大黃素、黃芪多糖在體外對乙型肝炎病毒的抑制作用

1、大黃素、黃芪多糖在體外對乙型肝炎病毒的抑制作用                  作者：黨雙鎖張正國張欣宋平邊靜程延安 【摘要】  目的 體外觀察大黃素、黃芪多糖單用與聯(lián)合應(yīng)用抗HBV的作用。方法 以HepG2.2.15細(xì)胞為研究模型，選用干擾素、拉米夫定為陽性對照藥物，觀察培養(yǎng)液中加入不同濃度大黃素、黃芪多糖及兩藥聯(lián)合應(yīng)用抗HBV作用的效果。采用Taq man熒光定量PCR檢測細(xì)胞上清HBV DNA，ELISA檢測培養(yǎng)上清液

2、HBsAg、HBeAg水平的變化。采用MTT法觀察它們對細(xì)胞生長的影響。結(jié)果 大黃素的3個劑量組(12.5、25.0、50.0mg/L)和所觀察的時間點(3、6、9d)對HBV DNA、HBsAg、HBeAg表現(xiàn)出劑量與時間依賴的抑制作用(P0.05)。大黃素對HBV DNA抑制的半數(shù)抑制濃度為21mg/L，對HepG2.2.15細(xì)胞半數(shù)細(xì)胞毒性濃度為40.66mg/L，治療指數(shù)為1.94。同時發(fā)現(xiàn)黃芪多糖各劑量組對HBV無明顯的抑制作用(P0.05)。大黃素、黃芪多糖聯(lián)合應(yīng)用在療效方面無明顯的交互作用(P0.05)。結(jié)論 大黃素在體外對HBV具有一定的抑制作用，黃芪多糖無明顯抑制HBV的作用

3、，兩藥聯(lián)用無明顯協(xié)同抗HBV的作用。 【關(guān)鍵詞】  大黃素；黃芪多糖；乙型肝炎病毒；細(xì)胞培養(yǎng)Inhibition on hepatitis B virus by emodinand astragalus polysaccharides in vitroABSTRACT: Objective  To investigate the effects of emodin, astragalus polysaccharides (APS) on hepatitis B virus (HBV) in vitro. Methods  Human hepatoma G2.2.1

4、5 cell line stably expressed hepatitis B virus particles in culture. The cells were exposed to different concentrations of emodin, APS, interferon , and lamivudin, respectively. Realtime PCR was applied to quantify extracellular HBV DNA and ELISA was applied to assess HBsAg and HBeAg. MTT assay was

5、used to evaluate the cytotoxicity of drugs. Results  The results showed that exposure of HepG2.2.15 cells to emodin resulted in a time and concentrationdependent inhibition of HBV DNA replication and HBsAg, HBeAg secretion (P0.05). IC50 to HBV DNA was 21mg/L, CC50 to HepG2.2.15 cells was 40.66m

6、g/L, and the treatment index (TI) was 1.94. APS could not restrain HBV DNA, HBsAg and HBeAg obviously in vitro (P0.05). The interaction was not significant between emodin and APS (P0.05). Conclusion  Emodin had time and concentrationdependent inhibitory effects to HBV in vitro in some extent; A

7、PS could not inhibit HBV obviously in vitro; Coadministration of emodin and APS had not significant interaction in restraining HBV in vitro.KEY WORDS: emodin; astragalus polysaccharides; hepatitis B virus; cell culture病毒性乙型肝炎的治療關(guān)鍵是抗病毒治療。中藥在肝病治療中起著很重要的作用。大黃和黃芪是治療乙肝復(fù)方中最常用到的兩味中藥。近年來，研究證明它們對乙型肝炎病毒(hepat

8、itis B virus, HBV)有一定的治療作用。大黃素(emodin)是中藥大黃的主要有效單體，黃芪多糖(astragalus polysaccharides, APS)是黃芪的主要有效成分。本研究以HepG2.2.15細(xì)胞為體外HBV復(fù)制模型，初步觀察大黃素、黃芪多糖單獨及聯(lián)合應(yīng)用對HBV的抑制作用。1  材料與方法1.1  藥物  大黃素(純度950g/L購自西安崇信天然添加劑有限公司，由國家中藥鑒定所鑒定，批文號：25100806)，黃芪多糖(純度為600g/L，西安鴻生生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)，國家中藥鑒定所鑒定，批號：040618)，干擾素(購自羅氏公

