食管癌組織微環(huán)境對樹突狀細(xì)胞的影響

1、食管癌組織微環(huán)境對樹突狀細(xì)胞的影響         11-01-30 11:00:00     編輯：studa20             作者：路靜, 劉康棟, 趙明耀, 楊洪艷, 黃幼田, 秦珍珠, 白睿華, 董子明【摘要】  目的: 探討食管癌組織勻漿上清液體外模擬腫瘤微環(huán)境對人樹突狀細(xì)胞（DC）分化發(fā)育的影響, 揭示腫瘤免疫逃逸機制, 為

2、DC疫苗的應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。方法: 制備新鮮食管癌及癌旁組織勻漿上清液, ELISA檢測其VEGFA含量。密度梯度離心法分離人外周血單個核細(xì)胞, 含rhGMCSF和rhIL4 RPMI1640培養(yǎng)液誘導(dǎo)DC, 第2天在繼續(xù)誘導(dǎo)DC基礎(chǔ)上設(shè)食管癌勻漿上清組、 癌旁勻漿上清組、 VEGFA組, 均隔天半量換液, 第4天加入食管癌細(xì)胞株EC9706抗原, 第6天加入脂多糖, 第8天收集各組細(xì)胞。觀察DC形態(tài), 流式細(xì)胞術(shù)(FCM)檢測免疫表型, RTPCR檢測CD1a表達(dá), CCK8檢測T細(xì)胞增殖率及殺傷率。結(jié)果: 食管癌組織勻漿上清VEGFA含量(0.987±0.319) g/L明顯高于

3、癌旁(0.152±0.105) g/L, P<0.05; 食管癌勻漿上清組細(xì)胞形態(tài)明顯受到抑制, CD86分子陽性率（%）與正常DC相比由69±8降為42±11、 CD1a由56±12降為27±12、 CD11c由21±13降為18±13（P<0.01）, CD1a基因幾乎無表達(dá), 刺激T細(xì)胞增殖率（%）由112.5±7.2降為70.2±3.5（P<0.01）, 殺傷率（%）由62.4±0.6 降為46.8±1.6（P<0.01）; 癌旁勻漿上清液組、 VEGF

4、A組結(jié)果與正常DC組無統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)論: 食管癌組織勻漿上清液所模擬的微環(huán)境對DC的誘導(dǎo)分化及其功能有明顯的抑制作用, 在該抑制作用中VEGFA并不起主要作用。 【關(guān)鍵詞】  食管腫瘤; 樹突狀細(xì)胞; 勻漿上清; 混合淋巴細(xì)胞反應(yīng); 細(xì)胞毒性T細(xì)胞    我國是食管癌高發(fā)區(qū), 食管癌死亡率僅次于胃癌居第2位, 食管癌的發(fā)生以及防治成為研究的熱點。樹突狀細(xì)胞（dendritic cell,  DC）是專職抗原提呈細(xì)胞, 對于免疫反應(yīng)的啟動、 進(jìn)展以及免疫耐受的誘導(dǎo)起至關(guān)重要的作用1, 2。然而在大多數(shù)腫瘤患者中, 往往并不能產(chǎn)生DC介導(dǎo)的有效抗原

5、提呈3。本研究小組及國內(nèi)外其他學(xué)者應(yīng)用體外大量擴(kuò)增DC, 然后用腫瘤抗原沖擊后回輸患者治療腫瘤, 取得一定效果4-6。研究腫瘤微環(huán)境下DC的功能, 可更好地反映宿主的抗瘤免疫狀態(tài), 了解其免疫逃逸機制。我們在體外以食管癌組織勻漿上清液模擬腫瘤微環(huán)境, 探討其對DC形態(tài)、 表型及功能的影響及VEGFA在其中的作用, 為研究DC介導(dǎo)的腫瘤免疫治療在食管癌患者中應(yīng)用提供一定的理論基礎(chǔ)。    1  材料和方法    1.1  材料  重組人白細(xì)胞介素4(rhIL4)、 重組人白介素2（rhIL2）購自Pepro

6、tech公司; 重組人粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子（rhGMCSF）購自廈門特寶生物公司; 淋巴細(xì)胞分離液（Ficoll400, 1 077 g/L）和胰蛋白酶購自天津TBD公司; 完全培養(yǎng)基包括: RPMI1640購自美國Gibco公司, 人血清來自健康捐獻(xiàn)者自體血清, 青鏈霉素各10萬U/L; FITC標(biāo)記的CD1a、 CD86、 CD11c、 CD80、 CD83及HLADR單克隆抗體（mAb）購自美國BD公司; RTPCR試劑盒購自TaKaRa公司; TRIzol 購自美國Invitrogen公司; 活細(xì)胞計數(shù)試劑盒CCK8(cell counting kit8)購自日本同仁化學(xué)研究所;

