對(duì)分子質(zhì)量較大的雜質(zhì)蛋白除去，即:樣品的純化；最后經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行純度鑒定。第74頁，共91頁，2023年，2月20日，星期二【典例2】(2011·揚(yáng)州高二檢測(cè))如圖表示血紅蛋白提取和分離的部分實(shí)驗(yàn)裝置，請(qǐng)回答下列問題：第75頁，共91頁，2023年，2月20日，星期二(1)血紅蛋白是人和其他脊椎動(dòng)物紅細(xì)胞的主要組成成分，其在紅細(xì)胞中的作用體現(xiàn)了蛋白質(zhì)具有____________功能。(2)甲裝置中，B是血紅蛋白溶液，則A是____________；乙裝置中，C溶液的作用是_____________________________。(3)甲裝置用于____________，目的是__________________________________。用乙裝置分離蛋白質(zhì)的方法叫____________，是根據(jù)_________________分離蛋白質(zhì)的有效方法。(4)用乙裝置分離血紅蛋白時(shí)，待_____________-_________時(shí)，用試管收集流出液，每5mL收集一管，連續(xù)收集。運(yùn)輸磷酸緩沖液洗脫血紅蛋白透析(粗分離)去除樣品中相對(duì)分子質(zhì)量較小的雜質(zhì)凝膠色譜法相對(duì)分子質(zhì)量的大小紅色的蛋白質(zhì)接近色譜柱底端第76頁，共91頁，2023年，2月20日，星期二

觀察你處理的血液樣品離心后是否分層（見教科書圖5-18），如果分層不明顯，可能是洗滌次數(shù)少、未能除去血漿蛋白的原因。此外，離心速度過高和時(shí)間過長(zhǎng)，會(huì)使白細(xì)胞和淋巴細(xì)胞一同沉淀，也得不到純凈的紅細(xì)胞，影響后續(xù)血紅蛋白的提取純度。三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析與評(píng)價(jià)

1、你是否完成了對(duì)血液樣品的處理？你能描述處理后的樣品發(fā)生了哪些變化嗎？2、你裝填的凝膠色譜柱是否有氣泡產(chǎn)生？你的色譜柱裝填得成功嗎？你是如何判斷的？

由于凝膠是一種半透明的介質(zhì)，因此可以在凝膠柱旁放一支與凝膠柱垂直的日光燈，檢查凝膠是否裝填得均勻。此外，還可以加入大分子的有色物質(zhì)，例如藍(lán)色葡聚糖—2000或紅色葡聚糖，觀察色帶移動(dòng)的情況。如果色帶均勻、狹窄、平整，說明凝膠色譜柱的性能良好。如果色譜柱出現(xiàn)紋路或是氣泡，輕輕敲打柱體以消除氣泡，消除不了時(shí)要重新裝柱。

第77頁，共91頁，2023年，2月20日，星期二

如果凝膠色譜柱裝填得很成功、分離操作也正確的話，能清楚地看到血紅蛋白的紅色區(qū)帶均勻、狹窄、平整，隨著洗脫液緩慢流出；如果紅色區(qū)帶歪曲、散亂、變寬，說明分離的效果不好，這與凝膠色譜柱的裝填有關(guān)。