9、司，批號：010801I)，拉米夫定(3TC)0.1mmol/L的母液，由西安交通大學(xué)藥學(xué)院提供。1.2  試劑及主要儀器  噻唑藍(lán)(MTT，Sigma)，二甲基亞砜(DMSO, Sigma)，HBsAg和HBeAg的ELESA檢測試劑盒(上海華泰生物工程公司)，HBV DNA提取及擴增熒光檢測試劑盒(廣州中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司)，和PE7700型自動熒光PCR儀(美國Perkin Elmer公司)。1.3  細(xì)胞  HepG2.2.15細(xì)胞由第四軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院全軍感染病診療中心惠贈，可穩(wěn)定表達(dá)乙肝病毒蛋白并分泌病毒顆粒。培養(yǎng)液為DMEM(Gib

10、co)，含200mL/L胎牛血清(杭州四季青生物材料公司)、0.3g/L谷氨酰胺(Gibco)，1×105u/L青鏈霉素(華北制藥廠)，碳酸氫鈉調(diào)整pH值到7.2。消化細(xì)胞用2.5g/L胰蛋白酶(Gibco)。1.4  細(xì)胞培養(yǎng)  2.5g/L胰蛋白酶消化細(xì)胞，以1×104個/孔接種于96孔板，每孔200L，于37、50mL/L CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h，待細(xì)胞貼壁后，換培養(yǎng)液進(jìn)行實驗。1.5  實驗分組  實驗共分3大組，17個劑量組，分組陽性對照組分別為干擾素(INF)、拉米夫定，各設(shè)3個劑量組(125000、250000、5000

11、00u/L INF ；0.025、0.05、0.1mol/L 3TC)；實驗組為3個組，即大黃素組(12.5、25.0、50.0mg/L)，黃芪多糖組(120、240、480g/L)，聯(lián)合用藥組(25.0mg/L大黃素120g/L黃芪多糖，50.0mg/L大黃素120g/L黃芪多糖，25.0mg/L大黃素240g/L黃芪多糖，50.0mg/L大黃素240g/L黃芪多糖)；陰性對照組即生理鹽水組，用等體積生理鹽水加入。實驗中除陰性對照組設(shè)10個復(fù)孔外，其余每個劑量組設(shè)5個復(fù)孔，用含藥物培養(yǎng)液進(jìn)行干預(yù)培養(yǎng)。每3d換同樣濃度含藥培養(yǎng)液及對照培養(yǎng)液1次。各孔在3、6、9d時，將吸去的上清液置于-20冰

12、箱保存待檢。1.6  MTT實驗  加藥第9天吸去上清，每孔加5g/L的MTT 20L，37培養(yǎng)4h，棄上清后，每孔加入150L DMSO，震蕩10min，測定570nm吸光度。按下列公式計算細(xì)胞的抑制百分率。細(xì)胞抑制百分率=陰性對照組平均A值-實驗組平均A值陰性對照組平均A值×100%按下列公式計算藥物的半數(shù)細(xì)胞毒性濃度(CC50)。CC50= lg-1B+0.5-50%抑制百分率50%抑制百分率-50%抑制百分率×C   (B=lg50%藥物濃度，C=lg2)1.7  熒光定量PCR法檢測細(xì)胞外HBV DNA1 

13、;  按照達(dá)安基因股份有限公司HBV核酸提取與核酸擴增熒光檢測試劑盒說明書操作。兩引物序列分別為P15ATCCTGCTGCTATGCCTCATCTT3，P25ACAGTGGGGGAAAGCCCTACGAA3，熒光探針序列為5TGGCTAGTTTACTAGTGCCATTTG3。各反應(yīng)管放入PE7700自動熒光PCR儀，按下列條件擴增：93 2min預(yù)變性，然后93 45s到55 1min循環(huán)擴增10個循環(huán)，再按93 30s到55 45s循環(huán)擴增，共30個循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后由計算機自動分析出HBV DNA定量結(jié)果。按照下面公式計算藥物對HBV DNA的抑制率。   HB