7、 人VEGFA ELISA試劑盒購自Bender MedSystems公司。人食管癌細(xì)胞株EC9706由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤研究所分子腫瘤學(xué)國家重點實驗室饋贈; 外周血來自健康成人獻(xiàn)血者, 晨起空腹抽取肘靜脈血。    1.2  方法    1.2.1  食管癌標(biāo)本采集及勻漿制備  取術(shù)前無化療、 放療史患者手術(shù)切除的食管癌組織及距離癌組織5 cm以外的癌旁組織各15例, 病理組織類型均為鱗癌, 無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。標(biāo)本存放于液氮罐, 用于腫瘤組織勻漿制備。將食管癌及癌旁組織從液氮罐取出, 緩慢復(fù)溫。稱取癌及癌旁

8、組織各200 mg, 浸于青霉素、 鏈霉素(濃度均為50萬U/L)的生理鹽水中20 min, 加入1  mL生理鹽水, 調(diào)整勻漿濃度為200 g/L, 用組織勻漿研磨器緩慢進(jìn)行組織研磨, 4 000  r/min, 30 min, 離心2次, 棄去下層沉淀, 留取上清液備用, 保存于-20冰箱。    1.2.2  雙抗體夾心ELISA法檢測食管癌及癌旁組織勻漿上清液VEGFA蛋白水平  按人VEGFA ELISA試劑盒說明書要求進(jìn)行具體操作。VEGFA標(biāo)準(zhǔn)品依次倍比稀釋并設(shè)復(fù)孔, 每份癌及癌旁勻漿上清均設(shè)1復(fù)孔對照。應(yīng)用S

9、UNRISE酶標(biāo)儀在波長450 nm條件下, 測各孔吸光度, 取平均吸光度為該樣品的吸光度(A)值。根據(jù)VEGFA標(biāo)準(zhǔn)品濃度與吸光度的線性回歸關(guān)系, 繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線, 由A值計算出每份勻漿上清中VEGFA的濃度。    1.2.3  食管癌EC9706全細(xì)胞抗原的制備  常規(guī)培養(yǎng)并收集EC9706細(xì)胞, PBS洗2遍, 調(diào)密度為1×1010/L的細(xì)胞懸液, 置入EP管中, 超聲破碎法制備抗原: 時間3 min, 脈沖4 s, 振幅1。13 000 r/min, 30 min,  4離心收集上清液, 過濾, 按照Bradfor

10、d蛋白質(zhì)定量法制作標(biāo)準(zhǔn)曲線, 測定抗原濃度。-20凍存?zhèn)溆谩?#160;   1.2.4  人外周血T淋巴細(xì)胞的分離及DC的誘導(dǎo)  方法參照文獻(xiàn)7, 稍作修改: 抽取健康成人新鮮外周血50 mL、 肝素抗凝、 生理鹽水稀釋后,  與淋巴細(xì)胞分離液以21的比例緩慢加入離心管, 1 500 r/min, 25 min離心后, 毛細(xì)吸管輕輕吸取白膜層, 生理鹽水洗滌3次(1 300  r/min, 8 min), 獲得人外周血單個核細(xì)胞(peripheral blood mononuclearcell, PBMC)。以含100 mL/L自體

11、血清RPMI1640調(diào)密度為2×109/L種于24孔板, 37貼壁3 h, 收集懸浮細(xì)胞, 尼龍毛柱法純化后獲得T淋巴細(xì)胞, 種于50 mL培養(yǎng)瓶中, 含rhIL2因子的RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng), 備用。去除懸浮細(xì)胞后的貼壁細(xì)胞用含rhGMCSF 100 g/L, rhIL4  5 g/L及100 mL/L自體血清RPMI1640培養(yǎng)液誘導(dǎo)培養(yǎng)DC。第2天實驗組在上述誘導(dǎo)DC的基礎(chǔ)上分組分別添加食管癌勻漿上清200 mL/L、 癌旁勻漿上清200 mL/L、 VEGFA 10  g/L。隔天半量換液。第4天各組加入EC9706抗原, 第6天加入脂多糖5 

12、; g/L, 第8天收集細(xì)胞,  進(jìn)行形態(tài)觀察, 免疫表型分析, RTPCR以及混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)（mixed lymphocyte reaction,  MLR）和體外殺傷反應(yīng)。    1.2.5  FCM檢測細(xì)胞免疫學(xué)表型  分別于培養(yǎng)0 d (PBMC貼壁3 h去除懸浮細(xì)胞后)、 8 d, 收集細(xì)胞PBS洗2遍。10 g/L多聚甲醛固定5 min, PBS洗1遍。用PBS調(diào)細(xì)胞密度為1×109/L, 按20 L/106個細(xì)胞加入熒光標(biāo)記的mAb（0 d細(xì)胞檢測CD1a、 CD86、 CD11c、 CD80、 C