3、你能觀察到蛋白質(zhì)的分離過程中紅色區(qū)帶的移動(dòng)嗎？請(qǐng)描述紅色區(qū)帶的移動(dòng)情況，并據(jù)此判斷分離效果？第78頁，共91頁，2023年，2月20日，星期二 教學(xué)反饋1．凝膠色譜法是根據(jù)（）分離蛋白質(zhì)的有效方法。A分子的大小B相對(duì)分子質(zhì)量的大小C帶電荷的多少D溶解度2．緩沖液的作用是：在一定范圍內(nèi)，抵制外界的影響來維持（）基本不變。A溫度BpHC滲透壓D氧氣濃度3．電泳是指帶電粒子在電場(chǎng)的作用下向著與其所帶電荷（）的電極移動(dòng)。A相同B相反C相對(duì)D相向4.哺乳動(dòng)物和人的成熟的紅細(xì)胞中的（）與氧氣的運(yùn)輸有關(guān)。A血紅蛋白B肌紅蛋白C肌動(dòng)蛋白D肌球蛋白BBBA第79頁，共91頁，2023年，2月20日，星期二5．血液由血漿和各種血細(xì)胞組成，其中（）的含量最多。A白細(xì)胞B血小板C紅細(xì)胞D淋巴細(xì)胞6．為防止血液凝固，在采血容器中要預(yù)先加入抗凝血?jiǎng)ǎ.NaClB.甲苯C.蒸餾水D.檸檬酸鈉7．將攪拌好的混合液轉(zhuǎn)移到離心管中，離心后，可以明顯看到試管中的溶液分為4層，其中第3層是（）A無色透明的甲苯層B脂溶性物質(zhì)的沉淀層C血紅蛋白的水溶液D其他雜質(zhì)的暗紅色沉淀物CDC第80頁，共91頁，2023年，2月20日，星期二1、隨著人類跨入蛋白質(zhì)組時(shí)代，對(duì)蛋白質(zhì)的研究和應(yīng)用越來越深入，首先要做的一步是A弄清各種蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)B弄清各種蛋白質(zhì)的功能C弄清各種蛋白質(zhì)的合成過程D獲得高純度的蛋白質(zhì)第81頁，共91頁，2023年，2月20日，星期二2、用凝膠色譜法分離蛋白質(zhì)的過程中，關(guān)于蛋白質(zhì)的敘述，正確的是A相對(duì)分子質(zhì)量較小的蛋白質(zhì)行程大于相對(duì)分子質(zhì)量較大的蛋白質(zhì)B相對(duì)分子質(zhì)量較小的蛋白質(zhì)行程小于相對(duì)分子質(zhì)量較大的蛋白質(zhì)C相對(duì)分子質(zhì)量較小的蛋白質(zhì)行程等于相對(duì)分子質(zhì)量較大的蛋白質(zhì)D二者根本無法比較第82頁，共91頁，2023年，2月20日，星期二3、使用SDS-聚丙烯酰胺電泳過程中，不同蛋白質(zhì)的電泳遷移率完全取決于A電荷的多少B分子的大小C肽鏈的多少D分子形狀的差異4、在采血容器中加入檸檬酸鈉的目的是A調(diào)節(jié)pHB維持紅細(xì)胞的能量供應(yīng)C防止微生物生長(zhǎng)D防止血液凝固第83頁，共91頁，2023年，2月20日，星期二6、記住樣品處理中的血紅蛋白溶液離心后分層順序自上而下是：有機(jī)溶劑脂類物質(zhì)血紅蛋白溶液紅細(xì)胞破碎物沉淀第84頁，共91頁，2023年，2月20日，星期二1.答:凝膠色譜法也稱為分配色譜法,它是根據(jù)分子量的大小分離蛋白質(zhì)的方法之一.所用的凝膠實(shí)際上是一些微小的多孔球體,這些小球體大多數(shù)是由多糖類化合物構(gòu)成,小球體內(nèi)部有許多貫穿的通道,當(dāng)一個(gè)含有各種分子的樣品溶液緩慢流經(jīng)時(shí),各分子在色譜柱內(nèi)進(jìn)行兩種不同的運(yùn)動(dòng),即垂直向下的運(yùn)動(dòng)和無規(guī)則的擴(kuò)散運(yùn)動(dòng).相對(duì)分子質(zhì)量較大的蛋白質(zhì)分子不能進(jìn)入凝膠顆粒內(nèi)部,只能分布在顆粒之間,通過的路程較短,移動(dòng)速度較快;相對(duì)分子質(zhì)量較小的蛋白質(zhì)分子比較容易進(jìn)入凝膠內(nèi)的通道,通過的路程較長(zhǎng),移動(dòng)速度較慢.因此,樣品中相對(duì)分子質(zhì)量較大的蛋白質(zhì)先流出,相對(duì)分子質(zhì)量中等的分子后流出,相對(duì)分子質(zhì)量最小的分子最后流出,這種現(xiàn)象又叫分子篩現(xiàn)象.1.凝膠色譜法分離蛋白質(zhì)的的原理是怎樣的?課后練習(xí)第85頁，共91頁，2023年，2月20日，星期二答:在一定范圍內(nèi),能對(duì)抗外來少量強(qiáng)酸,強(qiáng)堿或稍加稀釋不引起溶液pH發(fā)生明顯變化的作用叫做緩沖作用,具有緩沖作用的溶液叫做緩沖溶液.緩沖溶液通常是由一或兩種緩沖劑溶解于水中制得,調(diào)節(jié)緩沖劑的配比就可制得不同pH范圍的緩沖液.