14、V DNA抑制率=陰性對照組HBV DNA拷貝數(shù)-實驗組HBV DNA拷貝數(shù)陰性對照組HBV DNA拷貝數(shù)×100%   按下列公式計算藥物的半數(shù)抑制濃度(IC50)。  IC50=lg-1B+0.5-50%抑制百分率50%抑制百分率-50%抑制百分率×C   (B= lg 50%藥物濃度，C=lg 稀釋倍數(shù)的倒數(shù))   治療指數(shù)(TI)= CC50/IC50。1.8  HBsAg和HBeAg的測定  使用雙抗體加心ELESA法1。根據(jù)試劑盒說明測定培養(yǎng)上清液的HBsAg和HBeAg，

15、記錄P/N值，按照下面公式計算藥物對HBV DNA的抑制率。HBsAg(HBeAg)抑制率=對照組P/N值-藥物組P/N值對照組P/N值-2.1×100%1.9  統(tǒng)計學(xué)處理  計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，應(yīng)用SPSS11.0軟件進(jìn)行方差分析檢驗，StudentNewmanKeuls進(jìn)行不同組之間的兩兩比較。采用析因分析觀察兩種藥物的交互作用，檢驗水準(zhǔn)=0.05。         2  結(jié)果2.1  細(xì)胞毒性的測定  用藥第9天，MTT實驗結(jié)果顯

16、示12.5mg/L大黃素?zé)o明顯毒性作用，25.0、50.0mg/L大黃素對細(xì)胞生長抑制率分別為29.6%、58.67%，計算其CC50為40.66mg/L。黃芪多糖各組與陰性對照組比較均未見到抑制細(xì)胞生長的作用(P0.05)。大黃素與黃芪多糖聯(lián)用無明顯增加細(xì)胞毒性的協(xié)同作用(P0.05)。各濃度拉米夫丁與較低濃度干擾素也無明顯細(xì)胞毒性作用，僅500000u/L干擾素組抑制率達(dá)到48.1%，有統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05)。2.2  藥物對HepG2.2.15細(xì)胞培養(yǎng)上清的HBV DNA的抑制作用  藥物作用第3天，大黃素25、50mg/L組平均HBV DNA的抑制率分別僅9.69

17、%和35.59%，12.5mg/L組與陰性對照組間無明顯差異(P0.05)。作用第6天大黃素的抑制作用逐漸增強。作用至第9天，12.5、25、50mg/L大黃素平均HBV DNA的抑制率已經(jīng)分別達(dá)到了21.21%、54.33%和68.65%，與陰性對照組相比，均表現(xiàn)出抑制HBV病毒核酸復(fù)制的作用(表1)。方差分析表明，大黃素對HBV DNA的抑制效果隨作用時間延長而增強(P0.001)，隨劑量加大也逐漸增強(P0.001)，呈明顯的作用時間依賴性和劑量依賴性。根據(jù)公式計算，大黃素IC50為0.21mg/L，治療指數(shù)(TI)為1.94。   黃芪多糖不同質(zhì)量濃度、不同作用時間

18、均與陰性對照組HBV DNA無明顯差異(P0.05)。析因分析表明，黃芪多糖與大黃素兩種藥物聯(lián)用，對HepG2.2.15細(xì)胞HBV DNA復(fù)制的抑制沒有明顯協(xié)同作用(P=0.607)。   干擾素在體外對HepG2.2.15細(xì)胞HBV DNA復(fù)制也具有一定的作用，其IC50為499000u/L。拉米夫定表現(xiàn)出了很好的抗HBV DNA的復(fù)制作用，0.1mol/L 3TC作用9d平均HBV DNA的抑制率達(dá)到70.93%，計算拉米夫定對細(xì)胞HBV DNA的復(fù)制的IC50為0.06mol/L(表1)。表1  實驗藥物對HBV DNA體外復(fù)制的抑制作用（略）Table 1

19、  Inhibitory effect of drug from HepG2.2.15 culture medium on hepatitis B virus replicationP0.05 vs. negative control2.3  大黃素對細(xì)胞分泌HBsAg、HBeAg的抑制作用  見表2。各質(zhì)量濃度組大黃素隨作用時間延長，抑制作用逐漸增強，治療第9天達(dá)最高，與陰性對照組有明顯差異(P0.05)，而且高濃度大黃素作用更強(P0.05)。黃芪多糖未見明顯抑制乙型肝炎病毒抗原的分泌作用。大黃素、黃芪多糖聯(lián)用對HepG2.2.15細(xì)胞分泌HBsAg、HBeA