13、D83及HLADR; 8 d細(xì)胞檢測CD86、 CD11c及CD1a）4冰箱避光孵育30 min后加入PBS 1 mL,  吹打均勻, 1 000 r/min, 離心5 min, 棄去未結(jié)合的多余抗體。每管加入1 mL PBS重懸, 2 h內(nèi)上機檢測。    1.2.6  RTPCR  各誘導(dǎo)組細(xì)胞總mRNA的提取: 棄掉培養(yǎng)液, 用PBS洗2遍, 在24孔板里加入TRIzol 1 mL, 吹打均勻（呈黏稠狀）, 室溫靜置5 min。轉(zhuǎn)入無RNA酶的EP管中, 加225  L氯仿, 蓋帽, 劇烈振蕩1530 s, 室溫靜置3

14、 min, 4, 14 000 r/min, 離心15 min。吸取上清移至新EP管, 加異丙醇0.5 mL, 充分混勻, 4, 12 000 r/min, 離心10 min。棄上清, 加DEPC水配制750 mL/L乙醇1 mL, 振蕩洗滌沉淀, 4, 7 500 r/min, 離心5 min。得到mRNA, 按照一步法RTPCR試劑盒說明書操作, 獲得目的基因DNA片段。CD1a引物: (5primer): 5GCTGCACTCTGGAAAGGTCT3(3primer):  5CCAAAGCGCAAGACCTATCA3(擴(kuò)增片段長度為601 bp);   GA

15、PDH基因作為內(nèi)參照(5primer): 5AAGGTCGGAGTCAACGGATTTG3,  (3primer):  5CTTGACAAAGTGGTCGTTGAGG3（擴(kuò)增片段長度為915 bp）。    1.2.7  CCK8檢測致敏DC誘導(dǎo)MLR及特異性CTL對EC9706細(xì)胞殺傷效應(yīng)  （1）致敏DC的獲取: DC培養(yǎng)第4天, 各組加入終濃度為100 mg/L EC9706細(xì)胞抗原, 第8天收集DC,  即為負(fù)載EC9706抗原的DC。（2）MLR: 各組負(fù)載EC9706抗原的致敏DC為刺激細(xì)胞, 同種自體

16、T細(xì)胞為反應(yīng)細(xì)胞, 兩者按120比例混合, 以1×104個/孔種于96孔板, 分為對照組（靜止T細(xì)胞）; DC組（正常DC+T細(xì)胞）; 食管癌勻漿上清組（食管癌勻漿上清誘導(dǎo)DC+T細(xì)胞）; 癌旁勻漿上清組（癌旁勻漿上清誘導(dǎo)DC+T細(xì)胞）; VEGFA組（VEGFA誘導(dǎo)DC+T細(xì)胞）。每組設(shè)6個復(fù)孔, 混合培養(yǎng)72 h, CCK8試劑盒檢測T細(xì)胞增殖率。（3）致敏DC誘導(dǎo)特異性CTL的產(chǎn)生: 同種自體T細(xì)胞與各組致敏的DC按201比例混合培養(yǎng)72 h, 激活為CTL。（4）細(xì)胞毒性實驗: 將各組CTL和靜止T細(xì)胞, 按效應(yīng)細(xì)胞EC9706為301比例混合, 分為靶細(xì)胞對照組（EC970

17、6）; 效應(yīng)對照組（靜止T細(xì)胞+ EC9706）; DC組（DC誘導(dǎo)的CTL+ EC9706）; D組: 食管癌勻漿上清組（食管癌勻漿上清組DC誘導(dǎo)的CTL+ EC9706）; 癌旁勻漿上清組（癌旁勻漿上清組DC誘導(dǎo)的CTL+ EC9706）; VEGFA組（VEGFA組DC誘導(dǎo)的CTL+ EC9706）。設(shè)每組6個復(fù)孔, 1×104個/孔細(xì)胞懸液200 L種于96孔板, 培養(yǎng)72 h, CCK8法檢測對EC9706細(xì)胞殺傷率。（5）CCK8檢測: 加入10 L/孔的CCK8試劑, 培養(yǎng)2 h, 于酶標(biāo)儀450 nm處測各組A值, 計算T細(xì)胞增殖率和殺傷率。其計算公式如下: T細(xì)胞增殖率=實驗組A值/靜止T細(xì)胞組A值×100; 細(xì)胞殺傷率=（效應(yīng)對照組A值-實驗組A值)/靶細(xì)胞對照組A值×100。    1.2.8  統(tǒng)計學(xué)分析  采用SPSS12.0統(tǒng)計軟件, 進(jìn)行兩組OneWay