緩沖溶液的作用維持反應(yīng)體系的pH不變.在生物體內(nèi)進(jìn)行的各種生物化學(xué)過程都是在精確的pH下進(jìn)行的,受到氫離子濃度的嚴(yán)格調(diào)控.為了在實(shí)驗(yàn)室條件下準(zhǔn)確地模擬生物體內(nèi)的天然環(huán)境,就必須保持體外生物化學(xué)反應(yīng)過程有與體內(nèi)過程完全相同的pH.

2.什么是緩沖溶液?它的作用是什么?第86頁，共91頁，2023年，2月20日，星期二原理：電泳是指帶電粒子在電場(chǎng)的作用下發(fā)生遷移的過程.許多重要的生物大分子,如氨基酸,多肽,蛋白質(zhì),核苷酸,核酸等都具有可解離基團(tuán),它們?cè)谀硞€(gè)特定的pH下會(huì)帶上正電或負(fù)電;在電場(chǎng)的作用下,這些帶電分子會(huì)向著與其所帶電荷相反的電極方向移動(dòng).作用：電泳技術(shù)就是在電場(chǎng)的作用下,利用待分離樣品中各種分子帶電性質(zhì)以及分子本身大小,形狀等性質(zhì)的差異,使帶電分子產(chǎn)生不同的遷移速度,從而達(dá)到對(duì)樣品進(jìn)行分離,鑒定或提純的目的.

3.電泳的作用及其原理是什么?第87頁，共91頁，2023年，2月20日，星期二答:血紅蛋白提取和分離的程序可分為四大步,包括:樣品處理,粗分離,純化和純度鑒定.首先通過洗滌紅細(xì)胞,血紅蛋白的釋放,離心等操作收集到血紅蛋白溶液,即樣品的處理;再經(jīng)過透析去除分子量較小的雜質(zhì),即樣品的粗分離;然后通過凝膠色譜法將相對(duì)分子質(zhì)量大的雜質(zhì)蛋白除去,即樣品的純化;最后經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行純度鑒定.

答:血紅蛋白是有色蛋白,因此在凝膠色譜分離時(shí)可以通過觀察顏色來判斷什么時(shí)候應(yīng)該收集洗脫液.這使血紅蛋白的分離過程非常直觀,大大簡(jiǎn)化了實(shí)驗(yàn)操作.

4.你能描述血紅蛋白分離的完整過程嗎?5.與其他真核細(xì)胞相比,紅細(xì)胞有什么特點(diǎn)?這一特點(diǎn)對(duì)你進(jìn)行蛋白質(zhì)的分離有什么意義?第88頁，共91頁，2023年，2月20日，星期二3、SDS—聚丙烯酰胺凝膠電泳：2.試劑的配制：鑒定血紅蛋白純度。1.目的：

①丙烯酰胺和N,N-亞甲基雙丙烯酰胺:

用去離子水配制29%（29g/100mL，下同）的丙烯酰胺和1%的N,N-亞甲基雙丙烯酰胺的貯存液。②十二烷基硫酸鈉（SDS）:

用去離子水配成10%的貯存液，于室溫保存。③用于制備分離膠和濃縮膠的Tris緩沖液。④TEMED：作用通過催化過硫酸銨形成自由基而加速丙烯酰胺與雙丙烯酰胺的聚合。⑤用去離子水配制10%過硫酸銨：作用是提供驅(qū)動(dòng)丙烯酰胺和雙丙烯酰胺聚合所必需的自