20、g不具有協(xié)同抑制作用(P=0.095)。干擾素對HBsAg、HBeAg分泌有較弱的抑制作用。拉米夫定對2.2.15細(xì)胞分泌HBsAg無明顯的抑制作用。表2  實驗藥物體外對HBsAg(HBeAg)分泌的抑制作用（略）Table 2  Inhibitory effect of drug from HepG2.2.15 culture medium on HBsAg and HBeAg secretionP0.05 vs. negative control3  討論   HepG2.2.15細(xì)胞株是由含兩個頭尾相連的adw型HBV全基因質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人肝

21、腫瘤細(xì)胞株構(gòu)建而成，體外培養(yǎng)能持續(xù)較高水平表達(dá)HBsAg、HBeAg和有生物活性的病毒顆粒，目前，已成為公認(rèn)的體外抗乙肝藥物研究的主要工具。本實驗選擇HepG2.2.15細(xì)胞株作為體外HBV復(fù)制模型，初步觀察大黃素、黃芪多糖抗HBV的作用。   中藥大黃味苦寒，有瀉實熱、破積、解毒、消瘀的功效。研究證實大黃對多種細(xì)菌、病毒、螺旋體、支原體和原蟲等病原微生物都有一定的抑制作用。大黃素是大黃的主要成分，已證實對人單純皰疹病毒(型和型)、副流感病毒、牛痘病毒、柯薩基B組病毒等多種病毒具有抑制作用。本研究發(fā)現(xiàn)，大黃素在體外對于HBV的DNA復(fù)制、HBsAg和HBeAg的分泌均具有一

22、定抑制作用。這種抑制在本實驗所觀察劑量范圍內(nèi)表現(xiàn)為劑量與時間依賴性抑制作用。上述實驗結(jié)果提示大黃素可能除直接作用于HBV核酸水平外，也很可能干擾了HBV蛋白質(zhì)合成及后加工等過程而發(fā)揮抗HBV的作用。這與氧化苦參堿的抗HBV結(jié)果相似，推測大黃素與其他中藥一樣，從多靶點、多環(huán)節(jié)發(fā)揮作用。大黃素為脂溶性藥物，易于穿過細(xì)胞膜對細(xì)胞產(chǎn)生影響。我們推測大黃素應(yīng)用于臨床后不僅可能對血液、體液的病毒有抑制作用，而且由于其易進(jìn)入肝細(xì)胞內(nèi)，所以對肝內(nèi)的病毒也可能具有較好的抑制效果。大黃素對HBV DNA的抑制IC50為21mg/L，對HepG2.2.15細(xì)胞CC50為40.66mg/L，計算治療指數(shù)(TI)為1.

23、94。我們將對其安全性做進(jìn)一步的研究。   黃芪多糖是中藥黃芪的主要有效成分，具有增強免疫、抗損傷等多種生物活性56。本實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，黃芪多糖在體外對HepG2.2.15細(xì)胞株的乙型肝炎病毒HBV DNA復(fù)制、HBsAg和HBeAg表達(dá)均無明顯抑制作用，且與大黃素聯(lián)合應(yīng)用對HBV的抑制無明顯的增強作用。分析其原因可能是黃芪多糖的作用效果主要通過在體內(nèi)調(diào)節(jié)人體免疫、減輕肝損傷而發(fā)揮作用。因而，在體外單一細(xì)胞培養(yǎng)中未能發(fā)揮其作用。實驗對照的陽性藥物干擾素和拉米夫定對HepG2.2.15細(xì)胞HBV的抑制作用與其他報道相近。   本研究為中藥有效成分抗HBV提供了實驗資料。但是，也應(yīng)注意體外研究的HBV是整合在HepG2細(xì)胞染色體上，復(fù)制方式與自然感染不同，不能被清除；而且細(xì)胞孤立于體外，脫離了體內(nèi)免疫系統(tǒng)等對HBV的影響，與活體內(nèi)情況不完全一致。因此，應(yīng)該充分認(rèn)識到本實驗結(jié)果的局限性，進(jìn)一步行體內(nèi)實驗，更深入地探討大黃素、黃芪多糖抑制HBV的機制。【參考文獻(xiàn)】